Гликопротеин tcf-ii и фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество гликопротеина tcf-ii

Гликопротеин tcf-ii и фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество гликопротеина tcf-ii

Реферат

 

Использование: в биотехнологической промышленности и медицине. Сущность изобретения: получен гликопротеин TCF-II из культуральной среды фибробластов человека линии IMR-90 с помощью жидкостной хроматографии. Получена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество гликопротеина TCF-II. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 14 ил., 13 табл.

Изобретение относится к гликопротеину, полученному из культуральной среды фибробластов человеческого происхождения, и фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента данный гликопротеин.

Отвечающий изобретению гликопротеин, проявляющий цитотоксическую активность по отношению к различным линиям опухолевых клеток, но не по отношению к нормальным клеткам, представляет собой новый противоопухолевый цитотоксический фактор, способствующий дифференцировке лейкозных клеток, усиливающий реакции клеточного иммунитета, обеспечивающий рост клеток эндотелия сосудов и рост гепацитов. Он может быть использован в качестве противоопухолевого лекарственного препарата, например для терапии лейкозов, а также в качестве средства, усиливающего реакции клеточного иммунитета, заживляющего раны, восстанавливающего ткани печени и т.д. и, кроме того, в качестве биохимического или фармакологического агента.

Примером биологически активного соединения может служить, например, бета-интерферон, являющийся противоопухолевым цитотоксическим фактором, который получают из фибробластов человеческого происхождения. Это вещество представляет собой гликопротеин, секретируемый фибробластами при их культивировании и стимуляции поли 1-полис и вирусом Сендай. Было установлено, что помимо антивирусного и противоопухолевого действия указанный протеин проявляет и различные другие виды биологической активности. Другим примером может служить полученный из фибробластов противоопухолевый цитотоксический гликопротеин, названный CBF, который описан в выложенной заявке Японии N 58-146293. В другой выложенной заявке Японии N 61-33120 описан подавляющий рост опухолей фактор 1NF с молекулярной массой 35000-45000 Da получаемый при очистке культуральной среды фибробластов человеческого происхождения.

Кроме того, в выложенных заявках Японии NN 61-56131, 61-1872, 62-103021 соответственно описаны: вещество, напоминающее фактор некроза опухолей, получаемое при очистке культуральной среды фибробластов; фактор FNF некроза опухолей, получаемый из фибробластов, а также проявляющее цитотоксическую активность биологически активное вещество, получаемое из клеток фибробластов животного происхождения, с молекулярной массой 40000-50000 Da и изоэлектрической точкой порядка 5,00,5. Далее, в выложенной заявке Японии N 64-10998 описана вся последовательность аминокислот, а также нуклеотидов комплементарной ДНК (кДНК), кодирующей данную последовательность аминокислот противоопухолевого цитотоксического фактора, получаемого из культуральной среды фибробластов человеческого происхождения и имеющего молекулярную массу 360001000 и изоэлектрическую точку более 10,5.

В изобретении исследовали биологически активное соединение, содержащееся в культуральной среде фибробластов человеческого происхождения, и обнаружили гликопротеин, проявляющий разнообразную биологическую активность и отличающийся от веществ, известных ранее, по величине молекулярной массы, значению изоэлектрической точки и т.п.

Таким образом, технический результат изобретения заключается в получении нового гликопротеина и фармацевтической композиции, содержащей данный гликопротеин.

Новый гликопротеин, полученный из фибробластов человеческого происхождения согласно изобретению и называемый TCF-II, характеризуется следующими физиологическими свойствами.

а. Молекулярная масса, измеренная с помощью гельэлектрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, составляет 780002000 Da или 740002000 Da в невосстанавливающих условиях, причем общую полосу A (520002000 Da) дополняет одна из двух следующих полос: B (300002000 Da) или полоса C (260002000 Da) в восстанавливающих условиях.

б. Изоэлектрическая точка: 7,4-8,6.

в. Термостабильность: гликопротеин стабилен при нагревании до 60^oC в течение 10 мин.

г. Стабильность по отношению к pH: гликопротеин стабилен в интервале pH 6-9.

д. Имеет в своем составе углеводную цепочку: наблюдается адсорбция вещества на колонке с сефарозой и конканавалином A.

е. Биологическая активность: гликопротеин подавляет рост опухолевых клеток KB, HeLa, L-929, но не нормальных клеток 1 MR-90.

ж. Реакция с антителами: не наблюдается нейтрализации цитотоксической активности гликопротеина такими антителами, как анти-TN, анти-лимфотоксин и анти-бета-интерферон.

Кроме того, согласно изобретению, TCF-II, помимо приведенных выше физико-химических свойств, обладает также следующими особенностями: з. Последовательность аминокислот N-концевого участка: упомянутые выше полосы B и C являются субцепями полосы A, следовательно, N-концевой участок полосы A блокирован. Полосы B и C имеют следующую последовательность аминокислот N-концевого участка: Val-Val-Asn-Gly-lLe-Pro-Thr- или Val-Val-Asn-Gly-lLe-Pro-Thr-X-Thr-Asn-lLe-Gly-X-Met-Val-Ser-Leu-, где X означает неустановленную аминокислоту.

и. Аминокислотный состав: при гидролизе вещества в присутствии соляной кислоты выявляется следующий аминокислотный состав (см. табл. 1).

Способ получения нового гликопротеина TCF-II, обладающего указанными физико-химическими свойствами, состоит в следующем.

Согласно изобретению, предлагаемое вещество образуется в клетках фибробластов человеческого происхождения. Подходящими клетками являются клетки фибробластов легких, почек и крайней плоти эмбриона человека. Для осуществления изобретения наиболее пригодны клетки 1MR-90 (ATCC CCL 186), W1-38 (ATCC CCL 75) и т.п.

Указанные клетки выращивают в обычной среде с добавлением сыворотки или же не содержащей сыворотки. Примером такой среды может служить среда DMEM, содержащая 5% бычьей (телячьей) сыворотки. В указанную среду при необходимости добавляют аминокислоты, трансферрин, жирные кислоты и гормоны, например, инсулин.

Клетки выращивают в среде методом стационарного культивирования с использованием T-колбы, культивирования во взвешенном состоянии с использованием микроносителей и методом непрерывного культивирования при использовании полых волокон или керамических носителей. Предпочтительно культивирование в атмосфере 5% CO₂ при 20-37^oC и смене среды через каждые 2-3 дн. После того, как плотность клеток достигает оптимума, среду меняют (1 раз в течение 7-10 сут) и собирают использованную. Из собранной культуральной среды выделяют искомый гликопротеин.

Культуральную среду подвергают ультраконцентрированию при использовании мембраны с размером пор 6000. Далее гликопротеин, содержащийся в УФ-концентрате, адсорбируют на катионообменной смоле, а затем вымывают его из смолы буферным раствором, содержащим 0,3-0,6 M KCl. Примером ионообменной смолы может служить смола CM Sephadex C-50 (производство фирмы Pharmacia). Фракции, способные проявлять цитотоксическую активность, собирают, а затем выделяют из них гликопротеин методом афинной хроматографии. Наиболее подходит для этой цели Конканавалин A-сефароза (КонA-сефароза). Аффинную колонку уравновешивают буферным раствором на основе 0,05 M Tris-HCl (при pH 7,0), содержащим 0,5 M NaCl, а затем на колонку наносят вышеуказанные фракции. После промывания колонки уравновешивающим буферным раствором активное вещество элюируют из колонки вымывающим буферным раствором, содержащим углевод, соответствующий углеводной цепочке, закрепляющей на аффинной колонке искомый гликопротеин. При использовании КонA-сефарозы активное вещество вымывают буферным раствором, содержащим альфа-метил-D-маннопиранозид. Соответствующую фракцию диализуют против воды и лиофилизируют. Лиофилизированное активное вещество растворяют в буферном растворе на основе 0,05 M Tris-HCl при pH 6,0-7,0, содержащем 0,2 M HCl, а затем очищают на мощной катионообменной колонке Mono S фирмы Pharmacia методом жидкостной хроматографии при повышенном давлении. Элюирование активного вещества из колонки Mono S проводят при градиенте концентрации NaCl 0-0,1 M и собирают нужные фракции.

Предлагаемое соединение элюируют при содержании солей 0,6-0,9 М. Полученную таким образом фракцию подвергают дальнейшей очистке путем аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы производства фирмы Pharmacia. Элюирование активного вещества из колонки с гепарин-сефарозой проводят при градиенте NaCl от 0,3 до 2,0 M и солевом насыщении 1,0 1,5 M.

Для полученного таким образом и предлагаемого гликопротеина TCF-II характерны следующие виды биологической активности.

1. Противоопухолевая активность.

TCF-II подавляет рост таких опухолевых клеток человеческого происхождения, как KB, HeLa, MCF-7 и BG-1, а также проявляет цитотоксическую активность по отношению к клеткам L-929 мыши и опухолевым клеткам Sarcoma 180, Meth A Sarcoma и F388, но не подавляет рост нормальных клеток человеческого происхождения, например, клеток 1MR-90.

2. Активность, индуцирующая дифференцировку клеток лейкоза.

TCF-II индуцирует дифференцировку клеток лейкоза человека линии HL-60 в сторону гранулоцитов.

3. Активность, усиливающая реакции клеточного иммунитета.

TCF-II стимулирует рост цитотоксических T-клеток человека.

4. Активность, стимулирующая рост клеток эндотелия сосудов.

TCF-II стимулирует рост эндотелиальных клеток стенок кровеносных сосудов.

5. Активность, стимулирующая рост гепатоцитов.

TCF-II стимулирует рост гепатоцитов у взрослых крыс.

Указанные виды активности проявляются при весьма малых дозах соединения, порядка 1-1000 нг/мл.

Фармацевтическим продуктом, отвечающим изобретению, могут быть: противоопухолевое лекарство, лекарство против лейкоза, лекарство, усиливающее реакции клеточного иммунитета, лекарство, заживляющее раны, а также лекарство против заболеваний печени, в том числе восстанавливающее функцию печени и т. д. Однако биологически активный фактор TCF-II, представляющий собой гликопротеин со значительной молекулярной массой, легко адсорбируется на стенках сосудов из полипропилена и т. д. например, на стенках инъекционных шприцев, стеклянных сосудов и т. п.

Кроме того, TCF-II является нестабильным веществом. Под влиянием температуры, влажности и т. д. активность TCF-II значительно снижается, то есть он легко утрачивает свои свойства. Следовательно, требуется выпуск стабильного фармацевтического продукта. В соответствии с этим в изобретении предложена фармацевтическая композиция на основе TCF-II, содержащая в качестве агентов, предотвращающих адсорбцию, один или более белков и неионных детергентов, а в качестве стабилизирующих агентов одно или более таких соединений, как белки, углеводы и аминокислоты, или же содержащая в сочетании один или более агентов, предотвращающих адсорбцию, и один или более стабилизирующих агентов.

Фармацевтическую композицию, отвечающую изобретению, можно использовать в лиофилизированной форме, а также в виде жидкости или порошка при условии, что в фармацевтическую композицию включены упомянутые выше агенты, предотвращающие адсорбцию, и стабилизирующие агенты. Предлагаемый согласно изобретению биологически активный гликопротеин TCF-II может быть получен из культуральной среды фибробластов человека.

Согласно изобретению в качестве агента, предотвращающего адсорбцию, можно использовать такие белки, как альбумин и желатин, и такие неионные детергенты, как Твин-80 и Твин-20.

Согласно изобретению в качестве стабилизирующих агентов можно использовать такие белки, как альбумин, желатин и т. д. такие углеводы, как сорбитол, маннитол, ксилитол и т. д. такие аминокислоты, как глицин и аланин. Подходящие количества белков, используемых в качестве агентов, предотвращающих адсорбцию, составляют более 0,1% предпочтительно от 0,1 до 20% а подходящие количества неионных детергентов составляют более 0,001% предпочтительно 0,001-1,0% Подходящие количества белков, применяющихся в качестве стабилизирующих агентов, составляют более 0,1% предпочтительно 0,1-20,0% подходящие количества углеводов составляют 5-40% а подходящие количества аминокислот превышают 1% При совместном использовании одного или более агентов, предотвращающих адсорбцию, с одним или более стабилизирующим агентом вводимые количества данных соединений должны находиться в указанных интервалах. Можно использовать необходимые количества агентов, предотвращающих адсорбцию и стабилизирующих агентов путем их растворения и перевода в водные растворы с подходящими значениями концентрации и pH. Отношения величин давления проницаемости для этих растворов находятся в интервале 0,1-3,1, предпочтительная величина отношения составляет 1,0. Так как TCF-II стабилен в интервале pH 6-9, то величину pH водного раствора в рецептуру фармацевтической композиции следует отрегулировать в интервале pH между 6 и 9.

Предотвращение адсорбции и стабильность TCF-II в фармацевтической композиции, отвечающей настоящему изобретению, более подробно освещены ниже в описании соответствующих экспериментов.

На фиг. 1 представлены профили элюции TCF-II и активатора плазминогена из культуральной среды клеток lMR-90, содержащей 5% телячьей сыворотки при использовании хроматографической колонки C-50, заполненной сефадексом CM. Цифрами 1 и 2 отмечены фракции, элюируемые буферным раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,03 M NaCl, и буферным раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,6 NaCl.

Пустые кружки означают поглощение при 280 нм, черные активность активатора плазминогена и наполовину закрашенные цитотоксическую активность по отношению к клеткам L 929-18, соответственно.

На фиг. 2 показаны результаты аффинной хроматографии при использовании Конканавалина A фракции TCF-II, элюируемой буферным раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,6 M NaCl), на хроматографической колонке с 6 M сефарозой C-50, заполняемой культуральной средой клеток 1MR-90. Цифрами 1 и 2 обозначены фракции, отмытые буферным раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,5 M NaCl, и фракции, отмытые буферным раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,5 M NaCl и 0,3 M альфа-метил-D-маннопиранозида.

Черными и наполовину закрашенными кружками отмечены поглощение при 280 нм и цитотоксическая активность, соответственно.

На фиг. 3 показан профиль элюции, полученный методом жидкостной хроматографии при повышенном давлении (MonoS) для фракции TCF-II, выделенной аффинной хроматографией при использовании КонаA-сефарозы.

Кружками отмечена цитотоксическая активность.

На фиг. 4 показан профиль элюции TCF-II, полученный аффинной хроматографией при использовании гепарин-сефарозы для элюата, вымываемого из колонки с помощью жидкостной хроматографии под повышенным давлением (MonoS). Цифрами 1 и 2 соответственно обозначены: фракция, отмытая буферным раствором 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), содержащим 0,3 M NaCl, и отмытая при градиенте концентрации NaCl от 0,3 до 2,0 M.

Черными и наполовину закрашенными кружками соответственно обозначены: поглощение при 280 нм и цитотоксическая активность.

На фиг. 5 показаны данные электрофореза с додецилсульфатом натрия фактора TCF-II (восстанавливающие и невосстанавливающие условия).

На фиг. 6 представлены данные по термостабильности TCF-II.

На фиг. 7 показана стабильность TCF-II по отношению к pH.

На фиг. 8 показаны данные по цитотоксической активности TCF-II по отношению к линиям опухолевых клеток человека, полученные in vitro.

На фиг. 9 показаны данные цитотоксической активности TCF-II по отношению к клеткам Sarcoma-180.

На фиг. 10 представлены данные по активности TCF-II по отношению к клеткам Meth A и F388, соответственно (черные и незакрашенные кружки).

На фиг. 11 показаны данные по цитотоксической активности TCF-II по отношению к линиям опухолевых клеток в организме человека. Черными кружками обозначена карцинома яичников BG-1, а незакрашенными карцинома груди MCF-7.

На фиг. 12 и 13 показаны данные по влиянию TCF-II на включение H³-тимидина в лимфоциты в смешанной культуре через 5 и 8 сут, соответственно. Исследовали соответственно шесть 5- и 8-суточных проб. Результаты представлены как среднее значение стандартное отклонение.

На фиг. 14 показаны данные по стимулирующему эффекту TCF-II на рост клеток HUVEC эндотелия сосудов.

Пример 1.

(1) Культура фибробластов человека 1MR-90.

В роллерный флакон, заполненный 100 мл среды DMEM, содержащей 5% телячьей сыворотки, вносят клетки 1MR-90 (ATCC CCL 186) фибробластов человека в количестве 3 млн. клеток. Культуру клеток выращивают в течение 7 сут, при вращении флакона с частотой 0,5-2 об./мин. Когда общее число клеток достигает 10 млн. их собирают путем обработки трипсином на дне флакона. После добавления во флакон 250 мл свежей среды DMEM, содержащей 5% телячьей сыворотки, в этот же флакон, содержащий суспензию клеток, насыпают 100 г прошедших автоклавную обработку керамических бус с размерами частиц 5-9 меш (производство фирмы Toshiba Ceramic Co Ltd). Далее клетки выращивают при 37^oC в течение 24 ч. Затем во флакон наливают 250 мл среды DMEM, содержащей 5% телячьей сыворотки, так, чтобы окончательный объем среды составил 500 мл, и продолжают культивирование. Каждые 7-10 сут всю жидкую среду (около 500 мл) отбирают и заливают свежую среду в количестве 500 мл. В таких условиях наработку продукта продолжают в течение 2 мес. Только с одного роллерного флакона 41 раз собирают культуральную среду. Удельная активность полученной таким образом среды составляет 32 ед.мл.

(2) Очистка гликопротеина TCF-II.

Полученную, как описано на стадии 1, культуральную среду в количестве 75 л концентрируют приблизительно в 10 раз методом ультрафильтрации при использовании мембраны Amicon с размером пор около 6000. После того, как колонку C-50, заполненную CM-Сефадексом, уравновешивают буферным раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), к сконцентрированной среде добавляют 1,5 кг смолы (сырая масса). При этом происходит абсорбция активного вещества смолой в условиях легкого перемешивания при 4^oC в течение 24 ч при pH 6,5-7,0. После абсорбции смолу фильтруют через бумажный фильтр Whatman N 2. Затем смолу промывают буферным раствором с 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0). Промытой смолой в количестве около 1500 г заполняют колонку диаметром 7 см и высотой 40 см, после чего промывают колонку буферным раствором с 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,01% Твин-20 и 0,3 M NaCl. Элюцию белка контролируют измерением поглощения при 280 нм. Когда белок элюируется почти полностью, дальнейшую элюцию проводят при концентрации NaCl 0,6 M. Для каждой фракции определяют цитотоксическую активность по отношению к клеткам L 929-18, а также активность вырабатываемого клетками lMR-90 активатора (плазминогена тканевого типа (t-PA). Полученные профили элюции представлены на фиг. 1. Фракция, элюированная при концентрации NaCl 0,6 M, проявляет потенциальную цитотоксическую активность. Установлено, что эта фракция представляет собой TCF-II. Далее КонA-сефарозу CL-6 B (производство фирмы Pharmacia) уравновешивают буферным раствором с 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,5 M NaCl, и полученным гелем заполняют колонку диаметром 2,5 см и высотой 8 см. Колонку тщательно промывают тем же самым буферным раствором и наносят на нее фракцию TCF-II, полученную на колонке с CM-Сефадексом. После этого колонку вновь промывают буферным раствором с 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,5 M NaCl и взятым в количестве, десятикратно превышающим объем колонки. Затем активное вещество элюируют раствором 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,5 M NaCl и 0,3 M альфа-метил-D-маннопиранозида, при скорости потока 70 мл/ч. Элюцию белка контролируют измерением оптического поглощения при 280 нм, причем в каждой фракции определяют цитотоксическую активность. Полученные профили элюции представлены на фиг. 2. Фракцию, элюированную первой, собирают и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 48 ч. В результате лиофилизации подвергнутой диализу фракции, получают белый порошок. Этот лиофилизированный порошок растворяют в небольшом количестве буферного раствора с 0,05 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащего 0,01% Твина-20 и 0,2 M NaCl. Полученным раствором заполняют колонку Mono S (производство фирмы Pharmacia) для проведения жидкостной хроматографии под повышенным давлением. Колонку уравновешивают 0,01 M фосфатным буферным раствором (pH 7,0), содержащим 0,01% Твина-20. После промывания колонки 0,01 M фосфатным буферным раствором (pH 7,0), содержащим 0,01% Твина-20, в течение 20 мин при скорости потока 0,5 мл/мин осуществляют элюцию активного вещества в течение 60 мин при градиенте концентрации NaCl от 0 до 1,0 M. Полученный при этом профиль элюции показан на фиг. 3. Активную фракцию элюируют при концентрации NaCl 0,76 M. Далее активную фракцию собирают и разбавляют уравновешивающим буферным раствором, после чего вновь наносят на колонку Mono S для жидкостной хроматографии под повышенным давлением. Затем снова проводят элюцию тем же самым буферным раствором при градиенте концентраций NaCl 0-1,0 M. Гепарин-сефарозу (производство фирмы Pharmacia) уравновешивают буферным раствором с 10 мМ Tris-HCl (pH 7,0), содержащим 0,3 M NaCl, после чего 5 мл геля заполняют колонку диаметром 1,0 см и высотой 7 см. После жидкостной хроматографии под повышенным давлением на колонке Mono S активную фракцию собирают и разбавляют буферным раствором с 0,01 M Tris-HCl (pH 7,0) до концентрации NaCl 0,3 M и наносят на приготовленную, как указано выше, колонку. Далее колонку промывали солянокислым буферным раствором, объем которого десятикратно превышает рабочий объем колонки. Активное вещество элюируют при скорости потока 20 мл/ч тем же самым буферным раствором при градиенте концентрации NaCl 0,3-2,0 M. Соответствующий профиль элюции показан на фиг. 4. Таким образом получают чистый гликопротеин. Как показано в табл. 2 и 3 из 75 л исходной культуральной среды получают 0,12 мг активного гликопротеина. Полученный гликопротеин является цитотоксическим (по отношению к клеткам опухоли) фактором и обладает специфической активностью, равной 5248000 ед./мг.

Ниже приведены физико-химические свойства гликопротеина TCF-II, полученного согласно приведенной выше методике.

(1) Определение молекулярной массы методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS).

Молекулярную массу TCF-II определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем 0,1% SDS. При этом обнаруживаются полосы, соответствующие молекулярным массам 78000 и 74000. В том случае, когда гликопротеин восстанавливают 2-меркаптоэтанолом и затем проводят электрофорез, наблюдаются три полосы, соответствующие массам 52000, 32000 и 28000 (фиг. 5).

Эти результаты показывают, что TCF-II представляет собой гетеродимер, состоящий их субъединицы с молекулярной массой 52000 и субъединицы с молекулярной массой 28000 или 32000.

(2) Изоэлектрическая точка.

Значение изоэлектрической точки гликопротеина TCF-II устанавливают в пределах 7,4-8,55 методом изоэлектрического фокусирования с использованием препарата Phast Gel IEF 3-9.

(3) Термостабильность.

Фактор TCF-II с активностью 51 2000 ед./мл добавляют к буферному раствору на основе 0,1 M Tris-HCl (pH 7,0), содержащему 0,01% Твина-20. Таким образом был приготовлен раствор TCF-II с активностью 512 ед./мл. Этот раствор подвергают термообработке в течение 10 мин при 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90 и 95^oC. Остаточную цитотоксическую активность (ед./мл) после обработки при каждой температуре оценивают в виде относительной активности (%) по отношению к принятой за 100% цитотоксической активности (ед./мл) при 25^oC (эталонная проба). Как показано на фиг. 6, гликопротеин сохраняет стабильность вплоть до 60^oC.

(4) Стабильность по отношению к pH.

Готовят буферные растворы, содержащие 0,01% Твина-20, состав которых представлен в табл. 6. В каждом буферном растворе растворяют TCF-II в количестве, соответствующем (при pH 8) активности 51 200 ед./мл. Растворы выдерживают при 37^oC в течение 1 ч. Далее определяют относительную активность (% ) в сравнении с эталонной пробой (1 ч при комнатной температуре). Как показано на фиг. 7, гликопротеин сохраняет стабильность в интервале pH 6-9 (см. табл. 4).

(5) Состав аминокислот.

Гликопротеин TCF-II в количестве 10 мкг анализируют с помощью набора BioRad Protein Assay и подвергают гидролизу в присутствии соляной кислоты. Затем аминокислотный состав TCF-II определяют на анализаторе модели L-8500 (производство фирмы Hitachi).

Состав аминокислот гликопротеина TCF-II приведен выше в табл. 1.

Пример 2. В данном примере показана цитотоксическая активность гликопротеина TCF-II, полученного, как описано в примере 1, по отношению к опухолевым клеткам.

(1) Подавление роста опухолевых клеток.

Готовят препараты опухолевых клеток человека линий HeLa и KB, а также нормальных диплоидных клеток человека 1MR-90 в виде суспензии плотностью 100 тыс. клеток в 1 мл среды DMEM, содержащей 10% FCS. Клеточными суспензиями в количестве 59 мкл заполняют все 90 лунок микроплаты (производство фирмы Falcon). Во все лунки, содержащие клеточные суспензии, добавляют по 50 мкл раствора, полученного разбавлением исходного раствора TCF-II с активностью 5,120 ед. /мл средой DMEM в 10, 20, 40, 80 и 160 раз. Смеси культивируют в термостате в атмосфере CO₂ при 37^oC в течение 3 сут. Выжившие клетки в каждой лунке фиксируют и окрашивают добавлением в 50 мкл 0,5%-ного раствора кристаллического фиолетового в смеси метилового спирта и воды (1:4). Далее каждую лунку промывают дистиллированной водой и высушивают. Краситель удаляют из каждой лунки серенсоновским буферным раствором. Поглощение экстрактов при 570 нм измеряют с помощью микротитровального спектрофотометра.

Подавление роста клеток (%) гликопротеином TCF-II определяют путем сравнения с контрольной группой проб, не содержащих TCF-II, и строят график зависимости данного процентного показателя от концентрации TCF-II. Как показано на фиг. 8, TCF-II подавляет рост клеток KB и HeLa, но в то же время он не подавляет роста нормальных клеток 1MR-90.

(2) Взаимодействие с антителами.

Гликопротеин TCF-II растворяют в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, до получения концентрации 320 ед./мл. В этот раствор добавляют антитело к лимфотоксину (ЛТ), нейтрализующее 1000 ед./мл ЛТ, затем смесь выдерживают при 37^oC в течение 1 ч. Аналогично в раствор TCF-II добавляют антитело к фактору некроза опухолей и антитело к -интерферону в концентрациях 1 млн. ед.мл и 1 тыс. ед./мл, соответственно. Антитела, используемые в данном эксперименте, имеются в свободной продаже.

По завершении реакции оценивают цитотоксическую активность TCF-II. Ни одно из антител не нейтрализует данный вид активности TCF-II.

Пример 3. В данном примере показана цитотоксическая активность гликопротеина TCF-II, полученного, как описано в примере 1, по отношению к различным линиям опухолевых клеток мыши.

Выбирают линии опухолевых клеток мыши Sarcoma 180, Meth A Sarcoma и F-388. Препарат клеток Sarcoma 180 готовят в виде суспензии в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, а суспензию клеток Meth A и F-388 с концентрацией 20 тыс. клеток в 1 мл готовят на среде RPM1 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. По 50 мкл каждой клеточной суспензии добавляют в лунки 96-луночной микроплаты (производство фирмы Falcon). Гликопротеин TCF-II растворяют в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, в случае клеток Sarcoma 180 и в среде RPM1 1640, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, в случае клеток Meth A и F-388. Раствор TCF-II готовят в виде аликвот по 50 мкл каждого таким образом, чтобы итоговые концентрации TCF-II составляли 0, 2, 4, 8, 16, 31, 62, 125, 250, 500 и 1000 нг/мл, соответственно. Аликвоты добавляют во все лунки, содержащие клеточные суспензии. Далее клетки культивируют в термостате в атмосфере CO₂ при 37^oC в течение 3 сут. Клетки в каждой лунке окрашивают "трипановым синим". Число выживших клеток подсчитывают с помощью гемоцитометра и определяют как среднее значение результатов, полученных в двух экспериментах. Цитотоксическую активность A (%) вычисляют по формуле: A [(N_с N)/N]100, где N_с среднее число выживших клеток в контроле (кл./мл); N среднее число выживших клеток при добавлении TCF-II (кл./мл).

Показатели цитотоксической активности TCF-II по отношению к клеткам Sarcoma 180, а также по отношению к клеткам Meth A Sarcoma и F-388 представлены на фиг. 9 и 10, соответственно.

Все линии клеток оказались весьма чувствительными к TCF-II: значения IC для цитотоксической активности TCF-II по отношению к клеткам Sarcoma 180, Meth A и F-388 составляют соответственно 6, 40 и 460.

Мышиные клетки L-929 (ATCC CCL 1) субклонируют и отбирают субклон с наибольшей чувствительностью к TCF-II. Таким образом получают клон L-929-18 с высокой чувствительностью по отношению к цитотоксическому фактору опухолевых клеток.

Клетки L-929-18 выращивают до состояния монослоя в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, после чего клетки собирают, обрабатывая монослой трипсином. Далее получают суспензию клеток с плотностью 600 тыс. клеток в 1 мл в среды DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и актиномицин D в концентрации 1 мкг/мл. Затем 50 мкл среды DMEM, приготовленной точно так же, как и клеточная суспензия, добавляют в каждую лунку 96-луночной микроплаты (производство фирмы Falcon). Раствор образца в количестве 50 мкл на среде DMEM, содержащий предлагаемое соединение TCF-II, добавляют в первую лунку. Жидкость тщательно перемешивают, после чего 50 мкл смеси переносят во вторую лунку. Повторением этой процедуры готовят серию последовательных разведений.

Клеточную суспензию в количестве 50 мкл добавляют в каждую лунку, содержащую последовательные разведения тестируемого вещества. Культуру выращивают при 37^oC в течение 2 сут в термостате в атмосфере CO₂. По окончании выращивания среду осторожно удаляют, и клетки дважды промывают физиологическим раствором. Жизнеспособные клетки, прикрепившиеся ко дну каждой лунки, фиксируют и окрашивают, добавляя в каждую лунку 50 мкл 0,5% красителя "кристаллический фиолетовый", растворенного в смеси метилового спирта и воды (1 4). Затем каждую лунку три раза промывают дистиллированной водой, высушивают и удаляют из лунки краситель с помощью серенсоновского (Sorenson) буферного раствора, представляющего собой смесь 6,1 мл 0,1 M двузамещенного цитрата натрия, 3,9 мл 0,1 M HCl и 10 мл этилового спирта. Поглощение экстрактов при длине волны 570 нм определяют на микротитровальном спектрофотометре. Число единиц TCF-II (ед./мл) определяют по разбавлению, вызывающему гибель 50% клеток.

Пример 4. В данном примере показана активность гликопротеина TCF-II, направленная на подавление развития линий опухолевых клеток человека, а именно клеток BG-1 карциномы яичника и клеток MCF-7 карциномы груди.

Суспензии клеток BG-1 и MCF-7 с концентрацией 20 тыс. клеток в 1 мл готовят соответственно на среде МакКоя, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и на среде Игла MEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, смесь необязательных аминокислот, пируват, а также соли Игла. Гликопротеин TCF-II растворяют в среде МакКоя, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в случае клеток BG-1 и в среде Игла MEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в случае клеток MCF-1. Готовят последовательные двукратные разбавления TCF-II на основе исходного раствора, содержащего 4 мкг TCF-II в 1 мл при использовании соответствующей среды.

По 50 мкл каждой клеточной суспензии добавляют в лунки 96-луночной микроплаты фирмы Falcon. По 50 мкл последовательных разбавлений раствора TCF-II, приготовленных для соответствующей линии клеток, добавляют в лунки, содержащие клеточные суспензии. Культивирование проводят в термостате в атмосфере CO₂ при 37^oC в течение 5 сут. По окончании культивирования удаляют культуральную среду и дважды осторожно промывают клетки PBS. Выжившие клетки на дне лунок фиксируют и окрашивают при добавлении в каждую лунку по 50 мкл 0,5% -ного раствора кристаллического фиолетового в смеси метилового спирта и воды (1 4). Каждую лунку промывают дистиллированной водой и высушивают, после чего из каждой лунки с помощью серенсоновского буферного раствора удаляют краситель. Поглощение экстрактов определяют при 570 нм на микротитровальном спектрофотометре. Подавление роста клеток (G) для каждой линии клеток вычисляют путем сравнения с контрольными пробами, в которых TCF-II отсутствует, по нижеследующей формуле: G [(D_c D) D_c]100, где D_c оптическая плотность контрольной пробы при 570 нм; D оптическая плотность при 570 нм для проб, содержащих TCF-II.

Результаты исследований представлены на фиг. 11. Они показывают, что TCF-П подавляет рост опухолевых клеток обеих линий: BG-1 и MCF-7.

Пример 5. Исследование активности, стимулирующей рост гепатоцитов.

Гепатоциты получают из тканей самцов крыс Wister. Полученные гепатоциты помещают в 24-луночные пластмассовые платы (производство фирмы Falcon,) с плотностью 88 тыс. клеток на одну лунку вместимостью 0,5 мл. Клетки выращивают при 37^oC в атмосфере 5% CO₂. В качестве культуральной среды используют среду Williams E (производство фирмы Flow Laboratory) с добавлением 10% сыворотки эмбриона теленка (производство фирмы Hyclone), пенициллина (100 ед. /мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Эта среда называется базовой средой культивирования. После инкубирования при 37^oC в течение 24 ч первоначальную культуральную среду заменяют базовой средой культивирования, содержащей исследуемые пробы. Далее проводят культивирование гепатоцитов еще в течение 24 ч, после чего культивирование продолжают в базовой среде, содержащей 4 мкКи/мл (86 Ки/ммоль) ³H-тимидина (производство фирмы Amercham) в течение 2 ч с последующим контролем синтеза ДНК. После включения гепатоцитами ³H-тимидина величину включенной метки определяют с помощью сцинцилляторного счетчика по разнице значений, полученных при добавлении и в отсутствие 10 мМ гидроксимочевины для каждой тестируемой пробы. После того, как клетки были маркированы согласно описанной выше методике, культуру клеток дважды промывают смесью холодного PBS, 2%-ной хлорноватистой кислоты и 95% этилового спирта и высушивают воздухом. Затем клетки помещают в 0,8 мл 2% SDS содержащей 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 20 мМ NaHCO₃ с последующим подсчетом на жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Результаты представлены в табл. 5.

Данные, приведенные в табл. 5, однозначно свидетельствуют в пользу того, что TCF-II стимулирует рост гепатоцитов.

Пример 6. Исследование по предотвращению адсорбции.

В течение 7 сут, в среде DMEM, содержащей 5% сыворотки эмбриона теленка, культивируют клетки 1MR-90 (ATCC, CCL 186) фибробластов легкого эмбриона человека. Фактор TCF-II, выделенный в чистом виде в количестве 200 мкг из культуральной среды, растворяют в 100 мл 0,01 M фосфатного буферного раствора (pH 7,0), содержащего 0,15 M NaCl (PBS). В стеклянные и полиэтиленовые пробирки добавляют порции раствора TCF-II по 0,5 мл. Отдельно с использованием PBS готовят двукратные разбавления каждого соединения, приведенного в табл. 6. В каждую пробирку, содержащую 0,5 мл раствора TCF-II, добавляют по 0,5 мл каждого разведения указанных соединений и тщательно перемешивают содержимое. Конечная концентрация TCF-II составляет 1 мкг/мл, а конечную концентрацию каждого из добавляемых соединений доводят до концентрации, приведенной в табл. 6.

Для контроля в каждую пробирку из стекла или полипропилена, содержащую 0,5 мл раствора TCF-II, добавляют по 0,5 мл PBS.

Каждое испытание дублируют. Активность TCF-II определяют после инкубирования пробирок при 37^oC в течение 1 ч. Экспериментальные данные представлены как средние значения дублированных результатов.

(1) Стеклянные пробирки.

а. Влияние высокомолекулярных добавок на адсорбцию TCF-II (см. табл. 6).

б. Влияние неионных детергентов на адсорбцию TCF-II (см. табл. 7).

(2) Полипропиленовые пробирки.

Влияние альбумина сыворотки крови человека и препарата Твин-80 на адсорбцию TCF-II (см. табл. 8).

Общую активность TCF-II определяют по его цитотоксической активности следующим образом.

Клон клеток L-929-18 с повышенной чувствительностью к TCF-II, полученный субклонированием клеток L-929 (ATCC, CCL) мыши, используют в качестве "клеточной мишени".

Клетки L-929-18 выращивают до состояния монослоя в среде DMEM, содержащей 10% FCS, а затем клетки собирают при обработке трипсином с последующим центрифугированием. Из полученных клеток готовят суспензию с плотностью 600 тыс. клеток в 1 мл в среде DMEM, содержащей 10% FCS и 1 мкг/мл актиномицина