N,о-сульфатированные гепарозаны, способ их получения и фармацевтическая композиция, обладающая антитромботической активностью

N,о-сульфатированные гепарозаны, способ их получения и фармацевтическая композиция, обладающая антитромботической активностью

Реферат

 

Использование: в медицине в качестве антитромботических средств. Сущность изобретения: продукты: N, O-сульфатированные гепарозаны, состоящие из цепей или смесей цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м., характеризующиеся повторяющейся дисахаридной структурой ф-лы I, указанной в описании, где Е - ацетильная группа в количестве 0 - 60% от дисахаридных звеньев N,O-сульфатированных гепарозанов, остальные дисахаридные звенья содержат сульфатную группу и, в случае необходимости, атом водорода, G - водород или сульфатная группа, причем степень сульфатирования гепарозанов, выраженная как отношение сульфат/карбоксил, заключена между 1,9 - 3, или их фармацевтически приемлемые соли. Способ получения I включает последовательность следующих стадий: а) культивирование штамма бактерий Escherichia coli /KS/CNCM N l-1013, b), выделение из посева и очистка N-ацетилгепарозана с получением композиции, содержащей от 70 до 100% гепарозана, с) частичное деацетилирование полученной композиции, содержащей от 70 до 100% гепарозана, d) частичное или полное N,O-сульфатирование полученной композиции. 4 с. и 24 з. п. ф-лы, 18 табл.

Предметом настоящего изобретения являются новые N,O-сульфатированные гепарозаны, композиции, которые содержат эти N,O-сульфатированные гепарозаны, способ получения N,O-сульфатированных гепарозанов и фармацевтической композиции на их основе.

Известно, что гликозаминогликаны являются продуктами, которые могут быть получены путем извлечения из тканей животного происхождения. Некоторые из этих гликозаминогликанов обладают антикоагулирующими и антитромботическими свойствами, представляющими большой интерес. Типичными соединениями из этого семейства являются гепарин, его фрагменты и их производные, а также гепаринсульфат и дерматансульфат (хондроитинсульфат), которые, однако, имеют недостаток, обусловленный их происхождением и заключающийся в том, что они являются очень дорогостоящими.

В частности, известно, что дерматансульфат представляет собой семейство полимеров с переменной степенью полимеризации, образованных повторяющимися звеньями, состоящими из группы уроновой кислоты /идуронильной или глюкуронильной/ и из 4-ацетилсульфогалактозаминильной группы (H. W. Stuhlsatz "The Methodology of Connective Tissue Research", 1976, 137 146). Природный дерматансульфат имеет молекулярную массу, заключенную между 20000 и 40000 а. е. м. Это соединение представляет особый интерес в качестве антикоагулирующего и антитромботического средства (F. Fernandez et al. British Journal of Haematology, 1986, 64, 309 317).

С другой стороны, известно (I. Bjork, U. Zindahl "Molecular and Cellular Biochemistry, 1982, Dr. W Junk Publisher Pays Bas), что свертывание крови представляет собой сложный физиологический процесс, механизм которого может быть схематизирован и резюмирован следующим образом: Некоторые стимулы, такие как контактная активация и тканевые факторы, дают начало последовательности активации для серии факторов свертывания, присутствующих в плазме крови, причем на приведенной выше схеме эти факторы обозначаются римскими цифрами, а наличие индекса "а" означает активированную форму /индекс "а" присутствует/ и неактивированную форму /индекс "а" отсутствует/ данного фактора свертывания.

Какова бы ни была природа стимула, конечные стадии являются идентичными: фактор Ха активирует фактор II /называемый также протромбином/, который в своей активированной форме /фактор IIа, называемый также тромбином/ вызывает частичный протеолиз растворимого фибриногена с высвобождением нерастворимого фибрина, т. е. основного компонента кровяного сгустка /тромба/.

В нормальных физиологических условиях белки-регуляторы, такие как антитромбин III /АТIII/ и гепариновый кофактор II /ГКII/, также присутствуют в плазме.

Антитромбин III проявляет ингибирующую активность по отношению к совокупности факторов свертывания, обозначенных звездочкой /*/ в приведенной выше схеме. Это ингибирование значительно усиливается в присутствии гепарина или синтетических олигосахаридов гепаринового типа /D. H. Atha et al. Biochemistry, 1985, 24, 6723 6729/.

Гепариновый кофактор II проявляет ингибирующую активность только по отношению к фактору IIа /тромбину/, который катализирует последнюю стадию свертывания. Эта активность значительно усиливается в присутствии гепарина или дерматансульфата (D. M. Tollefsen, J. Biol. Chem. /1983/, 258, 6713 6716).

Ингибирование фактора Ха или фактора IIа составляет примущественный способ для получения антикоагулирующей и антитромботической активности, потому что эти два фактора принимают участие на двух последних стадиях свертывания, которые являются независимыми от стимулирующего воздействия.

Чтобы обеспечить ингибирование только одного фактора IIa, имеется возможность, представляющая особый интерес, которая заключается в том, чтобы использовать специфичность гепаринового кофактора II и добиться усиления его ингибирующей активности. Дерматансульфат является известным продуктом, обладающим наиболее значительной усиливающей активностью этого типа.

Известно также, что образование основной гепариновой цепи происходит в две стадии. Сначала биосинтезируется гепарин, исходя из протеогликана - предшественника, у которого полисахаридная часть состоит из семейства полимеров с переменной степенью полимеризации, образованных повторяющимися -Д-1,4-глюкоронил-a-N-ацетил-Д-1,4-глюкозамильными звеньями /дисахаридные звенья/ с молекулярной массой 379 а. е. м. Эта полисахаридная часть обычно называется N-ацетилгепарозан (J. Navia, Anal. Biochem. /1983/, 135, 134 - 140). Эта первая биосинтетическая стадия является единственным моментом, когда действительно можно говорить о "дисахаридном звене", так как вторая стадия биосинтеза будет изменять этот простой скелет значительным образом ("L'heparine, fabrication, Structure proprietes, analyses", J. P. Duclos, /1984/, p.p. 81 83, Masson Ed. France).

В самом деле, получившийся при биосинтезе природный гепарин является полисахаридом, образованным молекулами глюкуроновой кислоты и идуроновой кислоты /уроновыми кислотами/, сульфатированным, в случае необходимости, в положении 2 и связанным с молекулами глюкозамина, сульфатированного, в случае необходимости, в положении 6 и сульфатированного или ацетилированного на амине в положении 2.

Структура гепарина статически может быть изображена следующей формулой (i): где А представляет собой Н и SO^-₃ B представляет собой SO^-₃ и COCH₃, а n есть целое число со значениями между 20 и 30, что соответствует молекулярному весу от 12000 до 18000 а. е.м /европейский патент ЕП-А-О 116 801/.

Выражения "Н и SO^-₃ " и " SO^-₃ и COHC₃" такие, которые используются соответственно для заместителей А и В, показывают, что в 20 30 приведенных выше дисахаридных звеньях А является в некоторых случаях водородом, а в других случаях группой SO^-₃ и, аналогичным образом, В является в большинстве случаев SO^-₃ а в других случаях -ацетильной группой.

Кроме того, связь означает, что группа COO^- в 20 30 приведенных выше дисахаридных звеньях имеет в некоторых случаях конфигурацию /ii/: /речь идет о Д-глюкуроновой кислоте/, а в большинстве из n звеньев конфигурацию /iii/: /речь идет о L-идуроновой кислоте/.

Следовательно, гепарин и фрагменты гепарина, такие, которые получаются в результате различных методов деполимеризации, являются макромолекулами, содержащими как звенья глюкуроновой кислоты, так и звенья идуроновой кислоты.

Некоторые способы деполимеризации позволяют получать фрагменты гепарина, имеющие молекулярный вес, заключенный между 2000 и 9000 а. е. м. и степень сульфатирования, превышающую по меньшей мере на 20% степень сульфатирования исходного гепарина. Такие "сверхсульфатированные" гепарины описаны в заявке на европейский патент ЕП-А-О 116 801, причем уроновые звенья у них имеют две упомянутые выше структуры /ii/ и /iii/.

Известно также, что некоторые бактерии рода Escherichia coli вырабатывают капсулярный полисахарид, называемый обычно антигеном К5, который представляет собой семейство полимеров, образованных повторяющимися -D-1,4-глюкуронил-a-N-ацетил-Д-1,4-глюкозамильными звеньями (W. F. Vann et al. Eur. J. Biocem. 1981, 116, 359 364).

Этот полисахарид той же самой химической природы, что и полисахаридная часть протеогликана, предшественника гепарина, будет называться здесь N-ацетилгепарозаном. Этот продукт имеет молекулярную массу, заключенную между 10⁵ и 210⁶ а. е. м. а на уровне звеньев "уроновой кислоты" очень регулярную структуру, образованную исключительно Д-глюкуроновой кислотой (WF. Vann et al. Eur. J. Biochem. /1980/, 116, 359 364 и заявка на европейский патент ЕП-А-О N333243).

Заявка на европейский патент ЕП-А-О N333243 описывает О-сульфатированный полисахарид К5, а также некоторые из его фрагментов, образованных соответственно 4, 6 или 8 "сахарозными" звеньями, также О-сульфатированными. Эти соединения имеют антиангиогенную и антитуморальную активность при благоприятном соотношении этих активностей относительно антикоагулирующих свойств. Этот документ описывает также фрагменты N-ацетилгепарозана, образованные соответственно 4, 6, 8 или 10 "сахарозными" звеньями.

Заявка на европейский патент ЕП-А-О N333243 описывает также получение пентасахарида, имеющего структуру О-сульфатированного N-ацетилгепарозана, в результате полностью химического синтеза.

В настоящее время нами было обнаружено, что N, О-сульфатированные гепарозаны с переменным молекулярным весом, заключенным между 1500 и 15000 а. е. м. обладают антикоагулирующей активностью по отношению к гепариновому кофактору II и очень высокой анти-Ха активностью.

N, O-сульфатированные гепарозаны как предмет настоящего изобретения отличаются, следовательно, от других соединений, уже описанных в литературе, их оригинальной структурой, в частности их степенью сульфатирования /в том числе и сульфатирования на аминогруппе глюкозамина/ и их фармакологическими свойствами. Среди прочих фармакологических свойств они обладают антикоагулирующей активностью по отношению к гепариновому кофактору II /ГКII/, причем более сильной, чем аналогичная активность дерматансульфата, и они имеют фармакокинетические характеристики, представляющие большой интерес. Действительно, соединения по изобретению, которые являются продуктами, получаемыми в результате полухимического синтеза, обладают фармакологической активностью гликозаминогликанов, обычно применяемых в терапии, в частности фармакологической активностью гепарина, и могут использоваться для регулирования коагуляции и, в частности, могут найти свое применение в качестве антитромботических средств.

Предметом настоящего изобретения являются N, O-сульфатированные гепарозаны, образованные цепями или смесью цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающиеся повторяющейся дисахаридной структурой со следующей формулой 1: в которой: E представляет собой в 0 80% дисахаридных звеньев указанных N, O-сульфатированных гепарозанов ацетильную группу, а в оставшихся дисахаридных звеньях сульфатную группу и, в случае необходимости, атом водорода, G представляет собой атом водорода и сульфатную группу и фармацевтически приемлемые соли указанных N, O-сульфатированных гепарозанов.

Степень сульфатирования N, O-сульфатированных гепарозанов, выраженная в виде отношения сульфат/карбоксил, составляет предпочтительно от 1,5 до 3,0.

Изобретение относится также к композиции N, O-сульфатированного гепарозана, содержащей по меньшей мере 70 мас. описанного выше N, O-сульфатированного гепарозана, который является предметом настоящего изобретения, а предпочтительно содержащей по меньшей мере 90 мас. N,O-сульфатированного гепарозана, который является предметом настоящего изобретения.

N,O-cульфатированные гепарозаны как предмет настоящего изобретения могут быть образованы идентичными полисахаридными цепями с хорошо определенной молекулярной массой, причем эта молекулярная масса находится в интервале 1500 15000 а. е. м. Они также могут быть образованы смесью цепей с переменными молекулярными массами, причем эти молекулярные массы заключены между 1500 и 15000 а. е. м. Дисперсия молекулярных масс этих цепей может быть более или менее значительной. Действительно, N, O-сульфатированные гепарозаны как предмет настоящего изобретения могут быть образованы цепями, имеющими между собой максимальное различие по молекулярной массе приблизительно 13500 а. е. м. или, напротив, только цепями, имеющими между собой различие по молекулярной массе приблизительно 300 а. е. м. что соответствует одному звену уроновой структуры /Д-глюкуроновая кислота или ее производные/ или глюкозаминовой структуры. Также является очевидным, что в зависимости от строения каждого N,O-гепарозана молекулярная масса цепей, имеющих либо наименьшую молекулярную массу, либо наибольшую молекулярную массу, может соответствовать любому значению, заключенному между 1500 и 15000 а. е. м.

Выражение "G представляет собой атом водорода или сульфатную группу", которое используется выше, показывает, что G в дисахаридном звене изображает для некоторых положений атом водорода, а для других оставшихся сульфатную группу. Аналогичным образом E изображает в некоторых дисахаридных звеньях ацильную группу, а в остальных из этих звеньев сульфатную группу или, в случае необходимости, атом водорода. Дисахаридные звенья N,O-сульфатированных гепарозанов не являются, следовательно, полностью идентичными.

Формула I изображает повторяющуюся дисахаридную структуру, образованную одним звеном глюкоамина и одним звеном Д-глюкуроновой кислоты. Указанные звенья могут инвертироваться /обращаться/, в частности, если считать, что дисахаридная структура с формулой I повторяется n раз, то звено-невосстановитель в цепях может являться, причем безразлично, либо глюкозаминовым звеном, таким как изображено в формуле I с гидроксигруппой в положении 4, причем это звено глюкозамина является сульфатированным или несульфатированным, либо Д-глюкуроновой кислотой, имеющей, в случае необходимости, двойную связь в положении С4 С5 и являющейся сульфатированной или несульфатированной. Звено-восстановитель может являться, причем безразлично, либо Д-глюкуроновой кислотой, такой как изображено в формуле I, замещенной водородом на аномерном кислороде, либо глюкозамином, либо 2:5-антидроманноструктурой, такой, которая получается вследствие деполимеризации под действием азотистой кислоты /2,5-ангидро-Д-манноза/ с последующим, в случае необходимости, окислением /2, 5-ангидро-Д-манноновая кислота/ или восстановлением /2,5-ангидро-Д-маннитол/.

Предпочтительными продуктами являются те, у которых два концевых звена, восстановитель и невосстановитель, цепей N,O-сульфатированных гепарозанов как предмета настоящего изобретения являются звеньями уроновой кислоты, сульфатированной или несульфатированной, глюкозамина, сульфатированного или несульфатированного, N-ацетилглюкозамина, сульфатированного или несульфатированного, или звеньями, имеющими 2,5-ангидроманноструктуру.

Предпочитают N, O-сульфатированные гепарозаны, у которых два концевых звена, восстановитель и невосстановитель, являются звеньями уроновой кислоты, сульфатированной или несульфатированной, глюкозамина, сульфатированного или несульфатированного, и N-ацетиглюкозамина, сульфатированного или несульфатированного.

Предметом настоящего изобретения является также способ получения композиции, содержащей от 70 до 100% N,O-сульфатированного гепарозана как предмета настоящего изобретения, отличающийся тем, что он включает последовательность следующих стадий: стадия а: разведение посева Escherichia coli /K5/ для получения N-ацетилгепарозана, стадия b: выделение и очистка образованного N-ацетилгепарозана для получения композиции, содержащей от 70% до 100% N-ацетилгепарозана, состоящего из цепей или из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой II: стадия с: частичное диацетилирование этой N-ацетилгепарозановой композиции для получения композиции, содержащей от 70% до 100% гепарозана, состоящего из цепей или смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой III: в которой R' представляет собой в 0 80% дисахаридных звеньях ацетильную группу, а в оставшихся дисахаридных звеньях атом водорода.

стадия d: либо частичное N,O-сульфатирование этой гепарозановой композиции, либо частичное N,O-сульфатирование этой гепарозановой композиции с последующей стадией полного N-сульфатирования, либо полное или частичное N-сульфатирование с последующей стадией полного или частичного О-сульфатирования, и, в случае необходимости, включает одну или несколько стадий разделения /фракционирования/ по молекулярным массам, осуществляемых по окончании стадий а, b, с или d.

Для получения композиции, содержащей от 70 до 100% N,O-сульфатированного гепарозана как предмета настоящего изобретения, в соответствии с изобретением предпочтительно используют в качестве посева (штамма) Escherichia coli /K5/ посев Escherichia coli SEBR 3282. Этот посев (штамм) является посевом (штаммом), производным от штамма Bi 8337-41 (010:К5:Н4) АТСС 23506 (описанного, в частности, D. S. Gupta et al. FEMS Microbiology Zetters, /1982/, 14, 75 78 и W. Vann, Eur. J. Biochem. /1981/, 116, 359 364).

Штамм Escherichia coli SEBR 3282 положительно отвечает на типовой тест специфичным фагом К5 в соответствии с методикой B. Kaiser et al (J. Clin. Microbiol. /1984/, 19, 2, 264 266). Следовательно, речь действительно идет о штамме Escherichia coli (K5). Этот штамм был представлен в CNCM Института Пастера, Париж, Франция, под N1-1013. Можно также использовать мутант, либо спонтанный, либо вызванный этим штаммом, а также другие соответствующие штаммы Escherichia coli /K5/, например, посев Bi 626-42 (012:KS:NM) ATCC 23508.

Используемая для культуры среда является предпочтительно средой, обогащенной азотсодержащим веществом, например средой, обогащенной дрожжевым экстрактом и гидролизатом казеина, это недорогое средство, содержащее значительное количество аминокислот.

Разведение посева (культивирование штамма) Escherichia coli /K5/ продолжается предпочтительно не менее двух часов после прекращения роста биомассы.

Выделение и очистка N-ацетилгепарозана для получения композиции, содержащей от 70 до 100% N-ацетилгепарозана (стадия В), состоящего из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой II, осуществляется при помощи способа, включающего по меньшей мере одну стадию осаждения и одну стадию ионообменной хроматографии. Эта стадия осуществляется при использовании предпочтительно колонки с Q-сефарозой или эквивалентной колонки. Осаждение осуществляется соответствующим органическим растворителем и, в частности, спиртом, предпочтительно этанолом. В ходе этого способа N-ацетилгепарозан может находиться в виде соли, предпочтительно в виде натриевой соли.

В качестве примера можно схематично изобразить предпочтительный способ выделения и очистки следующим образом: стадия а₁: осаждение этанолом, стадия b₁: диализ, стадия с₁: осаждение этанолом с последующей дегидратацией и сушкой, стадия d₁: очистка методом анионообменной хроматографии, стадия e₁: осаждение этанолом из элюата, полученного на стадии d₁, дегидратация, сушка и измельчение (дробление).

Что касается стадий a₁, b₁ и c₁, то порядок, в котором они осуществляются, имеет небольшое значение. Стадии a₁ или c₁ могут быть опущены.

На стадии e₁ осаждение этанолом не является необходимым. Можно выделять N-ацетилгепарозан другими методами, как, например, выпариванием под вакуумом элюата, полученного на стадии d₁.

Выделение и очистка N-ацетилгепарозана для получения композиции, содержащей от 70 до 100% N-ацетилгепарозана, состоящего из смеси цепей с молекулярной массой, заключенной между 1500 и 15000 а. е. м. могут также проводиться следующим образом: стадия a'₁: диализ, стадия b'₁: очистка в кислой среде, удаление нерастворимых примесей в водных растворах от pH 3,5 до pH 1,8, стадия c'₁: осаждение этанолом с последующими дегидратацией и сушкой, стадия d'₁: щелочной гидролиз и диализ, стадия e'₁: очистка методом анионообменной хроматографии, стадия f'₁: очистка при помощи эксклюзивной хроматографии.

Этот способ выделения и очистки также является предпочтительным способом по изобретению.

Щелочной гидролиз осуществляется при помощи раствора NaOH при температуре, заключенной между 30 и 80^oC.

Применяя способы выделения и очистки, можно использовать в качестве исходного соединения либо суспензию, полученную по окончании разведения культуры, и в этом случае предварительная фильтрация является необходимой, либо продукт, который уже был подвергнут предварительной очистке, проведенной в соответствии со способом, который включает следующие стадии: стадия a"₁: центрифугирование суспензии, полученной по окончании разведения культуры, стадия b"₁: осуществление контакта всплывшей на поверхность фазы со щелочным раствором, стадия c"₁: предварительная фильтрация, стадия d"₁: концентрирование на мембране с определенным порогом отсекания, которая обеспечивает разделение по молекулярным массам, стадия e"₁: диализ.

Стадия e"₁ не является необходимой.

В качестве щелочного раствора можно использовать 0,1 н раствор NaOH.

Предпочтительно проводят процесс предварительной очистки продукта, полученного по окончании разведения культуры, в соответствии со способом, описанным выше.

Разведение посевов Escherichia coli (K5) и способы выделения и очистки, а также стадия предварительной очистки, которые были упомянуты выше, позволят получить N-ацетилгепарозановые композиции, содержащие от 70 до 100% N-ацетилгепарозана, состоящего из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой II: Действительно, благодаря описанным выше способам выделения и очистки и стадии предварительной очистки, оказывается возможным получать N-ацетилгепарозановые композиции, содержащие по меньшей мере от 80 до 100% N-ацетилгепарозана, состоящего из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м.

N-ацетилгепарозаны, состоящие из смеси цепей с молекулярными массами, заключенными между 1500 и 15000 а. е. м. являются новыми продуктами и также составляют предмет настоящего изобретения.

Два концевых звена, восстановитель и невосстановитель, новых N-ацетилгепарозанов таких, которые получены в соответствии со способом, описанным выше, при использовании посева Escherichia coli SEBR 3282 или другого соответствующего посева, как указано выше, являются звеньями уроновой кислоты или N-ацетилглюкозамина.

В большинстве цепей концевое звено-невосстановитель является звеном уроновой кислоты с формулой (а): Возможное обогащение получаемой композиции N-ацетилгепарозаном, состоящим из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. имеющих повторяющуюся дисахаридную структуру с формулой II, может проводиться до различных степеней и, в частности, до выделения указанного N-ацетилгепарозана. Обогащение осуществляется путем использования классических методов разделения по молекулярным массам, таких как гель-проникающая хроматография и ультрафильтрация (A. A. Horner, Biochem. J. /1989/, 262, 953-958; G.Pyler et.al. I.Biol. Chem. /1988/, 263, 11, 5197-5201 и U. Lindahl et al. J. Biol. Chem. /1984/, 259, 20, 12368-12376). Можно также использовать метод этанольного разделения /заявка на европейский патент ЕП-А-О N287477/. Этот последний метод разделения имеет особую ценность среди других рассмотренных методов.

Описанные выше N-ацетилгепарозаны используются в качестве промежуточных соединений для получения N,O-сульфатированных гепарозанов как предмета настоящего изобретения, а также и для получения других производных.

Для получения N,O-сульфатированных гепарозанов как предмета настоящего изобретения можно также использовать другие известные N-ацетилгепарозаны, как, например, N-ацетилгепарозаны, состоящие в основном из полисахаридных цепей, которые все имеют одно и то же число дисахаридных звеньев, таких как описано в заявке на европейский патент ЕП-А-О N333243, и, в частности, состоящих из 6, 8 или 10 "сахарозных" звеньев, из N-ацетилгепарозановых фракций, состоящих из цепей, содержащих в среднем 10 моносахаридных звеньев (Gupta et al. FEMS Microbiology Letters /1983/, 16, 13 17) или из N-ацетилгепарозанов с высокой молекулярной массой, которые могут затем деполимеризоваться в соответствии с методами, используемыми для получения гепаринов с низким молекулярным весом.

Действительно, N, O-сульфатированные гепарозаны как предмет настоящего изобретения могут быть получены при помощи других способов, исходя из известного полисахарида (K5), имеющего высокую молекулярную массу. В этом случае стадия деполимеризации является необходимой.

Эта деполимеризация может проводиться перед деацетилированием N-ацетилгепарозана с высокой молекулярной массой, после деацетилирования, после N-сульфатирования или еще после N,O- сульфатирования.

Как было упомянуто выше, деполимеризация может осуществляться в соответствии с описанными в литературе методами для получения гепаринов с низким молекулярным весом, например, путем деполимеризации с периодатом, при помощи свободных радикалов, в результате бета-отщепления или при действии азотистой кислоты /заявки на патенты или патенты ЕП-О 040 144, ЕП-О 037 319, ЕП-О 121 067/. Эти методы приводятся в качестве примеров и не являются ограничивающими. Можно использовать любой другой метод деполимеризации гликозаминогликанов.

Когда N, O-сульфатированные гепарозаны синтезируют в результате деполимеризации, исходя из N-ацетилгепарозана с высокой молекулярной массой /предварительно деацетилированного и, в случае необходимости, N-сульфатированного/, подвергая его действию азотистой кислоты, то звено-восстановитель N, O-сульфатированных гепарозанов как предмета настоящего изобретения может иметь 2,5-ангидроманноструктуру и, в частности, структуру 2,5-ангидро-Д-маннозы. Деполимеризация под действием азотистой кислоты может проводиться после стадии N-деацетилирования или N-сульфатирования. Когда за этой стадией следует окисление или восстановление, то получают N,O-сульфатированные гепарозаны, имеющие в звене-восстановителе структуру соответственно 2,5-ангидро-Д-манноновой кислоты или 2,5-ангидро-Д-маннитола.

Частичное деацетилирование композиций, содержащих от 70 до 100% N-ацетилгепарозана, которое приводит к получению композиций, содержащих от 70 до 100% и даже от 80 до 100% гепарозана, состоящего из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой III, указанной выше, осуществляется в результате обработки при помощи деацетилирующего агента.

В качестве деацетилирующих агентов можно упомянуть пентасульфид фосфора, фторборат триэтилоксония, гидроксид натрия или гидразин, причем эти два последних агента имеют особую ценность. Можно также использовать сильные минеральные кислоты, такие как хлороводородная кислота, серная кислота и т. д. Продолжительность реакции зависит от выбранных экспериментальных условий и, в частности, от температуры и от концентрации деацетилирующего агента в реакционной среде.

Обогащение гепарозановой композиции гепарозаном, состоящим из цепей или из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой III, осуществляется в результате использования классических методов разделения по молекулярным массам, упомянутых выше /гель-проникающая хроматография, ультрафильтрация и этанольное разделение/. В этом случае получают композиции, содержащие от 90 до 100 мас. гепарозана, состоящего из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. имеющих повторяющуюся дисахаридную структуру с формулой III.

Для получения гепарозанов, состоящих из смеси цепей с молекулярной массой, заключенной между 1500 и 15000 а. е. м. можно также использовать N-ацетилгепарозаны с высоким молекулярным весом. Гепарозаны с высоким молекулярным весом, полученные после деацетилирования, могут деполимеризоваться при помощи методов, уже описанных при получении гепаринов с низким молекулярным весом и уже упомянутых в этой заявке. Продукты деполимеризации могут затем подвергаться фракционированию с целью получения предпочтительных гепарозанов по изобретению.

Гепарозаны, состоящие из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся структурой с формулой III: в которой R' представляет собой в 0 80% дисахаридных звеньев ацетильную группу, а в остальных дисахаридных звеньях атом водорода, являются новыми продуктами и в этом качестве также составляют часть изобретения.

Предпочтительными гепарозанами по изобретению являются гепарозаны, состоящие из смеси цепей с молекулярной массой между 1500 и 15000 а. е. м. отличающихся повторяющейся дисахаридной структурой с формулой III, в которой ацетильная группа /R'/ присутствует с содержанием, меньшим или равным 60% Гепарозановые композиции, которые содержат по меньшей мере 70 мас. гепарозана, такого как описано выше, так-же составляют часть настоящего изобретения.

Эти гепарозаны и гепарозановые композиции являются промежуточными соединениями, пригодными для получения N,O-сульфатированных гепарозанов как предмета настоящего изобретения, но они также могут использоваться для получения других продуктов, например продуктов, которые подвергаются впоследствии эпимеризации на уровне звена Д-глюкуроновой кислоты.

Перед стадией частичного N,O-сульфатирования гепарозаны могут превращаться в соль органического основания или в соль четвертичного аммония. Для образования соли четвертичного аммония с гепарозанами используют предпочтительным образом тетрабутиламмоний.

Стадия частичного N,O-сульфатирования, осуществляемая в соответствии со способом, описанным во французском патенте N 2584728 от 10.11. 87 /соответствующем заявке ФР-85. 10787/, проводится в полярном апротонном растворителе, таком как диметилформамид, диметилсульфоксид, гексаметилфосфорамид или ацетонитрил, или в смеси этих растворителей при помощи, например, комплекса серного ангидрида /триоксида серы:SO₃/ с органическим основанием, таким как триэтиламин, триметиламин или пиридин. Она может также проводиться при помощи хлорсульфоновой кислоты, растворенной в пиридине. Используют предпочтительно комплекс триоксид серы пиридин.

Можно также использовать другие агенты сульфатирования, в частности те, о которых сообщается в статье E. E. Gilbert в Chemichal Review, /1962/, 62, 549 589. Реакция N,O-сульфатирования осуществляется обычно при температуре, заключенной между 0^o и 100^oC, предпочтительно между 10^o и 50^oC, в течение 6 14 ч.

При осуществлении способа получения в конце реакции частичного N,O-сульфатирования композиция N,O-сульфатированного гепарозана, содержащая от 70 до 100% N, O-сульфатированного гепарозана как предмета настоящего изобретения, осаждается в результате прибавления хлорида натрия до получения 0,33 М раствора хлорида натрия, а затем адекватного количества этанола. Полученный осадок извлекается в 0,5 М растворе хлорида натрия. Затем этот раствор нейтрализуется. После прибавления адекватного количества этанола полученный осадок выделяется, извлекается при помощи высокоочищенной воды, отделяется от последней путем диализа, лиофилизуется и сушится.

Стадия N,O-сульфатирования, а также стадии очистки композиции N,O-сульфатированного гепарозана, описанные в предыдущем абзаце, могут повторяться один или несколько раз. Процесс очистки дается в качестве примера и не исключает эквивалентных способов.

За этой стадией N, O-сульфатирования предпочтительно следует стадия полного N-сульфатирования, которая осуществляется обычно в водном растворителе преимущественно со щелочным значением pH при помощи сульфатирующего агента, такого как комплекс серного ангидрида с органическим основанием, например, триметиламином.

По окончании стадии полного N-сульфатирования композиция N,O-сульфатированного гепарозана осаждается после прибавления хлорида натрия до получения 0,5 М раствора хлорида натрия и этанола. Полученный осадок затем снова переводится в раствор при помощи 0,5 М раствора хлорида натрия, снова осаждается этанолом, потом извлекается высокоочищенной водой, отделяется относительно последней путем диализа, лиофилизируется и сушится.

Обогащение композиции N,O-сульфатированного гепарозана N,O-сульфатированным гепарозаном осуществляется в результате использования классических методов разделения по молекулярным массам, которые уже упоминались. Осуществление этого обогащения представляет интерес.

N, O-сульфатированные гепарозаны как предмет настоящего изобретения и композиции N,O-сульфатированных гепарозанов, содержащие по меньшей мере 70% нового N,O-сульфатированного гепарозана как предмета настоящего изобретения, получаются преимущественно при помощи способа, включающего N-сульфатирование в качестве конечной реакции. Тогда Е для повторяющихся структур в формуле (I) представляет собой ацетильную группу и сульфатную группу.

Можно также получать N,O-сульфатированные гепарозаны как предмет настоящего изобретения, проводя сначала N-сульфатирование с последующим О-сульфатированием. Этот вариант способа используется предпочтительным образом.

N-сульфатирование осуществляется при помощи комплекса триоксида серы с органическим основанием, таким как триметиламин, триэтиламин или пиридин. Способ также может осуществляться при помощи хлорсульфоновой кислоты в растворе пиридина. Преимущественно используют комплекс триоксида серы с триэтиламином, а реакция N-сульфатирования проводится при температуре, заключенной между 20 и 80^oC, в щелочной водной среде. По окончании реакции N-сульфатирования полученный таким образом продукт осаждается в результате прибавления адекватного количества этанола. Полученный осадок извлекается высокоочищенной водой, отделяется относительно последней путем диализа, лиофилизируется и сушится. Процесс очистки дается в качестве примера и не исключает эквивалентные способы. Стадии очистки могут повторяться несколько раз.

В соответствии со способом по изобретению перед стадией О-сульфатирования N-сульфатированный гепарозан превращается предпочтительно в соль органического основания или в соль четвертичного аммония. Для образования соли четвертичного аммония используют предпочтительным образом тетрабутиламмоний.

Реакция О-сульфатирования проводится в формамиде или в другом растворителе, химически эквивалентном, при помощи, например, комплекса триоксида серы с органическим основанием, таким как триметиламин, триэтиламин или пиридин. Используют предпочтительно комплекс триокиси серы -пиридин. Реакция О-сульфатирования обычно проводится при температуре, заключенной между 10^oC и 50^oC.

Затем N,O-сульфатированный гепарозан осаждается в результате прибавления к реакционной среде хлорида натрия до получения 0,33 М раствора NaCl, а потом адекватного количества этанола, как в случае N,O-сульфатирования. Затем приступают к очистке композиции N,O-сульфатированного гепарозана. Различные стадии были уже детальным образом описаны выше (осаждение этанолом, диализ и т.д.).

В соответствии с изобретением предпочтительный N,O-сульфатированный гепарозан содержит по меньшей мере 90 мас. цепей с молекулярной массой меньше 11000 а. е. м. Считается ценным, чтобы этот N,O-сульфатированный гепарозан содержал менее 0,2 мкмоль/мг аминогрупп (NH₂).

Ацетильная группа предпочтительно присутствует с содержанием, меньшим или равным 60% и считается ценным, чтобы степень сульфатирования, выраженная как отношение сульфат/карбоксил, была бы заключена между 1,5 и 3,0.

Предпочтительными соединениями по изобретению являются N,O-сульфатированные гепарозаны, состоящие из цепей, имеющих среднюю молекулярную массу приблизите