Сорбент для извлечения антител к инсулину из биологических жидкостей и способ его получения

Сорбент для извлечения антител к инсулину из биологических жидкостей и способ его получения

Реферат

 

Использование: в медицине, в частности, для экстракорпоральной очистки крови у больных сахарным диабетом. Сущность изобретения: сорбент представляет собой гранулированный активированный уголь, который дополнительно содержит инсулин в количестве 0,7 - 2,2 мас.%, ковалентно связанный с функциональными группами углеродной матрицы. Способ получения сорбента заключается в том, что активированный уголь обрабатывают растворами водорастворимого карбодиимида и инсулина. Углеродная матрица имеет статическую обменную емкость 0,8 - 1,6 мэкв/г, объем пор 0,5 - 2,0 см³/г и удельную поверхность 400 - 1800 м²/г. 2 с.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к материалам для экстракорпоральной очистки крови у больных сахарным диабетом и способу их получения. У подавляющего большинства больных сахарным диабетом на введение инсулина вырабатываются антитела к нему. Это приводит к увеличению дозы вводимого инсулина, развитию аллергической реакции на вводимый инсулин, что в свою очередь приводит к снижению эффективности или невозможности проведения инсулинтерапии. Удаление из кровотока больного антител к инсулину дало бы возможность вывести пациента из кризисного состояния (острой аллергической реакции), ликвидировать инсулинрезистентность и проводить дальше инсулинтерапию.

Известны иммунокорегирующие препараты, используемые для лечения диабета. Применение этих препаратов подавляет образование антител и циркулирующих иммунных комплексов в организме больного, т.е. содержание последних в кровяном русле уменьшается. Однако использование этих препаратов имеет ряд отрицательных побочных явлений (ухудшение течения диабета, пирогенные реакции, редко обратное действие и др.).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является гемосорбент СКН для лечения сахарного диабета путем проведения экстракорпоральной сорбционной детоксикации крови. При помощи этого материала удается извлекать до 22% антител к инсулину. Указанный гемосорбент представляет собой гранулы активированного угля сферической формы.

Недостатком указанного гемосорбента в лечении сахарного диабета является его низкая сорбционная способность по отношению к антителам к инсулину и, следовательно, низкий терапевтический эффект от его применения.

Для увеличения количества извлекаемых сорбентом из биологических жидкостей антител к инсулину известный гемосорбент для лечения сахарного диабета, представляющий собой гранулированный активированный уголь, дополнительно содержит инсулин, ковалентно связанный (иммобилизованный) на поверхности гранул с функциональными группами углеродной матрицы в количестве 0,7 2,2 мас.

-инсулин, где R углеродная матрица.

При иммобилизации инсулина менее 0,7 мас. адсорбционная способность целевого гемосорбента по отношению к антителам к инсулину существенно снижается. При увеличении содержания инсулина более 2,2 мас. не достигается увеличения эффективности извлечения антител к инсулину целевым гемосорбентом при больших затратах ресурсов и реактивов.

Известен способ получения биоспецифического гемосорбента, позволяющий повысить избирательность сорбента за счет ковалентной иммобилизации специфического белка, в качестве которого используется аллерген домашней пыли. Указанный способ включает последовательную обработку окисленного гранулированного активированного угля растворами водорастворимого карбодиимида и белковой добавки.

Однако описываемый способ, взятый в качестве прототипа, не позволяет добиться требуемого технического результата, поскольку аллерген домашней пыли не обладает селективностью по отношению к антителам к инсулину.

Получить сорбент, обеспечивающий увеличение количества извлекаемых из биологических жидкостей антител к инсулину можно заявляемым способом. Сущность его состоит в том, что в известном способе, включающем обработку окисленного гранулированного углеродного материала растворами водорастворимого карбодиимида и белковой добавки с последующей ее иммобилизацией, в качестве белковой добавки используют инсулин, а иммобилизацию инсулина проводят на окисленном гранулированном углеродном материале со статической обменной емкостью (СОЕ) 0,8 1,6 мэкв/г, объемом сорбционных пор (по бензолу) 0,5 - 2,0 см³/г и площадью удельной поверхности (по тепловой десорбции аргона) 400 1800 м²/г. При иммобилизации инсулина на углях с СОЕ, объемом сорбционных пор и площадью удельной поверхности меньше, чем заявляемый интервал, требуемый технический результат не достигается вследствие невозможности иммобилизовать нужное количество инсулина. При иммобилизации инсулина на углях с СОЕ, объемом сорбционных пор и площадью удельной поверхности больше заявляемого интервала нет преимуществ перед уже достигнутым результатом при больших затратах ресурсов и реактивов.

Применение инсулина и активированного угля, каждый в отдельности, дает незначительный терапевтический эффект. Использование инсулина с целью извлечения антител к инсулину из биологических жидкостей не дает возможности выводить из биологической жидкости растворимые в ней конъюгаты инсулина и антител к нему. Активированный уголь не обладает высокой адсорбционной способностью по отношению к антителам к инсулину, а следовательно, и высоким терапевтическим эффектом. Иммобилизация же инсулина на поверхности активированного угля позволяет создать сорбент, обладающий способностью к избирательному извлечению антител к инсулину из биологических жидкостей и, следовательно, высоким терапевтическим эффектом.

Целевой гемосорбент представляет собой гранулы активированного угля с ковалентно иммобилизованными на их поверхности молекулами инсулина.

Заявляемое изобретение осуществляется следующим образом.

Все операции проводятся в стерильном помещении с использованием стерильных растворов. Буферные растворы и исходный углеродный гемосорбент стерилизуют автоклавированием при 125^oC и 1,5 атм в течение 60 мин в стерилизаторе ВК-75. Раствор инсулина с концентрацией 5 мг/мл (исходный раствор) готовят на буферном растворе с pH 7,2 и стерилизуют пропусканием через фильтр "Millipor" (фирма Миллипор, США) с диаметром пор 0,45 m.

Пример 1. 5 г углеродного гемосорбента СКН_o с СОЕ 1,5 мэкв/г площадью удельной поверхности 1800 м²/г и объемом сорбционных пор 2,0 см³/г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, прибавляют 50 мл буферного раствора с pH 4 (состоящего из равных частей 0,15 М водных растворов дигидрофосфата калия и хлорида натрия) и оставляют на 10 12 ч при температуре 20 25^oC. После сливания жидкости, находящейся над гемосорбентом, в реакционную колбу приливают раствор 0,1 г водорастворимого карбодиимида (мето-п-толуолсульфонат-1-циклогексил-3(морфолиноэтил) карбодиимид, Серва, ФРГ) в 50 мл буферного раствора с pH 4. Реакционную колбу слабо перемешивают в течение 15 мин, сливают жидкость и прибавляют 50 мл рабочего раствора инсулина, приготовленного из 5 мл исходного раствора инсулина и 45 мл буферного раствора с pH 7,2, приготовленного из 0,15 М водных растворов гидрофосфата натрия (28,6 ч.), дигидрофосфата калия (9,0 ч.) и хлорида натрия (37,6 ч.). Гемосорбент выдерживают в контакте с раствором инсулина при слабом перемешивании в течение 18 20 ч. Жидкость сливают, к углеродному материалу прибавляют 100 мл буферного раствора с pH 7,2, слабо перемешивают в течение 15 мин, жидкость сливают. Операцию промывки повторяют 4 5 раз. Несвязавшийся инсулин определяют в надосадочной жидкости согласно модифицированному методу Лоури спектрофотометрированием при 700 нм.

Приготовленный целевой гемосорбент (0,2 г), содержащий 0,5 мас. инсулина и 99,5 мас. гемосорбента СКН_o, помещают в колбу на 50 мл и прибавляют 2 мл сыворотки крови больного диабетом (биологическая жидкость). Содержимое колбы перемешивают в течение 2 ч и проводят определение антител к инсулину, мочевины, креатинина и мочевой кислоты. Изменяя содержание инсулина в растворе, контактирующем с активированным карбодиимидом углем, аналогично примеру 1 были получены и исследованы образцы целевого сорбента с содержанием ковалентно иммобилизованного инсулина 0,5; 0,7; 1,5; 2,2; 2,5 мас. Результаты определений приведены в табл. 1.

Антитела к инсулину определяют радиоиммунным методом; мочевину - фотометрическим методом с тиосемикарбазидом, креатинин по цветной реакции методом Яффе, мочевую кислоту методом Фолина и Денисова на приборе Seralyzer (фирма Ames, США-Австрия).

Пример 2. Изменяя содержание инсулина в растворе, контактирующем с активированным карбодиимидом углем, аналогично примеру 1 были приготовлены и испытаны целевые инсулин-содержащие и исходный гемосорбенты, приготовленные на основе углей КАУ_o с различными структурно-сорбционными характеристиками. Результаты испытаний и структурно-сорбционные характеристики углей приведены в табл. 2.

Из приведенных выше данных видно, что иммобилизация инсулина на углеродном носителе в заявляемых интервалах 0,7 2,2 мас. приводит к увеличению способности сорбента извлекать антитела к инсулину из биологической жидкости (образцы N 1, 2, 4), в отличие от образца, не имеющего в своем составе ковалентно иммобилизованного инсулина (прототип, образец N 7). Иммобилизация инсулина в количестве более заявляемого интервала не приводит к улучшению уже достигнутых результатов при большей затрате реактивов и ресурсов (образец N 3). Кроме того, при этом сорбционные характеристики носителя должны удовлетворять заявляемым интервалам (СОЕ 0,8 1,6 мэкв/г, объем сорбционных пор 0,5 2,0 см³/г, площадь удельной поверхности 400 1800 м²/г). Сорбент, структурные характеристики которого не удовлетворяют заявляемым интервалам, не обеспечивает достижения цели изобретения (образец N 5), даже если количество иммобилизованного инсулина находится в заявляемом интервале (образец N 6).

Пример 3. Изменяя содержание инсулина в растворе, контактирующем с активированным карбодиимидом углем, аналогично примеру 1 были приготовлены и испытаны целевые инсулинсодержащие гемосорбенты на основе углей СКН_o с различными структурно-сорбционными характеристиками. Результаты определений и структурно-сорбционные характеристики углей приведены в табл. 3.

Из приведенных выше данных видно, что иммобилизация инсулина на исходном угле в заявляемом интервале 0,7 2,2 мас. приводит к увеличению адсорбционной способности сорбента извлекать антитела к инсулину из биологических жидкостей (образцы N 1, 2, 3) в отличие от образца, не имеющего в своем составе ковалентно иммобилизованного инсулина (прототип, образец N 7). Иммобилизация инсулина в количестве более заявляемого интервала не приводит к улучшению уже достигнутого результата при большей затрате реактивов и ресурсов (образец N 4). Кроме того, при этом сорбционные характеристики носителя должны удовлетворять заявляемым интервалам. Сорбенты, характеристики которых не удовлетворяют им, не обеспечивают достижения цели изобретения (образец N 5). Образцы окисленного угля с сорбционными характеристиками, превышающими заявляемый интервал (образец N 6), не имеют дополнительных преимуществ по сравнению с достигнутыми результатами.

Выводы. Иммобилизация инсулина на гемосорбенты СКН_o и КАУ_o в количествах и на сорбентах со структурно-сорбционными характеристиками, удовлетворяющими заявляемым интервалам, приводит к увеличению сорбционной способности целевого гемосорбента по отношению к антителам к инсулину у СКН-инс. сорбента в 2,1 раза, у КАУ-инс. сорбента в 3,9 раз по отношению к исходным углеродным гемосорбентам. При этом у инсулин-содержащих целевых сорбентов сохраняется неспецифическая сорбционная способность. Все эти качества заявляемого сорбента позволят ему найти широкое применение в медицине для экстракорпоральной детоксикации организма больных сахарным диабетом.

Формула изобретения

1. Сорбент для извлечения антител к инсулину из биологических жидкостей на основе гранулированного активированного угля, отличающийся тем, что он дополнительно содержит инсулин в количестве 0,7 2,2 мас. ковалентно связанный с функциональными группами углеродной матрицы и имеет следующую структурную формулу: где R углеродная матрица.

2. Способ получения сорбента для извлечения антител к инсулину из биологических жидкостей, включающий обработку активированного гранулированного угля растворами карбодиимида и белковой добавки, отличающийся тем, что в качестве белковой добавки используют инсулин, а в качестве активированного угля уголь со статической обменной емкостью 0,8 1,6 моль/г, объемом сорбционных пор 0,5 2,0 см³/г и удельной поверхностью 400 1800 м²/г.

РИСУНКИ

Рисунок 1