Трансген для получения рекомбинантного полипептида в молоке трансгенных коров, способ получения трансгенной коровы (варианты), молоко от трансгенной коровы, пищевой состав

Трансген для получения рекомбинантного полипептида в молоке трансгенных коров, способ получения трансгенной коровы (варианты), молоко от трансгенной коровы, пищевой состав

Реферат

 

Использование: изобретение относится к продуцированию рекомбинантных полипептидов трансгенными коровами и способам получения трансгенных коров. Сущность изобретения: трансген для продуцирования рекомбинантного полипептида с молоком трансгенных коров различных пород включает по меньшей мере одну последовательность регуляции экспрессии, секреторную ДНК-последовательность, кодирующую секреторный сигнал, действующий в секреторных клетках молочных желез коровы, и рекомбинантную ДНК-последовательность, кодирующую рекомбинантные полипептиды. Способ получения трансгенных коров включает введение вышеуказанного трансгена в эмбриональную клетку-мишень коровы, трансплантацию образованной таким путем трансгенной эмбрионной клетки-мишени родительской корове-реципиенту и идентификацию по меньшей мере одной родившейся телочки, способной продуцировать рекомбинантный полипептид со своим молоком. Молоко от трансгенной коровы, содержащее рекомбинантный полипептид, продуцируемое трансгенной коровой, полученной согласно вышеописанному способу. Пищевой состав, включающий трансгенное молоко, содержащее рекомбинантный полипептид, продуцируемое трансгенной коровой. 5 с. и 30 з.п.ф-лы, 5 табл., 25 ил.

Изобретение относится к продуцированию рекомбинантных полипептидов трансгенными коровами и к способам получения трансгенных млекопитающих (кроме человека), обладающих целевым фенотипом.

Существует огромная литература, относящаяся к экспрессии гетерологичных генов в низших организмах, таких, как одноклеточные бактерии, дрожжи и нитевидные грибки, и в клетках высшего типа, таких, как клетки млекопитающих. Имеются также многочисленные сообщения о создании трансгенных животных, большинство которых относится к созданию трансгенных мышей. См. например, патент США N 4736866 (трансгенная мышь с активированным онкогеном); Andres A. et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1299 1303 (HA-RAS онкоген под контролем сывороточного кислотного белкового промотора); Schoenberger C.A. et al. 1987, Experientia, 43, 644 и (1988) J.EMBO, 1, 169 175 (C-myc онкоген под контролем сывороточного кислотного белкового промотора); и Muller W.J. et al. 1988, Cell, 54, 105 115 (C-myc онкоген под контролем вирусного промотора опухоли молочной железы мыши). Некоторыми лабораториями сообщалось о создании трансгенных свиней (Miller K.F. et al, 1989, J. Endocrin, 120, 481 488 (экспрессия гена человеческого или бычьего гормона роста в трансгенной свинье); Vize P.D. et al. 1988, J. Cell. Sci, 90, 295 300 (слитый ген свиного гормона роста в трансгенных свиньях) и Ebert K. et al. 1988, Mol. Endocrin. 2, 277 283 (слитый ген соматотропина MMLV-крысы в трансгенных свиньях), трансгенных овцах (Nancarrow et al. 1987, Theriogenology, 27, 263 (трансгенная овца с геном бычьего гормона роста); Clark A.J. et al. 1989, Bio/Technology 1, 487 482 и Simons J. et al. 1988, Bio/-Technology, 6, 179 183 (человеческий фактор IX и -1 антитрипсиновый CONA в овечьем организме) и кроликов (Hanover S.V. et al. 1987, Deutsche Tierarztliche Wochenschrift, 94, 476 478 (создание трансгенных кроликов инъекцией маточного-глобинового-промjтора-CAT, встроенного в оплодотворенные овоциты кролика). В ряде сообщений также предполагалось создание крупного рогатого скота (Wagner et al. 1984, Theriogenology, 21, 29 44), в одном из которых сообщалось о некоторых успехах в методах микроинъекций (Lohse J.K. et al. 1985, Theriogenology, 23, 205). Однако в получении трансгенных коров был достигнут незначительный успех. Научные статьи, в которых четко показано реальное создание трансгенных коров, способных продуцировать гетерологичный белок, в настоящее время неизвестны. И это несмотря на утверждение, что одна трансгенная корова была создана в Канаде и эта корова экспрессировала человеческий b-интерферон (Van Brunt, J. 1988, Bio/Technology, 6, 1149 - 1155) и что в одном из случаев достигнута переходная экспрессия человеческого a-фетопротеина в печени и крови (Church R.B. 1986, Biotechnology News Watch, 6, (15), 4). В одной из ссылок сообщается о том, что вирус бычьей папилломы, вероятно, был интегрирован, но не экспрессирован в трансгенной корове (Roschlau et al. 1988, Arch. Tierz. Berlin, 31, 3 8). В недавно появившейся статье суммированы успехи генной инженерии для домашнего скота (Pursel V.G. et al. 1989, Science, 244, 1281 1288).

Рядом лабораторий сообщалось о тканевоспецифичной экспрессии ДНК, кодирующей разнообразные белки в молочной железе, или продуцирование различных белков в молоке трансгенных мыши и овцы. Например, в работе Simmons J.P. et al. 1987, Nature, 328, 530 532 сообщается о микроинъекции геномного фрагмента в 16,2 kb, кодирующего b-лактоглобулин (БЛГ), включая 5'-последовательность в 4 kb, транскрипционное звено БЛГ в 4,9 kb и фланкирующую 3'-последовательность в 7,3 kb, в оплодотворенные яйца мыши. Согласно утверждениям авторов, БЛГ экспрессировался в молочных тканях, а продуцировался БЛГ с молоком трансгенной мыши в концентрации 3 23 мг/мл. Однако в случае встраивания в нетранслируемую 5'-область гена БЛГ кДНК, кодирующей человеческий фактор IX или человеческий a1-антитрипсин, и микроинъекции этой конструкции (Simmons J.P. et al. 1988, Bio/Technology, 6, 179 183), продуцирование фактора IX или 1-антитрипсина было значительно более низким (25 нг/мл для фактора IX и 10 мг/мл для 1-антитрипсина; см. Clark et al, 1989, Bio/Technology, 7, 487 492).

Имеется сообщение (Lee et al. 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1027 1041) о микроинъекции аналогичным способом в оплодотворенные овоциты мыши геномного клона в 14 kb, состоящего из полного крысиного -казеина в 7,5 kb, фланкирующей 5'-ДНК в 3,5 kb и фланкирующей 3'-ДНК. В этом случае, согласно сообщению, уровень экспрессии крысиного b-трансгена в лактирующей молочной железе трансгенной мыши находился в пределах 0,01 1% от эндогенного гена мышиного b-казеина.

Сообщается о продуцировании в молоке трансгенной мыши человеческого тканевого активатора плазминогена (т-ПА) на уровне 0,2 0,4 мкг/мл при экспрессии кДНК, кодирующей человеческий т-ПА, вместе с эндогенной секретирующей последовательностью под контролем 5'-последовательности в 2,6 kb гена мышиного сывороточного кислотного белка (Gordon K. et al. 1987, Bio/Technology, 5, 1183 1187). Последующие эксперименты с применением той же самой или аналогичной конструкции, как сообщается, показали продуцирование т-ПА у мышей разных линий в пределах от менее 20 нг т-ПА на мл молока до примерно 50 мкг/мл (Pittius C.W. et al. 1988, Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 85, 5874 5878).

В патенте США N 4873316 (выдан 10 октября 1989 г.) раскрыто применение 5'-последовательности из гена бычьего aS1-казеина, включающей сигнальный пептид казеина и несколько кодонов казеина, слитых со зрелой т-ПА последовательностью. Трансгенная мышь, созданная с помощью данного конструкта, согласно сообщению, продуцировала в своем молоке 0,2 0,5 мкг/мл т-ПА слитого белка.

Кроме того, в ряде патентных публикаций сообщается о направленном продуцировании специфичных белков в молоке трансгенных мышей и овец (cм. например, европейский патент N 0264166, опубл. 20 апреля 1988 г.) (поверхностный антиген гепатита В и т-ПА гена под контролем промотора сывороточного кислотного белка для специфической экспрессии в тканях молочной железы мыши PCT публикация N WO 86/00239, опубл. 14.01.1988 г.); РСТ публикация WO 88/01648, опубл. 10 марта 1988 г. (трансгенная мышь с молочными секреторными клетками, содержащими рекомбинантную систему экспрессии, включающую ген бычьего a-лактальбумина, слитый с интерлейкином-2); Европейский пат. N 0279582, опубл. 24 августа 1988 г. (тканево-специфичная экспрессия хлорамфениколацетилтрансферазы под контролем крысиного b-казеинового промотора в трансгенной мыши) и PCT публикация N WO 88/10118, опубл. 29 декабря 1988 г. (трансгенные мыши и овцы, имеющие трансген, кодирующий бычий aS1-казеиновый промотор и сигнальную последовательность, слитые с т-ПА).

При рассмотрении состояния вопроса в области трансгенной технологии становится очевидной необходимость способов, позволяющих эффективно создавать трансгенных млекопитающих, в особенности трансгенных млекопитающих, отличных от трансгенных мышей.

Кроме того, очевидна необходимость в способах создания трансгенных коров, которые способны продуцировать рекомбинантные полипептиды, такие, как человеческие молочные белки и человеческие сывороточные белки в молоке.

К тому же технический результат изобретения заключается в создании трансгенных коров, способных продуцировать рекомбинантные полипептиды, которые остаются внутри клеток или секретируются внеклеточно, а также коров, способных продуцировать в молоке рекомбинантные полипептиды, такие, как человеческие молочные белки и человеческие сывороточные белки.

Кроме того, изобретение позволяет получить от трансгенных коров молоко, содержащее рекомбинантные полипептиды, и создать пищевые составы с добавкой рекомбинантных полипептидов из молока трансгенных коров, например детского питания с добавкой человеческого лактоферрина.

В заявке описано создание трансгенов, благодаря которым в молоке трансгенных коров продуцируются рекомбинантные полипептиды.

Таким образом, изобретение включает трансгены для получения рекомбинантных полипептидов в молоке трансгенных коров. Получение такого молока трансгенных коров, содержащего один или несколько рекомбинантных полипептидов, желательно потому, что благодаря этому рекомбинантные полипептиды, полученные таким образом, вообще не требуют очистки для потребления человеком. Трансген включает секреторную ДНК-последовательность, кодирующую секреторную сигнальную последовательность, действующую в секреторных клетках молочной железы, представляющих интерес коров и рекомбинантную ДНК-последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид. Указанные последовательности связаны друг с другом с образованием рабочей последовательности: секреторная последовательность рекомбинантная ДНК. С последовательностью секреторная последовательность рекомбинантная ДНК эффективно связана по меньшей мере одна регуляторная последовательность, обеспечивающая экспрессию секреторных клеток молочной железы коров. Трансген конструируют с помощью секреторной последовательности, которая способна направлять ДНК, содержащую трансген, в секреторных клетках молочной железы коров. В результате подобной экспрессии образуется такая форма рекомбинантного полипептида, которая секретируется из секреторных клеток молочной железы коров в молоко трансгенных коров.

Изобретение раскрывает способы создания таких трансгенных коров. Способ включает введение вышеуказанного трансгена в эмбриональную целевую клетку коровы, трансплантацию полученной в результате трансгенной эмбриональной целевой клетки родителю-реципиенту и выявление из потомства по меньшей мере одной телочки, способной продуцировать в своем молоке рекомбинантный полипептид.

Изобретение, кроме того, включает молоко от таких трансгенных коров, содержащее рекомбинантные полипептиды, и пищевые составы, содержащие трансгенное молоко в жидкой или сухой форме, а также пищевые составы с добавкой одного или нескольких рекомбинантных полипептидов из указанного трансгенного молока.

Помимо вышеперечисленного, изобретение включает трансгены, способные продуцировать рекомбинантные полипептиды в молоке трансгенных коров. Такие трансгены характеризуются тем, что имеют регуляторные последовательности экспрессии, обеспечивающие экспрессию ДНК, кодирующей рекомбинантный полипептид, в конкретном типе клеток или тканей, например, человеческого сывороточного альбумина в печени трансгенных коров. Если рекомбинантный полипептид должен секретироваться из таких целевых клеток или тканей, тогда секреторная ДНК-последовательность, кодирующая секреторную сигнальную последовательность, действующую в конкретных целевых клетках или тканях, связывается с рекомбинантной ДНК-последовательностью, кодирующей рекомбинантный полипептид, например, при секретировании человеческого сывороточного альбумина из печени коровы в сердечно-сосудистую систему.

В заявке описаны способы создания трансгенных млекопитающих (кроме человека) с целевым фенотипом. Способ заключается в первоначальном метилировании трансгена, способного создать целевой фенотип при введении в клетки трансгенного животного, например, трансформированием приемлемой бактерии, такой, как E. coli MM 294 плазмидой, содержащей трансген. Метилированный трансген затем вырезают и вводят в оплодотворенные овоциты животного с осуществлением интеграции в геном. Овоциты затем выращивают до предимплантационного эмбриона с репликацией генома каждого оплодотворенного овоцита. После этого из каждого предимплантационного эмбриона извлекают по меньшей мере одну клетку, которую обрабатывают и выделяют содержащуюся в ней ДНК. Каждую выделенную ДНК затем обрабатывают эндонуклеазой рестрикции, способной отщеплять метилированный трансген, но неспособной отщеплять неметилированную форму трансгена, образованного после интеграции в геномную ДНК и ее репликации. Те предимплантационные эмбрионы, которые имеют интегрированный трансген, содержат ДНК, устойчивую к расщеплению эндонуклеазой рестрикции в области, включающей трансген. Такая устойчивость к гидролизу, которую можно обнаружить электрофорезом продукта гидролиза после PCR-амплификации ДНК и гибридизации с меченым зондом, облегчает выявление успешного трансгенеза.

Специфическое воплощение вышеприведенного способа обнаружения раннего трансгенеза осуществляется в способе получения популяции трансгенного потомства с одинаковым фенотипом. В данном способе метилированный трансген вводят в оплодотворенные овоциты, которые выращивают до предимплантационных эмбрионов. Затем каждый предимплантационный эмбрион делят с образованием первого и второго полуэмбриона. Каждый первый полуэмбрион анализируют вышеприведенным способом на трансгенез. После обнаружения успешного трансгенеза в по меньшей мере одном из первых полуэмбрионов второй необработанный полуэмбрион, содержащий интегрированный трансген, клонируют с образованием множества трансгенных клонов бластоцитов и полубластоцитов, каждый из которых характеризуется одним и тем же генотипом. После этого трансгенные эмбрионы трансплантируют одной или нескольким самкам-реципиентам с получением популяции трансгенных животных с одинаковым генотипом.

На фиг. 1-7 представлена ДНК (посл. ID N 1) и аминокислотная последовательность (посл. ID N 2) клона человеческого лактоферрина, происходящего из библиотеки кДНК молочной железы человека в том виде, в каком она приводится здесь, за исключением того, что последовательность между нуклеотидами 1557-1791 и 2050-2129 соответствует ранее опубликованной последовательности (Rado et al. 1987, Blood, 70, 989-993); на фиг. 8 9 - полная ДНК (посл. ID N 3) и аминокислотная последовательность (посл. ID N 4) человеческого лактоферрина, включая 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, а также полную сигнальную последовательность человеческого лактоферрина; на фиг. 10 карта рестрикции клона 5'-фланкирующей области гена бычьего aS1-казеина; на фиг. 11 карта рестрикции клона 3'-фланкирующей области гена бычьего aS1-казеина; на фиг. 12 14 конструкция pSI 3'5' CAT и pSI 5' CAT; на фиг. 15 pMN 1; на фиг. 16 21 конструирование векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие человеческий лактоферрин; на фиг. 22 геномная ДНК человеческого сывороточного альбумина, фрагменты, использованные для создания трансгенной мыши и содержащиеся в этой геномной ДНК, а также идентификация размеров фрагмента, которые должны быть получены в результате гидролиза геномной ДНК из трансгенной мыши рестрикционными ферментами BstE-II и Nco-I или Nco-I и Hindi-III; на фиг. 23 - альтернативный путь конструирования трансгена изобретения, кодирующего человеческий лактоферрин; на фиг. 24 конструирование плазмиды pPC, содержащей трансген, кодирующий белок C; на фиг. 25 ДНК-последовательность гибридного нитрона, применяемого при воплощении изобретения. Гибридная последовательность состоит из 5'-части интрона бычьего aS1-казеина и 3'-части интрона IgG. Местом стыка 5'- и 3'-части является HindIIIсайт.

"Млекопитающие (кроме человека)" означают всех млекопитающих, кроме человека, способных производить на свет "трансгенных млекопитающих (кроме человека)", имеющих "целевой фенотип". Подобные млекопитающие включают: приматов, кроме человека, мышей различных линий, коров различных пород, собак различных пород и так далее. Рекомендуемыми животными являются коровы, свиньи и овцы различных пород, наиболее предпочтительно коровы различных пород.

Целевые фенотипы для трансгенных млекопитающих включают, но без ограничения только ими: продуцирование рекомбинантных полипептидов в молоке самок трансгенных млекопитающих (кроме человека), продуцирование животных-моделей для изучения болезней, создание животных с более высокой сопротивляемостью к заболеваниям (например, заболеваниям молочной железы, таким, как мастит) и продуцирование рекомбинантных полипептидов в крови, моче или иных приемлемых биологических жидкостях или тканях животного. В рекомендуемых воплощениях изобретения описаны трансгенные коровы, способные продуцировать рекомбинантный человеческий лактоферрин, человеческий сывороточный альбумин и человеческий белок С в молоке лактирующих самок или человеческий сывороточный альбумин в печени трансгенного животного.

Трансгенных млекопитающих (кроме человека) получают введением "трансгена" в эмбриональную целевую клетку выбранного животного. В одном из аспектов изобретения трансген это ДНК- последовательность, способная создавать определенный фенотип при ее нахождении в клеточном геноме трансгенного млекопитающего (кроме человека). В специфичных воплощениях изобретения трансген представляет собой "рекомбинантную ДНК- последовательность", кодирующую "рекомбинантный полипептид". В таких случаях трансген способен экспрессировать рекомбинантный полипептид.

В применяемом здесь значении "рекомбинантный полипептид" (или кодирующая его рекомбинантная ДНК-последовательность) это либо "гетерологичный полипептид", либо "гомологичный полипептид". Гетерологичные полипептиды относятся к полипептидам, обычно не продуцируемым трансгенными животными. Примеры гетерологичных белков включают: человеческие молочные белки, такие, как лактоферрин, лизозим, секретируемые иммуноглобулины, лактоальбумин, стимулируемая липаза желчи и т.д. человеческие сывороточные белки, такие, как альбумин, иммуноглобулины, фактор VIII, фактор IX, белок C и т.д. и промышленные ферменты, такие, как протеазы, липазы, хитиназы и лигиназы из прокариотных и эукариотных источников. Последовательность рекомбинантной ДНК включает геномную или к-ДНК последовательность, кодирующую рекомбинантный полипептид.

При использовании рекомбинантных ДНК- последовательностей, кодирующих гетерологичные полипептиды, трансген может быть интегрирован в геном применяемых для трансгеноза животных произвольным образом. Как описано в примерах, трансгены, кодирующие человеческий лактоферрин, человеческий сывороточный альбумин и человеческий белок C, в сочетании с секреторной сигнальной последовательностью aS1-казеина под контролем последовательностей регуляции экспрессии aS1-казеина, были созданы для продуцирования и секретирования указанных гетерологичных полипептидов из молочной железы лактирующего млекопитающего в его молоко.

В применяемом здесь значении гомологичный полипептид это полипептид, эндогенный по отношению к конкретному трансгенному виду животного. Примеры эндогенных полипептидов для различных пород коров включают коровьи молочные белки, такие, как aS1, aS2, b- и k-казеин, b-лактоглобулин, лактоферрин, лизозим, холестерин-гидролаза, сывороточные белки, такие, как сывороточный альбумин и белковые гормоны, такие, как гормоны роста. При использовании ДНК- последовательности, кодирующей гомологичный полипептид, трансген рекомендуется вводить в геном применяемого для трансгенеза животного произвольным путем. Такое неупорядоченное введение дает трансгенное животное, которое имеет не только трансген, кодирующий эндогенный полипептид, но также и соответствующую эндогенную геномную ДНК- последовательность. Соответственно такое трансгенное млекопитающее (кроме человека) легко характеризуется увеличенным числом копий генов, кодирующих эндогенный полипептид. Кроме того, трансген, как правило, будет располагаться в положении, отличном от положения эндогенного гена.

При экспрессии ДНК, кодирующей полипептид, например, в коровах различных пород трансгенное животное отличается повышением количества гомологичного полипептида как в эндогенной ткани, так и в жидкости, в которой полипептид обычно обнаруживается, и/или присутствием гомологичного белка в ткани и/или биологической жидкости, в которых гомологичный полипептид либо обычно не содержится, либо продуцируется на значительно более низком уровне.

Так, например, коровья холестерин-гидролаза обычно присутствует в молозиве в первые 15 20 дней лактации. Этот природный эндогенный белок повышает вес теленка. Однако этот белок становится также гомологичным полипептидом, когда, например, его экспрессия в секретирующих клетках молочной железы осуществляется с помощью последовательностей регуляции экспрессии генов бычьего казеина, которые способствуют экспрессии гомологичного полипептида и за пределами обычного периода лактации. Таким образом, согласно одному из аспектов изобретения, экспрессия коровьей холестерин-гидролазы в молоке трансгенной коровы осуществляется рекомбинантной ДНК (либо кДНК, либо геномная ДНК) холестерин-гидролазы под контролем последовательностей регуляции экспрессии коровьего aSl-казеина. При использовании геномной рекомбинантной ДНК ее создают таким образом, что она обладает приемлемыми сайтами рестрикции (например, ClaI и SalI) у 5' и 3' конца структурного гена с тем, чтобы ее можно было встроить в соответствующую трансгенную геномную кассету (например, p-16 Kb, CS, приведенная в примере 15). Или же ДНК, кодирующую коровью холестерин-гидролазу и происходящую из кДНК, встраивают под контроль последовательности регуляции экспрессии коровьего aSl-казеина путем замены последовательностей человеческого лактоферрина в такой плазмиде, p 16, 8 HLF 3 (содержит гибридный интрон) или p16, 8 HLF 4 (содержит интрон гомологичного aSl-казеина). При использовании этих конкретных плазмид клон кДНК создают таким, что он обладает приемлемыми ClaI и SalI сайтами рестрикции с обоих концов рекомбинантной ДНК.

И еще один пример. Коровий лактоферрин обычно присутствует в коровьем молоке всего лишь в следовых количествах. Однако, если коровий лактоферрин экспрессируется под контролем других регуляторных последовательностей, например полученных из гена aSl -казеина, в молоке трансгенных коров лактоферрин присутствует в больших количествах. В другом примере трансген, включающий ДНК, кодирующую гомологичный бычий гормон роста, вводят в бычий геном для придания трансгенному животному более высоких ростовых характеристик. В других случаях гомологичные полипептиды включают, например, полипептид, который обычно у конкретных видов животных содержится внутри клеток, но который секретируется в молоко или иное внеклеточное пространство трансгенных видов животных, например в сердечно-сосудистую систему.

Каждый гетерологичный или гомологичный полипептид обладает характерной для него последовательностью аминокислот и нуклеиновых кислот. Необходимо указать, что такие последовательности включают их природные аллельные вариации и варианты, полученные рекомбинантными методами, в которых такие последовательности нуклеиновых кислот и полипептидные последовательности подвергаются модификации путем замещения, внедрения и/или делеции одного или нескольких нуклеотидов в таких нуклеиновых кислотах с целью вызвать замещение, вставку или делецию одного или нескольких аминокислотных остатков в рекомбинантном полипептиде.

Когда экспрессия ДНК трансгена необходима для создания целевого фенотипа, например для продуцирования рекомбинантного полипептида, в этом случае трансген обычно включает по меньшей мере 5', но предпочтительно дополнительно и 3' "последовательности регуляции экспрессии", каждая из которых эффективно связана с рекомбинантной или секреторно-рекомбинантной ДНК, определенных ниже. Подобные последовательности регуляции экспрессии, помимо регулирования транскрипции, вносят свой вклад в стабильность и обработку РНК по меньшей мере в той степени, в которой они также транскрибируются.

Такие последовательности регуляции экспрессии выбирают с целью создания тканево-специфичной или специфичной к клеточному типу экспрессии рекомбинантной или секреторно-рекомбинантной ДНК. После того как сделан выбор ткани или типа клетки для экспрессии, подбирают 5'- и, возможно, 3'- последовательность регуляции экспрессии. Как правило, такие последовательности регуляции экспрессии происходят из генов, которые экспрессируются в выбранной ткани или типе клетки. Рекомендуется, чтобы гены, из которых получены такие последовательности регуляции экспрессии, экспрессировались только по существу в нужных тканях или типах клеток, хотя вторичная экспрессия в другой ткани и/или клетках другого типа также приемлема, если эта экспрессия не оказывает неблагоприятного воздействия на трансгенное животное. Особенно рекомендуется использовать те последовательности регуляции экспрессии, которые эндогенны по отношению к подвергаемым обработке видам животных. Однако могут быть использованы также и последовательности регуляции экспрессии из других видов, например из генов человека. В некоторых случаях последовательности регуляции экспрессии и рекомбинантные ДНК-последовательности (геномные или кДНК) происходят из одного и того же источника, например обе происходят от коров или человека. В таких случаях последовательности регуляции экспрессии и рекомбинантная ДНК- последовательность гомологичны по отношению друг к другу. Или же последовательности регуляции экспрессии и рекомбинантные ДНК- последовательности получают от различных видов животных, например последовательность регуляции экспрессии от коровы, а рекомбинантная ДНК- последовательность от человека. В этом случае последовательность регуляции экспрессии и рекомбинантная ДНК-последовательность гетерологичны по отношению друг к другу. Ниже следует определение последовательности регуляции экспрессии из эндогенных генов. Сделанные определения также применимы к последовательностям регуляции экспрессии из неэндогенных гетерологичных генов.

В целом 5'-последовательность регуляции экспрессии включает транскрибируемую часть эндогенного гена в восходящем направлении от последовательности инициирования трансляции (5' нетрансляционная область, или 5' НТО) и те восходящие от нее фланкирующие последовательности, которые содержат функциональный промотор. В применяемом здесь значении "функциональный промотор" включает те необязательно транскрибируемые последовательности ДНК, которые обеспечивают связывание РНК-полимеразы с эндогенным геном с промотированием транскрипции. Такие последовательности обычно состоят из TATA-последовательности или рамки Хогнесса, как правило, расположенной за 25 - 30 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции. Рамку Хогнесса часто также называют проксимальным фактором. Во многих случаях промотор дополнительно включает один или несколько дистальных факторов, расположенных в восходящем направлении от проксимального фактора (рамки Хогнесса) и необходимых для инициации транскрипции. Такие последовательности промотора, как правило, содержатся в пределах первых 100 200 нуклеотидов, расположенных в восходящем направлении от сайта инициации транскрипции, но могут простираться и вплоть до 500 600 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции. Такие последовательности либо самоочевидны для специалиста, либо легко определяются стандартными методами. Подобные последовательности промотора сами по себе или в комбинации с 5' нетранслируемой областью называются здесь "проксимальные 5'- последовательности регуляции экспрессии".

Помимо таких проксимальных 5'-последовательностей регуляции экспрессии рекомендуется также, чтобы в трансген были включены дополнительно фланкирующие 5'-последовательности (далее называются "дистальными 5'-последовательностями регуляции экспрессии"). Такие дистальные 5'-последовательности регуляции экспрессии, как полагают, содержат один или несколько энхансеров и/или иных последовательностей, облегчающих экспрессию эндогенного гена и как следствие экспрессию рекомбинантной или секреторно-рекомбинантной последовательности ДНК, которая эффективно связана с дистальной и проксимальной 5'-последовательностями регуляции экспрессии. Размер дистальной 5'-последовательности регуляции экспрессии зависит от эндогенного гена, из которого происходит последовательность регуляции экспрессии. Однако, как правило, такие последовательности включают фланкирующие 5'-области примерно в 1 п.о. более предпочтительно в 16 п.о. и наиболее предпочтительно около 30 п.о. Oптимальный размер дистальной 5'-последовательности регуляции экспрессии, взятой из конкретного эндогенного гена, легко определяется изменением размера дистальной 5'-последовательности регуляции экспрессии с достижением максимальной экспрессии. В целом дистальная 5'-последовательность регуляции экспрессии будет не очень большой, чтобы не входить в примыкающий ген, и не будет включать ДНК- последовательности, неблагоприятно влияющие на уровень трансгенной экспрессии.

Кроме того, рекомендуется для усиления тканево-специфичной или специфичной к типу клеток экспрессии также включать 3'-последовательности регуляции экспрессии. Такие 3'-последовательности регуляции экспрессии включают 3'-проксимальные и 3'-дистальные последовательности регуляции экспрессии из соответствующего эндогенного гена. Проксимальная 3'-последовательность регуляции экспрессии включает транскрибируемую, но нетранслируемую ДНК, расположенную в нисходящем направлении от стоп-сигнала в рекомбинантной ДНК- последовательности (также называемой 3' нетранслируемой областью или 3' НТО). Подобные последовательности обычно оканчиваются у последовательности полиаденилирования (либо из эндогенного гена, либо из иного источника, такого, как SV 40) и у последовательностей, способных повлиять на устойчивость РНК. Как правило, 3' НТО состоит из 100 500 нуклеотидов в нисходящем направлении от трансляционного стоп-сигнала в гене, из которого регуляционная 3'-последовательность происходит. Дистальная 3'-последовательность регуляции экспрессии включает фланкирующие ДНК-последовательности в нисходящем направлении от проксимальной 3'- последовательности регуляции экспрессии. Некоторые из таких дистальных последовательностей транскрибируются, но не образуют часть мРНК, в то время как другие последовательности в этой дистальной 3'-последовательности регуляции экспрессии не транскрибируются вовсе. Подобные дистальные 3'-последовательности регуляции экспрессии, как полагают, содержат энхансер и/или другие усиливающие экспрессию последовательности. Полагают, что такие последовательности необходимы для эффективного полиаденилирования и содержат последовательности окончания транскрипции. Рекомендуется, чтобы подобные последовательности составляли примерно 2 kb, более предпочтительно 8 kb и наиболее предпочтительно около 15 kb от фланкирующей 3'-последовательности.

Хотя рекомендуется использование обеих 5'- и 3'-последовательностей регуляции экспрессии, тем не менее в некоторых воплощениях изобретения эндогенные 3'-последовательности регуляции экспрессии не применяют. В таких случаях для обеспечения полиаденилирования обычно применяют проксимальные 3'-последовательности регуляции экспрессии, обычно связанные с геномной ДНК, кодируемой рекомбинантной ДНК-последовательностью. Кроме того, могут быть также использованы дистальные регуляционные 3'-последовательности из геномной ДНК, кодирующей рекомбинантный полипептид, предпочтительно того же размера, что и у вышеуказанной эндогенной 3'-последовательности регуляции экспрессии. Необходимо указать, что в таких случаях кодируемый трансгеном рекомбинантный полипептид может включать либо геномную ДНК, либо происходящую из кДНК двунитевую ДНК. Как и в случае с 5'-последовательностями регуляции экспрессии, оптимальный размер 3'-последовательностей регуляции экспрессии может быть легко определен изменением размера фланкирующей 3'-последовательности с достижением максимальной экспрессии рекомбинантного полипептида. В целом дистальная регуляционная 3'-последовательность, происходящая или из эндогенного гена, или из гетерологичного гена, не будет простираться в примыкающий ген, из которого она происходит, и не должна включать какие-либо последовательности, оказывающие неблагоприятное воздействие на уровень трансгенной экспрессии.

Примеры последовательностей регуляции экспрессии приведены в табл. 1.

Рекомендуется, что помимо 5'- и 3'-последовательностей регуляции экспрессии и рекомбинантной ДНК (либо геномной, либо происходящей из кДНК) трансген изобретения также содержал "рекомбинантный интрон", который прерывает транскрибируемую, но не транслируемую 5'-область трансгена. Такие интроны могут происходить, например, из бычьего aS1-казеина и из человеческого лактоферрина. Такие применяемые здесь последовательности являются "гомологичными рекомбинантными интронами" в том, что 5'- и 3'- РНК сплайс-сигналы в таких рекомбинантных интронах те же, что и обычно обнаруживаемые в интроне из эндогенного или гетерологичного гена. Рекомбинантные интроны, однако, могут также представлять собой и "гибридный интрон". Такие гибридные интроны включают 5' РНК сплайс-сигнал и 3' РНК сплайс-сигнал из интронов различных источников. В отдельных аспектах изобретения такие гибридные интроны включают по меньшей мере одну "разрешающую РНК сплайс-последовательность". В применяемом здесь значении сигнал, разрешающий сплайсинг РНК, означает РНК сплайс-сигнальную последовательность, предпочтительно 3' РНК сплайс-сигнал из интрона, содержащийся в наборе фрагментов ДНК зародышевой линии, претерпевающей перегруппировку в ходе клеточной дифференциации. Примеры подобных генных наборов включают: иммуноглобулиновое супергенное семейство, в том числе иммуноглобулины и Т-клеточные антигенные рецепторы, а также набор генов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) и другие. К особенно рекомендуемым последовательностям, разрешающим сплайсинг, относятся те, которые получены из иммуноглобулинового набора, предпочтительно класса IgG и более предпочтительно те 3' сплайс-сигнальные последовательности, которые связаны с J C сегментной перегруппировкой тяжелых и легких цепей Ig, наиболее предпочтительно тяжелой цепи. Особенно рекомендуемая последовательность, разрешающая сплайсинг, состоит из той части последовательности, которая на фиг. 25 показана в нисходящем направлении от Hind III сайта. Рекомендуемый гибридный интрон состоит из полной последовательности, приведенной на фиг. 25, и включающей 5'-часть интрона из бычьего aS1-казеина и 3'-часть последовательности интрона тяжелой цепи IgG.

Такие гибридные интроны, содержащие сигналы, разрешающие сплайсинг РНК, рекомендуется применять, если рекомбинантная ДНК соответствует кДНК-последовательности. Как показано в примерах, при использовании 5'-последовательности регуляции экспрессии в 16 kb из гена aS1-казеина в сочетании c aS1-казеин-IgG гидридным нитроном для экспрессии кДНК человеческого лактоферрина, эффективно связанной с секреторной сигнальной последовательностью aS1-казеина, получена трансгенная мышь, продуцирующая примерно 1330 мкг/мл чЛФ в трансгенном молоке. Приведенное количество рекомбинантного полипептида заметно превосходит ранее сообщаемые количества продуцирования различных белков в молоке трансгенной мыши, которые обычно были меньше 10 мкг/мл, а в одном случае примерно 50 мкг/мл. И это также больше того максимума в 8 мкг/мл чЛФ, который продуцируется в нашем случае при использовании такого же трансгена, содержащего гомологичный бычий интрон, а не гибридный интрон.

Однако такие гибридные интроны не ограничиваются трансгенами, использующими кДНК- последовательности. Более того, гибридные интроны применимы также, когда рекомбинантный полипептид кодируется