Производные гидразина или их соли, фармацевтическое средство, аминоалкилгидразины или их соли

Производные гидразина или их соли, фармацевтическое средство, аминоалкилгидразины или их соли

Реферат

 

Использование: в медицине как обладающие свойством ингибировать действие фермента ВИЧ- протеазы и антивирусной активностью. Сущность изобретения: производные гидразина общей формулы 1: R₁R₂N - C(R₃R₄) - C(R₅R₆ - N(R₇)N(R₈R₉) , где R₁ и R₉ независимо друг от друга - водород, низший алканоил, фенил(низш.) алканоил, фенил(низш). алканоил, в котором остаток низшего алконоила замещен карбамоилом, морфолино(низш.) алканоил, тиоморфолино(низш.) алканоил, пиридил(низш.) алканоил, хинолил(низш.) алканоил, тетразолил(низш. ) алканоил, амино(низш. ) алканоил, замещенный у аминного азота N-морфолино- или N-тиоморфолинокарбон - ил, галоген(низш.) алканоил, содержащий до трех атомов галогена, 2-(N-морфолино(низш.) алкилкарбамоил)-низший алканоил, 2-(N-пиридил(низш. ) алкилкарбамоил)-низший алканоил, низший алкоксикарбонил, фенил(низш. ) алкоксикарбонил, тетрагидрофуранил(низш.) алкилксикарбонил, низший алкилсульфонил, N-пиридил(низш.) алкил-N-(низш.) алкилкарбамоил, или ацильный остаток аминокислоты, выбранный из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, глютаминовой кислоты и аспарагина в форме (D)-, (L)-, или (D,L)-, где - аминогруппа незамещена или ацилирована одним из вышеназванных остатков R₁ или R₉, при условии, что по меньшей мере один из остатков R₁ и R₉ означает водород, R₂, R₄, R₆ и R₈ означают водород; R₃ - низший алкил, циклогексил(низш.) алкил или фенил(низш.) алкил, незамещенный или замещенный галогеном, низшим алкокси или циано; R₅ - означает гидроксильную группу; R₇ - низший алкил, циклогексил(низш.) алкил, или фенил(низш. ) алкил, незамещенный или замещенный галогеном, низшим алкокси или циано, или их соли, в случае наличия солеобразующих групп, фармацевтическое средство, содержащее эффективное количество соединений формулы I, а также производное гидразина формулы II: H₂N - HC(R₃) - CH(OH) - N(R₇)NH₂ - промежуточные продукты в синтезе I. 2 с. и 8 з.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к новому классу негидролизующихся аналогов, расщепляемых с помощью аспартатпротеазы пептидов, а именно к производным гидразина и их фармакологически приемлемым солям, обладающим свойствами ингибировать действие фермента ВИЧ-протеазы и антивирусной активностью; фармацевтическому средству на их основе, пригодному для борьбы с вирусными заболеваниями, а также к новым аминоалкилгидразинам промежуточным продуктам для получения производных гидразина.

В случае иммунодефицита, СПИДа ("синдром приобретенного иммунодефицита"), речь идет о заболевании со смертельным исходом. Это заболевание распространяется во всем мире в возрастающей мере, прежде всего внутри известных групп риска, и через эти группы риска. Оно затронуло уже миллионы людей, и борьба с его причиной представляет собой одну из самых значительных целей для современной медицины. До сих пор смогли идентифицировать ретровирусы ВИЧ-1 и ВИЧ-2 (ВИЧ обозначает "вирус человеческого иммунодефицита") в качестве причин заболевания и охарактеризовать их с точки зрения молекулярной биологии. Для терапии среди существовавших до сих пор средств для облегчения симптомов СПИДа и известных предохранительных средств особый интерес представляют поиски препаратов, которые препятствуют размножению самого вируса, не повреждая интактные клетки и ткани пациентов.

В качестве последних особенно обещающими успех являются соединения, которые препятствуют образованию биосинтезируемых в клетках человека протеиновых структурных элементов вируса и соединению этих структурных элементов в полные, инфекционные вирионы.

ВИЧ-1 и ВИЧ-2, смотря по обстоятельствам, в своем геноме имеют область, которая кодирует "gag-протеазу". Эта "gag-протеаза" ответственна за точное протеолитическое расщепление протеинов-предшественников, которые, в свою очередь, происходят из кодирующих "группу специфических антигенов" (gag) сегментов (отрезков) генома. При этом высвобождаются структурные протеины ядра вируса (по английски "Core" ядро, сердцевина). "gag-Протеаза" сама является составной частью кодированного за счет сегмента pol-генома ВИЧ-1 и ВИЧ-2 протеина-предшественника, который также содержит сегменты (отрезки) для "обратной транскриптазы" и "интегразы" и по всей вероятности расщепляется аутопротеолитически.

"gag-Протеаза" расщепляет основной протеин ядра ("Major Core Protein") p24 ВИЧ-1 и ВИЧ-2, предпочтительно N-терминальный пролиновых остатков, например, в двухвалентных радикалах Phe-Pro, Leu-Pro или Tyr-Pro. Речь идет о протеазе с каталитически активным аспартатным остатком в активном центре, так называемой аспартатпротеазе.

Если бы имелась возможность препятствовать действию "gag-протеазы", то у вируса не было бы в распоряжении необходимых протеинов для построения вирусного ядра. Это ограничивало бы или вовсе препятствовало бы размножению вируса. Таким образом имеется потребность в ингибиторах "gag-протеазы" для использования в качестве противовирусных средств против (СПИДа и других ретровирусных заболеваний.

Уже синтезирован ряд ингибиторов "gag-протеаз", которые содержат группы, представляющие собой не протеолитически расщепляемые пептидные изостеры (isostere). До сих пор, несмотря на интенсивные исследования, однако еще не удалось найти пригодный для применения для людей ингибитор аспартатпротеазы для борьбы со СПИДом у большей части инфицированных. Для этой цели решающими прежде всего являются фармакодинамические свойства. Кроме того, большинство известных до сих пор ингибиторов "gag-протеаз" содержат более, чем два, асимметрических атомов углерода в указанном центральном структурном элементе, что вызывает необходимость в относительно дорогостоящих стереоспецифических синтезах для разделения изомеров.

Задачей настоящего изобретения является изыскание доступного нового класса соединений-ингибиторов вирусных аспартатпротеаз с новым структурным центральным элементом в молекуле. Синтез этого центрального структурного элемента, кроме того, должен быть по возможности стерически прост. Поскольку новый структурный элемент с двух концов содержит аминогруппы при подборе заместителей можно использовать, например, аналогичные ретро-инверсно-пептидные структуры.

Согласно изобретению предлагаются производные гидразина общей формулы I.

где R₁ и R₉ независимо друг от друга водород, низший алканоил, фенил-низш. алканоил, фенил-низш. алканоил, в котором остаток низшего алконоила замещен карбамоилом, морфолино-низш. алканоил, тиоморфолино-низш. алканоил, пиридил-низш. алканоил, хинолил-низш. алканоил, тетразолил-низш.алканоил, амино-низш. алканоил, замещенный у аминного азота N-морфолино- или N-тиоморфолинокарбонил, галоген-низш. алканоил, содержащий до трех атомов галогена, 2-(N-морфолино-низш.алкилкарбамоил)- низш. алкоксикарбонил, низший алкилсульфонил, N-пиридил-низш. алкил-N-низш.алкилкарбамоил, или ацильный остаток аминокислоты, выбранный из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, глютаминовой кислоты и аспарагина в форме (D)-, (L)- или (D,L)-, где аминогруппа не замещена или ацилирована одним из вышеназванных остатков R₁ или R₉, при условии, что по меньшей мере один из остатков R₁ и R₉ означает водород; R₂, R₄, R₆ и R₈ означают водород; R₃ низший алкил, циклогексил-низш. алкил или фенил-низш. алкил, незамещенный или замещенный галогеном, низшим алкокси или циано; R₅ означает гидроксильную группу; R₇ низший алкил, циклогексил-низш. алкил, или фенил-низш. алкил, незамещенный или замещенный галогеном, низшим алкокси или циано, или же их соли, в случае наличия солеобразующих групп.

Предпочтительны соединения формулы I, в которой R₁- низший алкоксикарбонил, фенил-низш. алкоксикарбонил, связанный через карбоксильную группу одновалентный радикал алифатической аминокислоты, выбранной из валина, аланина, лейцина и изолейцина, или связанный через карбоксильную группу, N-ацилированный по аминогруппе одним из остатков - фенил-(низший алканоил), морфолино-(низший алканоил), тиоморфолино(низший алканоил), пиридил-(низший алканоил), низший алкоксикарбонил или фенил-(низший алкоксикарбонил) радикал вышеуказанной алифатической аминокислоты, причем все названные аминокислоты представлены в форме (D)- (L)-, или (D,L)-; R₂ водород; R₃ фенил-(низший алкил); R₄ водород; R₅ гидроксильная группа; R₆ водород; R₇ низший алкил, циклогексил-низш. алкил или фенил-низш. алкил; R₈ водород; и одно из значений R₁ и остатки R₃ и R₅ у асимметричных атомов углерода находятся в S-конфигурации, а также фармакологически приемлемые соли этих соединений.

В частности, предпочтительны соединения формулы I, где R₁ трет.-бутоксикарбонил, бензилоксикарбонил, связанный через карбоксильную группу одновалентный радикал аминокислоты валина или связанный через карбоксильную группу радикал аланина, N-ацилированного по аминогруппе одним из остатков фенилацетил, 3-пиридилацетил, морфолинокарбонил, тиоморфолинокарбонил, трет.-бутоксикарбонил или бензилоксикарбонил; R₂ водород; R₃ бензил; R₄ водород; R₅ гидроксильная группа; R₆ водород; R₇ изобутил, циклогексилметил или бензил; R₈ водород; и R₉ одно из значений R₁ и остатки R₃ и R₅ у асимметричных атомов углерода находятся в S-конфигурации, а также фармакологически приемлемые соли этих соединений.

Особенно предпочтительны соединения формулы I, где R₁, и R₉ соответственно связанный через карбоксильную группу, N-ацилированный по аминогруппе бензилоксикарбонилом одновалентный радикал аминокислоты-(L)-валина; R₂ и R₈ водород; R₃ бензил; R₄ водород; R₅ гидроксильная группа; R₆ водород; R₇ бензил; и остатки R₃ и R₅ у асимметричных атомов углерода находятся в S-конфигурации, а также фармакологически приемлемые соли этих соединений: а также соединения формулы I, где R₁ и R₉ соответственно связанный через карбоксильную группу, N-ацилированный по аминогруппе 4-тиоморфолинокарбонилом одновалентный радикал аминокислоты (L)-валина; R₂ и R₈ водород; R₃ бензил; R₄ водород; R₅ гидроксильная группа; R₆ водород; R₇ изобутил; и остатки R₃ и R₅ у асимметричных атомов углерода находятся в S-конфигурации, а также фармакологически приемлемые соли этих соединений.

В частности, к предпочтительным соединениям формулы I относятся соединения, выбранные из: Boc-[Phe^NNPhe]-Boc; Boc-(L)-вал-[Phe^NNPhe] (L)-вал-Boc; Boc-[Phe^NNCha]-Boc; H-(L)-вал-[Phe^NNPhe] J (L)-вал-H; N-тиоморфолинокарбонил-(L)-вал-[Phe^NNPhe] J (N- тиоморфолинокарбонил-(L)-вал); N-морфолинокарбонил-(L)-вал-[Phe^NNPhe] J (N- морфолинокарбонил-(L)-вал); фенилацетил-(L)-вал-[Phe^NNPhe] J (N-фенилацетил-(L)-вал); N-(3-пиридилацетил)-(L)-вал-[Phe^NNPhe] J (N-(3- пиридилацетил)-(L)-вал); Boc-(L)-вал-[Phe^NNCha] J -(L)-вал-Boc; Z-(L)-вал-[Phe^NNCha] J -(L)-вал-Z; Boc-[Phe^NNLeu]-Boc; Z-(L)-вал-[Phe^NNLeu] J -(L)-вал-Z, H-(L)-вал-[Phe^NNCha] J (L)-вал)-H и N-(3-пиридилацетил)-(L)-вал-[Phe^NNLeu] J (N-(3- пиридилацетил)-(L)-вал) или их соли, где Boc означает трет.-бутоксикарбонил, Z бензилоксикарбонил, остаток [Phe^NNPhe] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-фенил-1- (N-бензилгидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу где остаток [Phe^NNCha] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-фенил- 1-(N-циклогексилметилгидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу где остаток [Phe^NNLeu] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-фенил-1-(N-изобутилгидразино)-бутан-2-(S)-ол и имеет формулу и стрелка "" означает поворот связи в отклонении от обычных пептидных номенклатур, причем влево амино- и вправо карбокси; а также соединения формулы I, выбранные из Z-(L)-вал-[(p-F)Phe^NN(p-F)Phe] J (N-(N-(2-пиридилметил)-N- метиламинокарбонил)-(L)-вал); Z-(L) -вал- [(p-F)Phe^NN(p-F)Phe] J (N-(2(R,S) -карбамоил-3-фенил-пропионил)-(L)-вал); ацетил-(L)-вал-[Phe^NNCha] J (N-ацетил-(L)-вал); ацетил-Ile- [Phe^NNCha] J (N-ацетил-Ile); N-(2-пиридилметил)-N-метиламинокарбонил-(L)-вал-[Phe^NN (p-F)Phe] J (N-(N-(2-пиридилметил)-N-метиламинокарбонил)-(L)-вал); Z-(L)-вал-[Phe^NN(p-F)Phe] J ((L)-вал)-Z; Z-(L)-вал-[Phe^NN(p-CN)Phe] J ((L)-вал)-Z; Z-(L)-Ile-[Phe^NNLeu] J ((L)-Ile)-Z; изобутоксикарбонил-(L)-вал-[Phe^NNLeu] J (N- изобутоксикарбонил-(L)-вал); ацетил-вал-[Phe^NNLeu] J (N-(2(R,S)-карбамоил-3- фенилпропионил)-вал; N-трифторацетил-[Phe^NNLeu] J (N-(2(R,S)-карбамоил-3- фенилпропионил)-(L)-вал); Z-(L)-вал-[Phe^NNNle] J (N-(2(R,S)-(N-(2-морфолинометил)- карбамоил)-3-метил)-бутирил); Z-(L)-вал-[Phe^NNNle] J (N-(2(R, S)-(N-(2-пиридилметил)- карбамоил)-3-метил)-бутирил); метоксикарбонил-(L)-вал-[Phe^NNLeu] J (N-метоксикарбонил- (L)-вал); метоксикарбонил-(L)-вал-[Phe^NN(p-F)Phe] J (N- метоксикарбонил)-(L)-вал); и метоксикарбонил-(L)-вал-[Phe^NN(p-CH)Phe] <-- (N- метоксикарбонил-(L)-вал) или их соли, где Z бензилоксикарбонил, остаток [Phe^NNPhe] означает двухвалентный радикал 3(S)- амино-4-фенил-1-(N-бензилгидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу где остаток [Phe^NNCha] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-фенил-1-(N-циклогексилметилгидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу где остаток [Phe^NNLeu] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-фенил-1-(N-изобутилгидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу остаток [Phe^NNNle] означает радикал 3(S)-амино-4-фенил-1-(N-n-бутилгидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу остаток [Phe^NN(p-F)Phe] означает двухвалентный радикал 3(s)-амино-4-фенил-1-(N-(р-фторфенилметил)-гидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу остаток [(p-F)Phe^NN(p-F)Phe] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-(p-фторфенил)-1-(N-(p-фторфенилметил)-гидразино)- бутан-2-(S)-ол и имеет формулу остаток [Phe^NN(p-CN)Phe] означает двухвалентный радикал 3(S)-амино-4-фенил-1-(N-(p-цианофенилметил)-гидразино)-бутан-2(S)-ол и имеет формулу и стрелка "<--" означает поворот связи в отклонение от обычных пептидных номенклатур, причем влево амино- и вправо карбокси.

Все соединения формулы 1 обладают свойствами ингибировать действие фермента ВИЧ-протеазы.

Выражение "низший" обозначает, что таким образом определенные группы или остатки, если не указано иное, содержат вплоть до 7 и предпочтительно вплоть до 4 C-атомов.

Замещенные радикалами R₃ и R₄, соответственно, R₅ и R₆ атомы углерода в соединениях формулы I, если они асимметричны, так же как и имеющиеся в случае необходимости другие асимметрические атомы углерода, могут быть в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации. Таким образом настоящие соединения могут быть в виде смесей изомеров или в виде чистых изомеров, в особенности в виде смесей диастереомеров, пар энантиомеров или чистых энантиомеров. Предпочтительны соединения формулы I, где R₃ и R₅ находится в (S)- конфигурации, а другие, возможно имеющиеся асимметрические атомы углерода, независимо друг от друга, находятся в (R)-, (s)- или (R,S)- конфигурации.

Используемые в описании настоящего изобретения общие выражения и обозначения предпочтительно имеют следующие значения, причем в различных областях определения выше- и нижеуказанных остатков могут применяться любые комбинации или индивидуальные остатки вместо общих определений: Ацил R₁ или R₉ является в первую очередь ацильной группой карбоновой кислоты, неполного сложного эфира угольной кислоты.

Предпочтительные ацильные группы R₁ и R₉ карбоновой кислоты представляют собой низший алканоил, как: формил, ацетил, пропионил, бутирил или пивалоил; или замещенный низший алканоил, как: (низший алкокси)-(низший алканоил), например, (низший алкокси)-ацетил или (низший алкокси)- пропионил, как метоксиацетил, этоксиацетил или 3-метоксипропионил; аминонизший алканоил означает, например, 2-аминоацетил или 2-амино-3-пропионил.

Предпочтительные ацильные группы R₁ и R₉ неполного сложного эфира угольной кислоты представляют собой (низший алкокси)-карбонил, например, метокси-, этокси-, изопропокси-, изобутокси- или трет. -(низший алкокси)- карбонил, как трет. -бутоксикарбонил или изобутоксикарбонил: 2-галоген (низший алкокси)-карбонил, как 2-хлор-, 2-бром-, 2-иод- или 2, 2, 2- трихлорэтоксикарбонил.

Предпочтительными ацильными группами R₁ и R₉ незамещенной или замещенной карбаминовой кислоты, наряду с пригодными, уже названными в качестве предпочтительных ацильных остатков R₁ и R₉ остатками, являются: незамещенный или замещенный N-гетероциклил N-алкилкарбамоил, где гетероциклил предпочтительно пиридил, как 2-, 3- или 4-пиридил, в первую очередь в N-гетероциклил(низший алкил)-N-(низший алкил)-карбамоиле, например, как N-пиридил(низший алкил)-N-(низший алкил)-карбамоил, как N-(2-, 3- или 4-пиридилметил)-N-метилкарбамоил, или N-гетероциклил-(низший алкил)-карбамоил, как, например, 2- или 3-пиридил(низший алкил)- аминокарбонил, как 2- или 3-пиридилметиламинокарбоксил; или, например, 2-(N-морфолино-N-(низший алкил)-карбамоил)-(низший алканоил), как 2-(R,S)-[N-(2-N-морфолиноэтил)-карбамоил] -3-метилбутирил, или 2-(N-[пиридил-(низший алкил)]-карбамоил)-(низший алканоил), или (2-(R, S)-(N-(2-пиридилметил)-карбамоил)-3-метил)-бутирил; галоген низш. алканоил, который, предпочтительно, содержит вплоть до 3-х атомов галогена, представляет собой, например, -галогенацетил, как a -фтор-, a -хлор-, a -бром-, a -иод-, a,, -трифтор- или a,, -трихлорацетил-, или галогенпропионил, как b -хлор- или b -бромпропионил; алкилсульфонил, как метил или этилсульфонил; фенил-низший алкоксикарбонил представляет собой, предпочтительно, бензилоксикарбонил.

Предпочтительные ацильные группы R₁ и R₉ незамещенной или замещенной аминокислоты образуются за счет аминокислотных остатков a- или --аминокислоты, в особенности: природной -аминокислоты с L-конфигурацией, которая обычно имеется в протеинах, или эпимера такой аминокислоты, то есть с неприродной D-конфигурацией, или ее D,L-изомерной смеси.

R₂, R₄, R₆К и R₈ обозначают водород.

R₃ и R₇ обозначают низший алкил, как изобутил или н-бутил; обозначают циклогексил(низший алкил) или фенилнизший алкил, незамещенный или замещенный низшим алкокси, галогеном или циано.

R₅ обозначает гидроксил.

R₃ и R₇, прежде всего, в случае циклогексил-(низший алкил), циклогексилметил, или, в случае фенил-(низший алкил), который незамещен или замещен указанными заместителями, это бензил, 2-фенилэтил, 3-фенилпропил, 4-фтор-, 4-циано-, 4-метокси, или его соль, если имеется солеобразующая группа.

Соли соединений формулы I представляют собой в особенности соли присоединения кислот, соли с основаниями или при наличии нескольких солеобразующих групп, в случае необходимости также смешанные или внутренние соли.

Солями являются в первую очередь фармацевтически применимые нетоксичные соли соединений формулы I.

Такие соли образуются, например, соединениями формулы I с кислой группой и представляют собой, например, соли с пригодными основаниями, соли с нетоксичными металлами. Периодической системы элементов соли металлов групп IА, IБ, IIА и IIБ; в первую очередь это соли щелочных металлов, например, соли лития, натрия, или калия, или соли щелочноземельных металлов, например, соли магния или кальция; далее, соли цинка или аммония, также такие соли, которые образуются с органическими аминами, в случае необходимости замещенными гидроксилом моно-, ди- или триалкиламинами, в особенности моно-, ди- или три-(низший алкил)-аминами, или с четвертичными аммониевыми соединениями, например, с N-метил-N-этиламином, диэтиламином, триэтиламином, моно-, бис- или трис-[2-окси-(низший алкил)] -аминами, как моно-, бис- или трис-(2-оксиэтил)-амин, 2-окси-трет.-бутиламин или трис-(оксиметил)-метиламин: N, N-ди-(низший алкил)-N-(окси-(низший алкил)-аминами, как N, N-диметил-N-(2-оксиэтил)- амин или три-(2-оксиэтил)-амин, N-метил-D-глюкамином, или четвертичными аммониевыми солями, как тетрабутиламмониевые соли. Соединения формулы I с основной группой, например, аминогруппой, могут образовывать соли присоединения кислот, например, с неорганическими кислотами, как, например, галогенводородная кислота, как соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота, или с органическими карбоновыми, сульфо-, сульфоновыми или фосфоновыми кислотами или N-замещенными сульфаминовыми кислотами, как, например, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, оксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, фумаровая кислота, яблочная кислота, винная кислота, глюконовая кислота, глюкаровая кислота, глюкуроновая кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, 2-феноксибензойная кислота, 2- ацетоксибензойная кислота, эмбоновая кислота, никотиновая кислота, или изоникотиновая кислота; далее, с аминокислотами, как, например, далее называемыми a -аминокислотами, в особенности с глутаминовой кислотой и аспарагиновой кислотой, а также с метансульфоновой, этансульфокислотой, 2-оксиэтансульфокислотой, этан-1,2-дисульфокислотой, бензолсульфокислотой, 4-метилбензолсульфокислотой, нафталин-2-сульфокислотой, 2- или 3- фосфоглицератом, глюкоза-6-фосфатом, N-циклогексилсульфаминовой кислотой (при образовании цикламатов) или с другими кислыми органическими соединениями, как аскорбиновая кислота. Соединения формулы I с кислотными и основными группами также могут образовывать внутренние соли.

Для выделения или очистки также могут найти применение фармацевтически непригодные соли.

Соединения настоящего изобретения обладают ингибирующим действием на вирусные аспартатпротеазы, в особенности подавляющими gag-протеазу действием. В первую очередь предлагаемые соединения при испытании в нижеописанном тесте в концентрации 10^-6 10^-9 моль/л подавляют действие gag-протеазы ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и поэтому пригодны в качестве средства против вызываемых этими или применяемыми ретровирусами заболеваний, как, например, против СПИДа.

Способность соединений формулы I ингибировать протеолитическую активность, например, ВИЧ-1-протеазы, можно продемонстрировать, например, согласно способу, описанному J. Hansen et al. The EMBO Journal, 7 1785 1791 (1988). При этом ингибирование действия gag-протеазы измеряется на субстрате, который представляет собой выраженный в E. coli, слитый протеин из gag-предшественника протеина и MS-2. Субстрат и продукты его расщепления разделяют путем полиакриламид-гель-электрофореза и проявляют за счет иммуноблоттинга с моноклональными антителами против MS-2.

В еще более просто осуществляемом тесте, который делает возможным точные количественные показания, в качестве субстрата для gag-протеазы используется синтетический пептид, который соответствует месту расщепления gag-предшественника-протеина. Этот субстрат и его продукты расщепления можно измерять с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД).

Например, в качестве субстрата для рекомбинантной ВИЧ-1-протеазы [получение см. Billich S et al, J. Biol Chem. 263(34), 17905 17908 (1990)] используется синтетический хромофорный пептид-(например, HKARLV (NO₂ FEANLES (Bachem, Швейцария) или Icosa-пептид, как RRSNQVSQNYPQNIQGRR (получен пептидным синтезом по известному способу), который соответствует месту расщепления gag-предшественника протеина. Этот субстрат и продукты его расщепления можно измерять с помощью ЖХВД.

Для этой цели испытуемый ингибитор формулы I растворяют в диметилсульфоксиде; ферментный тест осуществляют добавлением пригодных разбавлений ингибитора в 20 мМ b -морфолиноэтансульфокислоты [(MES)- буфер, pH 6,0] к смеси для испытания из 67,2 мкМ указанного хромофорного пептида в 0,3 М ацетата натрия, 0,1 м NaCl, pH 7,4, или 122 мкМ вышеуказанного Icosa-пептида в 20 мМ MES-буфера с pH 6,0. Объем смеси составляет 100 мкл. Реакция инициируется добавлением в первом случае 2 мкл, во втором случае - 10 мкл ВИЧ-1-протеазы и прекращается в первом случае спустя 15 мин благодаря добавке 100 мкл 0,3 М HClO₄, во втором случае спустя час инкубации при 37^oC благодаря добавке 10 мкл 0,3 М HClO₄. Продукты реакции после центрифугирования пробы в течение 5 мин при 10000 g в 100 мкл (смесь с хромофорным пептидом), соответственно, 20 мкл (смесь с Icosa-пептидом) полученной надосадочной жидкости, после нанесения на колонку размером 125x4,6 мм Nucleosil C 18 5 мк(ЖХВД) (Macherey and Nagel, D ren) и элюирования, определяют количественно руководствуясь высотой пика продукта расщепления при 280 нм (смесь с хромофорным пептидом) или при 215 нм (смесь с Icosa-пептидом). Градиент: 100% E 1.1 50% E 1.1 (50% E 1.2) E 1.1:50% ацетонитрила, 90% H₂O, 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA); E 1.2: 75% ацетонитрила, 25% H₂O, 0,08% TFA в течение 15 минут; скорость пропускания 1 мл/мин.

При этом для соединения формулы I определяются предпочтительно IC₅₀-значения (IC₅₀ такая концентрация, которая снижает активность ВИЧ-1 протеазы по сравнению с контролем без ингибитора на 50%) примерно 10^-6 10_-9 М, в особенности, примерно 10_-7-примерно 10_-8 М.

В следующем тесте можно показать, что соединения настоящего изобретения защищают клетки, которые обычно инфицируются ВИЧ, от такой инфекции или при меньшей мере замедляют такую инфекцию. При этом человеческую линию клеток ЯМТ-2 с T-клеточной лейкемией [Science, 229, 563 (1985)] которая крайне чувствительна к цитопатогенному эффекту ВИЧ, инкубируют с одним ВИЧ или с ВИЧ в присутствии предлагаемых в изобретении соединений и спустя несколько дней оценивают жизнеспособность таким образом обработанных клеток.

Для этой цели МТ-2-клетки выдерживают при 37^oC во влажном воздухе с 5% CO₂ в RPMI-1640-среде (Gibco, Швейцария: RPMI-1640 содержит смесь аминокислот без L-Gln), которая дополнена 10% активированным L-глутамином при нагревании эмбриональной телячьей сыворотки, Hepes [2-(4-(2-оксиэтил)-1-пиперазино)-этансульфокислота] и стандартным антибиотиком. 50 мкл соответствующего испытуемого соединения в питательной среде и 100 мкл ВИЧ-1 в питательной среде (800 TCID 50/мл) (TCID 50 Tissue Culture Infections 50 доза, которая инфицирует 50% МТ-2 клеток) добавляют к 410³ экспоненциально растущих МТ-2 клеток в 50 мкл питательной среды на углубление на микротитрационном планшете с 96-тью отверстиями.

Параллельные смеси на другом микротитрационном планшете с клетками и испытуемым соединением получают 100 мкл питательной среды без вируса. После инкубации в течение 4 дней в 100 мкл надклеточной жидкости определяют активность (RT) обратной транскриптазы. RT-активность определяется в 50 mM Трис ,, -трис(оксиметил) -метиламин, сверхчистый, Merck, ФРГ; pH 7,8; 75 mM KCl, 2 mM дитиотреитола, 5 mM MgCl₂; 0,05% Nonidet P-40 (детергент, Сигма, Швейцария); 50 мкг/мл полиадениловой кислоты (Фармация, Швейцария); 1,6 мкг/мл dT (12 18) (Сигма, Швейцария). Смесь отфильтровывают через 0,45 Мк Acrodisc-фильтр (Gellman Science Inc. Ann Arbor) и хранят при 20^oC. К аликвотной доле этого раствора добавляют 0,1% (по объему) [альфа³²P]dTTP для достижения радиоактивной конечной активности 10 мкCi/мл. 10 мкл надосадочной культуры переносят на новый, с 96-тью отверстиями микротитрационный планшет и туда добавляют 30 мкл указанного RT-"коктейля". После смешения пластину (планшет) инкубируют 1,5 3 ч при 37^oC. 5 мкл этой реакционной смеси переносят на бумагу Ватман DE 81 (Ватман). Высушенные фильтры промывают 3 раза по 5 мин с помощью 300 mM NaCl/25 mM тринатрийцитрата и 1 раз с помощью 95% -ного этанола и снова высушивают на воздухе. Оценку осуществляют в Matrix Packard 96 Well Counter (Паккард). Значения ЭД₉₀ достигаются и определяются как самая низкая концентрация соответствующего испытуемого соединения, которая снижает RT-активность на 90% по сравнению с необработанным испытуемым соединением клеточными смесями. RT-активность при этом является мерой размножения ВИЧ-1.

Предлагаемые в изобретении соединения при этом показывают ЭД₉₀ примерно 10^-5 10^-8 M, предпочтительно примерно 510^-7 510^-8.

Данные, показывающие активность заявленных соединений.

Ингибирование in vitro ВИЧ-протеазы.

По аналогии с методом, описанным F.D.Richards et al. J. Biol. Chem. 265(14), 7733 7736, определяли способность нижеуказанных соединений согласно примерам на ингибирование ВИЧ-1-протеазы (полученной по способу S.Billich et al. J. Biol. Chem. 263(34), 17905 17908 (1990) в присутствии субстанции-аналога Icosa-пептиду RRSNQVSQNYPIVQNIQGRR (субстрат ВИЧ-1-протеазы, полученный пептидным синтезом по известным способам: J.Schneider et al. Cell 54, 363 368 (1988)), который соответствует месту расщепления gag-предшественника-протеина. Этот субстрат-аналог и продукт его расщепления анализировались количественно с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД).

Соответствующая испытуемая субстанция растворялась в диметилсульфоксиде. Ферментный тест проводился путем добавления пригодных растворителей испытуемой субстанции в 20 mM b-морфолиноэтанолсульфоновой кислоты (MES)-буфер, pH 6,0 к испытуемой смеси, которая содержала вышеуказанный Icosa-пептид (122 мкМ) в 20 mM MES-буфера, pH 6,0. Испытуемый объем на все компоненты составлял 100 мкл. Реакция начиналась в результате добавления 10 мкл раствора ВИЧ-1-протеазы и заканчивалась через 1 ч инкубирования при 37^oC в результате добавления 10 мкл О,3 M CHlO₄. После центрифугирования пробы в течение 5 мин при 10000г. 20 мкл полученного осадка поступали на Nucleosil C-18-5мк-ЖХВД-колонку (Machery Nagel, Duren, Германия). Нерасщекпленные Icosa-пептиды, так же как продукты расщепления, после колонны элюировались с помощью следующих градиентов: 100% элюент 1 > 50% элюент 1 + 50% элюент 2 (элюент 1: 10% ацетонитрила, 90% H₂O, 0,1% трифторуксусной кислоты; элюент 2: 75% ацетонитрила, 25% H₂O, 0,08% трифторуксусной кислоты) в течение 15 мин, скорость протекания 1 мл/мин. После элюирования продукты реакции количественно анализировались с помощью пика высоты продуктов расщепления при 215 нм.

Были получены следующие результаты (табл. 1).

Значение IC₅₀ показывает такие концентрации испытуемых соединений, при которых эти соединения проявляют половину максимального ингибирования.

Ингибирование in-vitro ВИЧ-инфекции в МТ-2-клетках культур МТ-2-клетки применялись так, как описано выше, но с использованием ED₁₀₀, то есть концентрации испытуемой субстанции, в которой больше не обнаруживали активности и остатков резервов транскриптазы в осадке инфицированных клеток. При этом были получены следующие данные для ингибирования ВИЧ-1-активности (измеренная как активность виральных ферментов резерва транскриптазы), табл. 2.

Анализ крови у мышей на содержание испытуемых соединений.

Титульное соединение согласно примеру 55 растворялось в диметилсульфоксиде в концентрации 240 мг/мл. Полученный раствор растворялся в 20% (мас. /объем) растворе гидроксипропил--циклодекстрина (в воде) до получения концентрации испытуемого соединения 12 мг/мл. Этот раствор с помощью зонда вводился женским особям мышей в дозе 120 мг/кг, через 30 мин после введения раствора мыши убивались и их кровь собиралась. Исследовали 3 или 4 животных. Кровь гепаринизировалась и подготавливалась для анализа по следующей методике: кровь депротеинировалась путем смешивания 1 объемной части крови с 1 частью ацетонитрила; после центрифугирования осадок исследовался с помощью резервной фазы ЖХВД: анализ проводился на Nucleosil C-18-ЖХВД-колонне(5 мк; Machery Nagel, Duren, Германия), заполненной мобильной фазой из 47% ацетонитрила в воде/0,1% трифторуксусной кислоты. Скорость протекания 1 мл/мин, детекция происходила при 215 нм. Стандарты для титульного соединения по примеру 55 разрабатывались аналогично и использовались для получения калибровочной кривой, которая применялась для определения концентраций соединения in vivo. Была установлена следующая концентрация: Концентрация (мкМ) в крови титульного соединения по примеру 55 Время после введения (мин) 2,08 30 Аналогично были определены следующие концентрации для следующих примеров (табл. 3).

Данные о токсичности соединений Испытанные соединения показали следующее: а) тест на мутагенез по Амсу мутагенез не наблюдался, б) в опытах на клетках с МТ-2-клетками цитотоксичность не наблюдалась, в) в опытах на мышах с испытанными соединениями токсичность не наблюдалась.

Активность и отсутствие токсичности заявленных соединений вытекает из представленных данных. Из этих данных следует, что соединения in vitro ингибируют ВИЧ-протеазу вирусов, вызывающих СПИД, препятствуют развитию инфекции, вызванной вирусом, в клетках и у мышей, дают удовлетворительные результаты анализов крови.

Соединения формулы I и соли соединений по меньшей мере с одной солеобразующей группой получаются известным способом, например: а) производное гидразина формулы (III): где остатки имеют вышеуказанные значения, подвергают взаимодействию с эпоксидом формулы (IV) где остатки имеют вышеуказанные значения, причем свободные функциональные группы, за исключением принимающих участие в реакции, в случае необходимости, защищены и их в случае необходимости отщепляют; или б) для получения соединений формулы I, где R₁ и R₉ обозначают алканоил, сульфонил, сульфамоил, который на азоте незамещен или замещен, имеющие вышеуказанные значения.

R₂ и R₈ обозначают водород, аминосоединение формулы (V) где остатки имеют вышеуказанные значения, конденсируют с кислотой формулы (VI): R₉ OH или реакционноспособными производными этой кислоты, где R₉ имеет вышеуказанные значения, причем свободные функциональные группы, за исключением принимающих участие в реакции, в случае необходимости, находятся в защищенной форме, и в случае необходимости затем отщепляют, или в) для получения соединений формулы I, где R₁ и R₉ обозначают алканоил, сульфонил, сульфамоил, который незамещен или замещен на азоте, имеющие вышеуказанные значения, R₂ обозначает водород, R₃ незамещенный или замещенный алкил, а остальные остатки имеют указанные значения, аминосоединение формулы (VII) где остатки имеют вышеуказанные значения, конденсируются с кислотой формулы (VIII): R₁ ОН или реакционноспособными производными этой кислоты, где R₁ имеет вышеуказанные значения, причем свободные функциональные группы, за исключением принимающих участие в реакции, в случае необходимости находятся в защищенной форме, и в случае необходимости эти защитные группы отщепляют; или г) для получения соединений формулы I, где R₁ и R₉ обозначают два одинаковых остатка, выбираемых из алканоила; сульфамоила, который на азоте не замещен или замещен, сульфонила, имеющих вышеуказанные значения; R₂ обозначает водород, R₃ незамещенный или замещенный алкил, а остальные остатки имеют указанные значения, диаминосоединение формулы (IX): где остатки имеют вышеуказанные значения, конденсируют с пригодной для введения идентичных остатков R₁ и R₉ кислотой или реакционноспособными производными этой кислоты, где R₁ и R₉ имеют вышеуказанные значения, причем свободные функциональные группы, за исключением принимающих участие в реакции, в случае необходимости находятся в защищенной форме, и в случае необходимости эти защитные группы отщепляют: или д) для получения соединения формулы I, где вместо R₇ находится остаток , который обозначает незамещенный или замещенный алкил, в соединение формулы (I'): где