Стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов и способ его использования

Стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гепопоэтических факторов и способ его использования

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов. Согласно изобретению стимулятором эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов является глутатион окисленный, представляющий собой димер глутатиона восстановленного, со структурой гамма-глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками. Согласно изобретению фармакологическое средство, предлагаемое для лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, содержит в качестве действующего вещества эффективное количество глутатиона окисленного. При этом целесообразно, чтобы лекарственная форма данного фармакологического средства представляла инъекционный раствор глутатиона окисленного, в фармацевтически приемлемом растворителе в концентрации 0,01 - 2,0 %. Согласно изобретению для усиления и продления лечебного эффекта фармакологического средства целесообразно, чтобы инъекционный раствор дополнительно содержал фармацевтически приемлемый компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, например перекись водорода в концентрации 0,003 %. Согласно изобретению способ лечения заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, включает парентеральное введение фармакологического средства в виде инъекционной лекарственной формы в дозах 0,01 - 0,5 мг на кг массы тела, от одной и более инъекций в день, курсами длительностью один и более дней или непрерывно до момента достижения лечебного эффекта. 2 с. и 5 з. п. ф-лы, 21 табл., 4 ил.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии и терапии, и может быть использовано для профилактики и лечения онкологических, инфекционных и других заболеваний, при которых стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов целесообразна по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Известно, что ряд гуморальных факторов, эндогенно вырабатываемых в организме млекопитающих, цитокинов и гемопоэтических факторов обладают высокой биологической активностью и способны оказывать существенный лечебный эффект при разнообразных заболеваниях у человека. Известно также о лечебном применении цитокинов и гемопоэтических факторов в экспериментальной и клинической медицине. Так в онкологической практике широко изучается применение интерлейкина 2 (IL-2), фактора некроза опухолей а (TNFa), гемопоэтических факторов (эритропоэтина, макрофагально-гранулоцитарного и гранулоцитарного колониестимулирующих факторов, GM-CSF и G-CSF). Не менее интенсивно применяют цитокины и гемопоэтические факторы в экспериментальной и клинической практике инфекционных заболеваний, например интерфероны (IFNg и IFNa), колоние-стимулирующие факторы и др. Колоние-стимулирующие факторы и эритропоэтин активно применяются в гематологии.

Следует отметить, что лечебное применение этих веществ, вводимых экзогенно, имеет ограничения, связанные с отсутствием приемлемых лекарственных форм или их высокой стоимостью, коротким сроком жизни веществ данного класса в биологических средах, трудностями в подборе доз, а также разнообразными токсическими и аллергическими эффектами.

В этой связи, с точки зрения достижения более стабильного и значимого лечебного эффекта, не сопровождающегося побочными явлениями, более предпочтительной является стимуляция эндогенной продукции аутологичных цитокинов и гемопоэтических факторов непосредственно в организме пациента. Лечебный эффект, достигаемый при подобной стимуляции естественного для организма процесса, лишен всех недостатков, связанных с экзогенным введением цитокинов и гемопоэтических факторов.

Известен ряд соединений, стимулирующих эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов в экспериментальных и клинических условиях, в том числе известно о применении микробных продуктов для лечения рака, что связано со стимуляцией эндогенной продукции фактора некроза опухолей. Продукты, способные взывать одновременную продукцию различных цитокинов и гемопоэтических факторов, получили название мульти-цитокиновых индукторов (Multi-cytokine inducer). К средствам подобного действия относят препарат убитых стрептококков, нокардий (Nocardia opaca) и другие бактериальные продукты.

Однако практически все вещества, обладающие подобной способностью, это или убитые микроорганизмы, или микробные продукты, или соединения с неустановленной или переменной структурой, что существенно ограничивает возможности их медицинского применения в лечебных целях, а в ряде случаев делает такое применение невозможным. Таким образом, до настоящего времени не известен приемлемый с точки зрения современной медицины и фармакологии стимулятор эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.

В поисках медицински и фармакологически приемлемого стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов были проведены исследования, в ходе которых было обнаружено новое свойство известного ранее вещества окисленного глутатиона (глутатион окисленный, глутатион дисульфид, GSSG; далее GSSG), вводимого парентерально или действующего на изолированные клетки, стимулировать продукцию ряда цитокинов и гемопоэтических факторов и у млекопитающих (экспериментальных животных и людей) как в нормальных, так и в патологических условиях.

Окисленный глутатион (глутатион окисленный, глутатион дисульфид, GSSG; далее GSSG) известен как димер трипептида глутатиона, -глутамилцистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками. Таким образом, как трипептид глутатион (глутатион, глутатион восстановленный, GSH; далее GSH), так и его димер - GSSG являются природными метаболитами и присутствуют в тканях и биологических жидкостях людей и животных. При этом, как в норме, так и в патологических условиях естественный уровень GSSG в крови и тканях организма недостаточен для стимуляции эндогенной продукции цитокинов.

Известны свойства GSH, как одного из важнейших участников метаболизма аминокислот и фактора обеспечения внутриклеточного гомеостаза. При этом большое значение имеют восстановительные свойства GSH и его функция донора восстановительных эквивалентов, которую молекула GSH способна выполнять благодаря наличию сульфгидрильной группы цистеинового остатка. Этим качеством GSH определяется и его роль как принципиального элемента одной из важнейших внутриклеточных антиоксидантных систем, включающей собственно GSH и два фермента его обратимого превращения в GSSG: глутатион пероксидазу и глутатион редуктазу. Постоянное функционирование данной системы необходимо для инактивации или восстановления как эндогенно образующихся оксидантов, так и активных метаболитов веществ, попадающих в организм извне.

Известно также участие GSH в обеспечении реакций детоксикации, протекающих с участием группы ферментов, объединяемых названием глутатион S-трансферазы. Данные ферменты способны коньюгировать молекулу GSH с самыми разнообразными ксенобиотиками, формируя связь между ними и глутатионом через тиоловую группу цистеинового остатка трипептида. Последующая деградация коньюгата осуществляется ферментами гамма-глутамильного цикла и может иметь значительные вариации, зависящие от природы ксенобиотика.

В естественных условиях накопления GSSG в количествах, достаточных для стимуляции продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, не происходит в силу постоянного восстановления GSSG в GSH. Восстановление GSSG в GSH, активно протекающее в кишечнике и печени, происходит также при введении GSSG через пищеварительный тракт, где кроме того GSSG как всякий продукт, состоящий из аминокислот, подвергается протеолитической деградации.

Известно о применении GSSG в качестве одного из компонентов пищевой добавки для усиленного питания больных. Однако при пероральном применении основная масса GSSG как вещества, имеющего пептидную природу, деградирует в пищеварительном тракте, а оставшаяся часть восстанавливается в клетках кишечника и печени до GSH и не поступает в общую циркуляцию. Таким образом, поступление GSSG в организм через пищеварительный тракт исключает возможность проявления его активности в качестве стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов.

Известно, что повышение эндогенного уровня GSH в лечебных целях предлагается для стимуляции иммунитета, при лечении интоксикаций, отравлений, диабета, сердечно-сосудистых, инфекционных, а также других заболеваний.

Известно также использование экзогенного GSH или его прямых (g-глутамил-цистеин, n-ацетил-цистеин, n-ацетил-цистеинилглицин) или непрямых (2-оксотиазолидин-4-карбоксилат) биохимических предшественников, а также их солей и эфиров в качестве лекарственных средств или пищевых добавок при лечении различных заболеваний. Путем применения подобных веществ и их композиций предлагается повышать эндогенный уровень GSH для лечения различных заболеваний и интоксикаций.

Известно также о применении GSH как хемопротекторного агента в целях профилактики нейротоксичности при химиотерапии рака, а также о комбинации GSH с противоопухолевыми препаратами для повышения эффективности их действия.

В то же время, по данным общедоступных источников информации, в настоящее время неизвестно о применении GSSG как самостоятельного фармацевтического средства (в виде моновещества), в качестве стимулятора эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, а также о его лечебных эффектах при заболеваниях человека и животных или о применении GSSG в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний.

В основу изобретения положена задача создания фармакологического средства, содержащего такое действующее вещество, которое обеспечивает стимуляцию эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов у субъекта, нуждающегося в этом.

"Субъект, нуждающийся в этом" означает млекопитающее, например человек, домашние животные и скот, имеющие одно или более проявление заболеваний, при которых стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов целесообразна с позиций современных биомедицинских знаний.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве действующего вещества, обеспечивающего стимуляцию эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов у субъекта, нуждающегося в этом, предлагается использовать GSSG, который при парентеральном введении стимулирует продукцию ряда цитокинов и гемопоэтических факторов у млекопитающих (экспериментальных животных и людей) как в нормальных, так и в патологических условиях.

Согласно изобретению стимулятором эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов является глутатион окисленный (GSSG), представляющий собой димер глутатиона восстановленного, со структурой g-глутамил-цистеинилглицина, в котором две молекулы трипептида с вышеозначенной структурой соединены друг с другом ковалентной дисульфидной связью между цистеиновыми остатками.

Было впервые установлено, что прямое воздействие экзогенного GSSG на клетки млекопитающих (человека или экспериментальных животных), способных продуцировать цитокины или гемопоэтические факторы, оказывает стимулирующее действие на синтез последних и их высвобождение в кровь или окружающую среду, что приводит к повышению их концентрации в сыворотке крови (в условиях in vivo) или культуральной жидкости (в условиях in vitro и/или ex vivo). Изобретение позволяет достичь эффекта, заключающегося в стимуляции продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, получаемого при введении GSSG в организм или культуральную среду, в том числе при введении GSSG в составе фармацевтически активных композиций, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в окисленной форме. Результаты выполненных исследований также показали, что благодаря данному свойству GSSG и фармацевтические композиции с его участием обладают лечебным эффектом в различных патологических ситуациях в эксперименте и клинике.

Видимо обнаруженная стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, вызываемая GSSG, является первичной по отношению к противоопухолевому, противоинфекционному, гемопоэтическому и иммуностимулирующему, а также другим фармакологическим эффектам, обеспечивающим в свою очередь достижение той или иной степени лечебного или профилактического действия при различных заболеваниях.

Согласно изобретению лечебное средство, предлагаемое для лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, содержит в качестве действующего вещества эффективное количество GSSG, при этом целесообразно, чтобы лекарственная форма данного фармакологического средства представляла инъекционный раствор, содержащий GSSG в концентрации 0,01 2,0 Согласно изобретению, предлагается использование таких лекарственных форм GSSG и/или фармацевтических композиций с его участием, которые бы способствовали продлению пребывания глутатиона в биологических жидкостях и тканях в окисленном состоянии или могли бы усилить обнаруженные биологические и лечебные свойства GSSG.

Согласно изобретению для усиления и продления лечебного эффекта GSSG как лечебного средства целесообразно, чтобы лекарственная форма данного средства (инъекционный раствор) дополнительно содержала фармацевтически приемлемый компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме.

В качестве фармацевтически приемлемого компонента, способного продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, предлагается использовать, например, перекись водорода в концентрации 0,003 Это связано с тем, что в присутствии перекиси водорода (H₂O₂), являющейся донором активных форм кислорода (то есть окислителем), восстановление GSSG до GSH, осуществляемое глутатионредуктазой, протекает с меньшей скоростью, благодаря чему создаются условия для более медленного восстановления вводимого в биологические среды экзогенного GSSG.

При этом использование в составе лекарственной формы перекиси водорода (H₂O₂) в концентрации, фармацевтически приемлемой для парентерального введения, а также любых других прооксидантно-активных соединений (доноров активных форм кислорода) позволяет реализовать лишь одно из возможных технических решений, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в биологических жидкостях и тканях в окисленной форме с достижением результата, заключающегося в усилении и продлении фармацевтических эффектов GSSG.

Были установлены также другие фармацевтически приемлемые компоненты, способствующие более медленному протеканию процесса восстановления экзогенного GSSG в GSH в биологических средах. Таковыми, в частности, являются факторы, способные вступать в конкурентные отношения с восстановленной формой кофермента никотинамидадениндинуклетидфосфата или НАДФН (инозин и другие производные гипоксантина), а также вещества, обратимо тормозящие процессы восстановления окисленной формы НАДФ⁺ в НАДФН, например такие ингибиторы глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы как цистамин (2,2'-диаминодиэтилдисульфид).

Поскольку восстановленный никотинамидадениндинуклетидфосфат (НАДФН) является ключевым кофактором ферментативной системы глутатионредуктазы, катализирующей реакцию восстановления GSSG в GSH, любые другие фармацевтически приемлемые химические соединения или биофизические воздействия, снижающие эффективность его восстановления или блокирующие его биологическое окисление глутатион редуктазой, также могут способствовать продлению пребывания GSSG в биологических средах в окисленном состоянии, а следовательно, могут усиливать или продлевать лечебный эффект GSSG.

В результате проведенных исследований было впервые обнаружено, что фармацевтический и лечебный эффект GSSG усиливается при его использовании в комбинации с веществами, вступающими в конкурентные отношения с НАДФН, а также с веществами, обратимо ингибирующими ферментативную реакцию, катализируемую глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназой, в результате которой происходит восстановление окисленной формы НАДФ⁺.

Таким образом, помимо перекиси водорода, другим фармацевтически приемлемым компонентом, способным продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, является гипоксантинрибозид (инозин, или 9-b-рибофуранозилгипоксантин), который предлагается использовать в качестве 0,1 раствора.

Выполненные исследования показали, что гипоксантинрибозид оказывает потенцирующее действие в отношении фармакологических и лечебных эффектов GSSG. Было установлено, что данное свойство гипоксантинрибозида проявляется вследствие его способности вступать в конкурентные отношения с НАДФН, чем достигается замедление реакции восстановления GSSG в GSH. Более того, было установлено, что данным свойством обладают и другие производные гипоксантина, в том числе нуклеозидные производные инозина.

Также, помимо упомянутых выше перекиси водорода и гипоксантинрибозида, другим фармацевтически приемлемым компонентом, способным продлить пребывание глутатиона в окисленной форме, является цистамин (2,2'-диаминодиэтилдисульфид), который предлагается использовать также в качестве 0,1 раствора.

Выполненные исследования показали, что цистамин, оказывает потенцирующее действие в отношении биологических и лечебных эффектов GSSG. Было установлено, что данное свойство цистамина проявляется вследствие его способности осуществлять обратимое ингибирование пускового фермента пентозного цикла, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, катализирующей реакцию восстановления НАДФ⁺ в НАДФН.

Таким образом, изобретением также предлагается способ потенцирования способности окисленного глутатиона (GSSG) стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, заключающийся в том, что GSSG используют в составе фармацевтических композиций, содержащих компонент, способный продлить пребывание глутатиона в окисленной форме. Это достигается путем использования фармацевтически приемлемых композиций, содержащих лекарственные формы GSSG и лекарственные формы веществ, способных продлить пребывание глутатиона в биологических средах в окисленной форме, например 0,002 раствор перекиси водорода (иди другие прооксидантно активные соединения), 0,1 раствор гипоксантинрибозида (или другие производные гипоксантина, в том числе нуклеозидные производные инозина), а также 0,1 раствор цистамина (или другие соединения, способные осуществлять обратимое ингибирование пускового фермента пентозного цикла, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).

Установлено, что парентерально (внутривенное, внутрибрюшинное, внутримышечное и т. д.) применение GSSG в 1 5 мл 0,003 раствора перекиси водорода, GSSG в 1 5 мл 0,1 раствора гипоксантинрибозида, а также GSSG в 1 5 мл 0,1 раствора цистамина стимулирует эндогенную продукцию TNF-альфа, IFN-альфа и IFN-гамма, IL-1, IL-2, IL-6, IL-10, эритропоэтина и GM-CSF у экспериментальных животных в большей степени, чем это наблюдается в случае применения только GSSG.

Проведенные исследования подтверждают способность вышеупомянутых соединений (перекиси водорода, гипоксантинрибозида и цистамина) усиливать биологические и лечебные эффекты GSSG и свидетельствуют о целесообразности их сочетанного применения с GSSG в целях повышения эффективности лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов целесообразна по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Таким образом, согласно изобретению с целью усиления и продления лечебного эффекта GSSG целесообразно, чтобы лекарственная форма данного соединения (1 5 мл инъекционного раствора) содержала дополнительные фармацевтически приемлемые компоненты, способные продлить пребывание экзогенного GSSG, введенного в биологические среды организма, в окисленной форме, например: а) перекись водорода в концентрации 0,003 или любые другие фармацевтически приемлемые прооксидантно-активные соединения, являющиеся донорами активных форм кислорода; б) гипоксантинрибозид (инозин, 9-b-рибофуранозилгипоксантин) в концентрации 0,1 или любые другие фармацевтически приемлемые метаболические конкуренты НАДФН, способные тормозить восстановление GSSG в GSH, катализируемое глутатионредуктазой; в) цистамин (2,2'-диаминодиэтилдисульфид, 2,2'-дитиобис[этиламин] ) в концентрации 0,1 или любые другие фармацевтически приемлемые компоненты, способные вызывать обратимое ингибирование восстановления НАДФ⁺ в НАДФН, катализируемое глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой или другими ферментами.

Вместе с тем, были получены данные, свидетельствующие о возможности прямого противоопухолевого эффекта GSSG или GSSG, применяемого в составе фармацевтически приемлемых композиций, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в биологических средах в окисленной форме. При этом действие GSSG проявляется дифференцированным эффектом относительно нормальных и опухолевых клеток. Исследования в условиях in vitro с применением нормальных и опухолевых клеток свидетельствует о том, что использование GSSG или GSSG, применяемого в составе фармацевтически приемлемых композиций, обеспечивающих продление пребывания глутатиона в биологических средах в окисленной форме, сопровождается инициацией гибели опухолевых клеток по апоптотическому механизму. При этом, в случае использования нормальных клеток, их гибели не наблюдалось.

Согласно изобретению способ лечения онкологических, инфекционных, гематологических и других заболеваний, при которых целесообразна стимуляция эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, включает парентеральное введение GSSG как фармакологического средства в виде инъекционной лекарственной формы в дозах 0,01 0,5 мг GSSG на кг массы тела, от одной и более инъекций в день, курсами длительностью один и более дней или непрерывно до момента достижения лечебного эффекта.

При этом, GSSG как фармакологическое средство, его лекарственные формы и/или фармацевтические композиции с его участием должны вводиться в организм исключительно парентеральным путем, что исключает или минимизирует деградацию молекулы GSSG или ее восстановление (до GSH), интенсивно протекающее в пищеварительном тракте и печени при его пероральном введении.

При использовании молекулы GSSG, защищенной от протеолиза и/или восстановления в GSH, целесообразным было бы использование перорального пути введения и/или локального (in situ) применения в зоне патологического процесса (раневая поверхность, ткань опухоли и т. д.). Помимо этого, предлагаемый способ лечения заболеваний с целью усиления или продления действия предлагаемого фармакологического средства может включать одновременное осуществление химического воздействия (прооксидантноактивными окислителями; соединениями, влияющими на активность ферментов и кофакторов, участвующих в метаболизме окисленного и восстановленного глутатиона) и/или физического воздействия, например УФ- или радиоблучения, в том случае, если подобное воздействие было бы способно продлить пребывание глутатиона в биологических жидкостях и тканях в окисленном состоянии.

Приводимые далее примеры реализации изобретения подтверждают, что парентеральное (внутрибрюшинное, внутривенное, внутримышечное, подкожное и т. д.) применение GSSG способно стимулировать эндогенную продукцию TNF-a, IFN-a и IFN-g, IL-1, IL-2, IL-6 и IL-10, эритропоэтина и GM-CSF у млекопитающих, что позволяет добиться существенного лечебного эффекта у людей и животных, страдающих онкологическими или инфекционными заболеваниями, депрессиями кроветворения и иммунитета различного происхождения, а также другими заболеваниями, при которых стимуляция эндогенной продукции вышеупомянутых цитокинов и гемопоэтических факторов была бы целесообразной по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Из данных проведенных исследований (см. примеры реализации изобретения) следует, что неизвестная ранее способность GSSG усиливать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов и оказывать лечебный эффект при различных заболеваниях не связана с повышением уровня GSH, поскольку использование GSH в широком диапазоне доз и концентраций не позволяет достичь стимуляции эндогенной продукции цитокинов и гемопоэтических факторов, а также лечебного эффекта, который был обнаружен при использовании GSSG.

При этом, под "лечебным эффектом" понимается любое улучшение в состоянии пациента или животного, подвергнутого лечению по предлагаемому способу, а также любое снижение тяжести проявлений и выраженности симптомов заболеваний или их осложнений, в том числе вызванных другими методами лечения (например химио- или радиотерапией), которые могли бы быть зафиксированы с помощью физикальных, лабораторных или инструментальных методов обследования и были бы статистически достоверны и/или клинически значимы с точки зрения специалиста в соответствующей области медицины.

Под "профилактическим эффектом" понимается предупреждение любого ухудшения в состоянии субъекта, подвергнутого лечению по предлагаемому способу, а также предупреждение любого нарастания тяжести проявлений и выраженности симптомов заболеваний или их осложнений, в том числе вызванных другими методами лечения (например химио- или радиотерапией), которые могли бы быть зафиксированы с помощью физикальных, лабораторных или инструментальных методов обследования и были бы статистически достоверны и/или клинически значимы с точки зрения специалистов в соответствующей области медицины.

Под "онкологическими и инфекционными заболеваниями", "депрессией кроветворения и иммунитета различного происхождения" и "другими заболеваниями" понимаются любые онкологические или инфекционные заболевания, любые состояния, вызванные или сопровождающиеся угнетением красного или белого ростка кроветворения или депрессией количественных или функциональных показателей системы иммунитета, а также любые другие заболевания и патологические состояния, при которых стимуляция эндогенной продукции вышеупомянутых цитокинов и гемопоэтических факторов (TNF-a, IFN-a и IFN-g, IL-1, IL-2, IL-6 и IL-10, эритропоэтина и GM-CSF) была бы целесообразной по соображениям, очевидным для специалиста в соответствующей области медицины.

Приведенные ниже примеры реализации изобретения демонстрируют возможность его практической применимости.

Активное вещество пептид GSSG, обладающий способностью стимулировать эндогенную продукцию цитокинов и гемопоэтических факторов, может быть получен известным и общепринятым методом пептидного синтеза. Полученный таким образом пептид (GSSG) с целью его дальнейшего применения в условиях in vivo у людей и животных используется в виде основания или фармацевтически приемлемой соли в инъекционной лекарственной форме, получаемой путем растворения сухого вещества в стерильной воде для инъекций или любом фармацевтически приемлемом растворителе в концентрации 0,01 2,0 Для исследований в условиях in vitro GSSG может растворяться в приемлемых для проведения соответствующих экспериментов жидкостях культуральных средах, изотонических солевых растворах и т. д.

Приготовление лекарственной формы для применения у людей и животных должно выполняться с соблюдением условий стерильности и апирогенности и должно исключать возможность химического или бактериального загрязнения лекарственной формы.

Инъекционная лекарственная форма GSSG была исследована в экспериментах на животных и в ходе ограниченных клинических исследований у больных людей.

Благодаря использованию максимально достижимой концентрации инъекционного раствора натриевой соли GSSG (10,0 100 мг/мл) в воде, в 0,003 растворе перекиси водорода или в 0,1 растворах гипоксантинрибозида или цистамина, а также благодаря использованию максимально допустимых объемов жидкости, инъецируемых мышам при внутрибрюшинном (в/б, 2,0 мл), внутривенном (в/в, 0,5 мл) и внутримышечном (в/м, 0,05 мл) введении, были достигнуты дозы натриевой соли GSSG, составляющие 5000 мг/кг (в/б), 625 мг/кг (в/в) и 62,5 мг/кг (в/м), что превышает максимальную дозу, рекомендуемую для человека и составляющую 0,5 мг/кг, в 500, 125 и 12,5 раз соответственно. Ни в одном из случаев не отмечалось гибели животных, а также каких-либо токсических проявлений, что фактически свидетельствует о нетоксичности GSSG, используемого в лекарственной форме раствора для инъекций, а также о нетоксичности применявшихся фармацевтических композиций, содержащих GSSG.

Результаты доклинических (экспериментальных) исследований биологических, фармакологических и лечебных свойств GSSG, а также его лекарственных форм, содержащих или не содержащих 0,003 растворе перекиси водорода, 0,1 растворе гипоксантинрибозида или 0,1 растворе цистамина, приведены в примерах 1 5 реализации изобретения.

Пример 1. Влияние исследуемых веществ на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека в условиях in vitro.

Оценивали способность окисленного глутатиона (GSSG), а также GSSG в 0,003 растворе перекиси водорода, GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида или GSSG в 0,1 растворе цистамина влиять на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови человека в условиях in vitro.

Продукцию цитокинов лейкоцитами инициировали добавлением митогена, конканавалина А (ConA), который добавлялся к клеткам перед внесением в культуру исследуемых веществ. Супернатанты культур собирали через 24 ч после начала сочетанного воздействия ConA и исследуемых веществ и хранили до момента определения цитокинов при -70^oC.

Для оценки функционального состояния клеток и их способности претерпевать митоген-индуцированную активацию в присутствии каждой из оцениваемых концентраций исследуемых веществ контрольные культуры клеток, содержащие исследуемые вещества в идентичных концентрациях, инкубировали в течение 72 ч после начала сочетанного воздействия ConA и исследуемых веществ. За 16 ч до окончания инкубации в контрольные культуры вносили ³H-тимидин и степень включения метки в ДНК расценивали как критерий функционального состояния клеточной тест системы.

Венозную кровь от здоровых доноров (мужчин) собирали в гепаринизированные пробирки, тестированные на отсутствие эндотоксина (endotoxin tested). Мононуклеарную фракцию лейкоцитов крови получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-метризоат (Histopaque, Sigma).

Концентрацию клеток доводили до 210⁶ клеток на 1 мл "полной" культуральной среды (RPMI 1640, Sigma), содержащей 20 mM HEPES, 2 mM глутамина, 50 мкг/мл гентамицина и 10 фетальной телячьей сыворотки (все реагенты для культур тканей, Sigma). Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим и клеточную суспензию разносили в лунки плоскодонных 96-луночных планшетов для культур тканей из расчета 200000 клеток на лунку (по 100 мл суспензии). Клетки от каждого донора разносили не менее чем в 36 лунок.

Оценивали влияние 5 конечных концентраций (5000 mг/мл, 500 г/мл, 50 г/мл, 5 г/мл и 0,5 г/мл) окисленного глутатиона (GSSG) или GSSG в сочетании: а) с перекисью водорода в конечной концентрации 0,003 б) с гипоксантинрибозидом в конечной концентрации 0,1 в) с цистамином в конечной концентрации 0,1 Каждую из концентраций создавали не менее чем в 6 лунках, внося 50 л "полной" культуральной среды, содержащей необходимое количество предварительно растворенных веществ. Еще 6 лунок использовались для контроля (добавлялось 50 л только "полной" культуральной среды или полной среды, содержащей перекись водорода, гипоксантинрибозид, цистамин).

Непосредственно после внесения исследуемых веществ во все лунки (за исключением 3-х контрольных) вносили по 50 л "полной" культуральной среды, содержащей такое количество ConA (Sigma, для культур тканей), чтобы его конечная концентрация составляла 4,0 г/мл.

Через 24 ч инкубации планшетов при 37^oC в присутствии 5 CO₂ содержимое половины лунок (по 3 лунки из каждых 6, содержащих одинаковую концентрацию исследуемых веществ) отсасывали микропипеткой, подвергали центрифугированию, супернатанты замораживали и хранили при -70^oC до момента проведения ELISA тестов для определения присутствия цитокинов. Содержимое всех оставшихся заполненными лунок продолжали инкубировать при вышеописанных условиях.

Через 56 ч от начала инкубации во все оставшиеся лунки добавляли по 1,0 Ci³H-тимидина и продолжали инкубацию еще 16 ч, после чего содержимое лунок при помощи клеточного харвестера (cell harvester) наносили на стекловолокнистые фильтры, которые последовательно обрабатывали 5 трихлоруксусной кислотой и этанолом. Фильтры высушивали и их радиоактивность определяли с помощью жидкостного сцинтиляционного счетчика Betaplate 1205 (LKB).

Значения радиоактивности фильтров для каждого триплета лунок усредняли и рассчитывали индекс митогенной стимуляции по отношению к усредненному значению включения ³H-тимидина в триплете лунок, в которые не добавлялся ConA (спонтанное включение метки). По индексу стимуляции отношению усредненного ConA-стимулированного включения в трех контрольных лунках к усредненному спонтанному судили о функциональном состоянии клеток в данных лунках в присутствии оцениваемых концентраций GSSG (или GSSG в сочетании с перекисью водорода, гипоксантинрибозидом, цистамином) и об их способности отвечать на митогенную стимуляцию.

Последующему анализу на содержание цитокинов подвергали клеточные супернатанты 24-часовых культур только из тех триплетов лунок, в контрольных триплетах которых при 72-часовой инкубации индекс ConA-стимуляции, оцененной по включению ³H-тимидина, был не ниже 10, что свидетельствовало об удовлетворительном функциональном состоянии клеток.

Содержание интерлейкина-lb (IL-1 b); интерлейкина-6 (IL-6); фактора некроза опухолей (THF) и интерферона a(IFN) определяли иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов фирмы Medgenix (Belgium) и выражали в пкг/мл культуральной среды.

Результаты представлены в табл. 1 4. Согласно данным табл. 1 4 добавление GSSG в культуральную среду статистически достоверно и дозозависимо усиливает выработку цитокинов мононуклеарными лейкоцитами доноров. При этом, дополнительное присутствие перекиси водорода приводит к тому, что повышаются контрольные (в отсутствие GSSG) показатели продукции IL-6 и TNF. Кроме того, в присутствии перекиси водорода GSSG оказывает более выраженное (в 1,5 2 раза) стимулирующее влияние на продукцию исследуемых цитокинов: для IL-1b в концентрациях 5,0 5000 mг/мл, для IL-6 и TNF во всем диапазоне концентраций и для IFN в концентрациях 500 и 5000 mг/мл. Применение GSSG в 0,1 растворе гипоксантинрибозида и 0,1 растворе цистамина приводит к достоверному и дозозависимому повышению продукции цитокинов, особенно в отношении IL-6 и TNF (см. та