Способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербицидам двудольных растений

Способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербицидам двудольных растений

Реферат

 

Использование: изобретение относится к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующих гербицид - устойчивую форму фермента ацетолактатсинтазы. Сущность: предварительно конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий устойчивую к гербициду ацетолактатсинтазу, нуклеотидная последовательность которого содержит по крайней мере одну из консервативных субпоследовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности A, B, C, D, E, F и G, с помощью тригибридного скрещивания переносят плазмидную ДНК в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens, трансформируют протопласты растений агробактериями и отбирают трансформанты. Аминокислотная последовательность A представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности пролин-глицин-глицин (E₂)-аланин (E₁). Аминокислотная последовательность B представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности глицин-глутамин-валин-пролин (₁). Аминокислотная последовательность C представляет собой последовательность из 8 аминокислот, гомологичных последовательности изолейцин-глицин-треонин-аспарагиновая кислота-аланин (₂)-фенилаланино-глутамин-глутаминовая кислота. Аминокислотная последовательность D представляет собой последовательность из 3 аминокислот, гомологичных последовательности-пролин-лизин (₁)-аспарагиновая кислота. Аминокислотная последовательность E представляет собой последовательность из 5 аминокислот, гомологичных последовательности - аргинин-фенилаланин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота (₁)-аргинин. Аминокислотная последовательность F представляет собой последовательность из 10 аминокислот, гомологичных последовательности - глицин-метионин-валин (₈)- валин-глутамин-триптофан (₃)-глутаминовая кислота - аспарагиновая кислота-аргинин-фенилаланин (₇), а последовательность G представляет собой последовательность Из 6 аминокислот, гомологичных последовательности - метионин-лейцин-глицин-метионин (₁)-гистидин-глицин. 10 ил., 29 табл.

Настоящее изобретение относится к фрагментам нуклеиновых кислот, кодирующим гербицидустойчивую форму фермента ацетолактатсинтазы (АЛС).

Сульфонилмочевинные гербициды ингибируют рост некоторых бактерий, дрожжей и высших растений путем блокирования ацетолактатсинтазы (АЛС, ЭС 4.1.3.18), первого общего фермента в биосинтезе аминокислот с разветвленной цепью валина, лейцина и изолейцина. Биосинтез аминокислот с разветвленной цепью и, следовательно, токсичность сульфонилмочевинных гербицидов ограничиваются растениями и микробами. АЛС также ингибируется структурно неродственным классом гербицидов, а именно имидазолинонами.

Три основных изофермента АЛС, обозначенные I, II и III, идентифицированы в кишечных бактериях. Изоферменты I и III, но не II, являются чувствительными к конечному продукту ингибирования валином. Каждый из трех бактериальных изоферментов содержит большую и малую субъединицу белка. Ферменты АЛС из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и из некоторых высших растений частично охарактеризованы и показывают некоторую степень ингибирования конечного продукта. Неизвестно, состоят ли ферменты АЛС дрожжей и растений из одного или более различных полипептидов. Данные дают основание предполагать, что клеточные местоположения ферментов АЛС дрожжей и растений находятся в митохондриях и хлоропластах соответственно.

Гены, кодирующие ферменты АЛС, выделены из кишечных бактерий Salmonella typhimurium и Escherichia coli, а также дрожжей S. cerevisiae. Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих две субъединицы изоферментов I, II и III АЛС E. coli показывают, что они организованы, как опероны ilvBN, ilvGM и ilvIH соответственно. Сравнение выведенных аминокислотных последовательностей больших субъединиц изоферментов АЛС E. coli показывает три области, содержащие приблизительно 50% консервативных аминокислот (приблизительно 2/3 части белков), разделенных областями с малоразличимой гомологией. Консервативные аминокислотные последовательности, хотя и в меньшем количестве, присутствуют среди малых субъединиц бактериальных изоферментов. В дрожжах S. cerevisiae был идентифицирован единственный ген ILV2, существенный для активности АЛС. Анализ нуклеотидной последовательности гена ILV2 выявил, что полипептид, кодируемый им, гомологичен большим субъединицам бактериальных изоферментов АЛС. Выведенная аминокислотная последовательность АЛС дрожжей показывает такую же ступень структурной организации и такую же степень гомологии, какая наблюдается между большими субъединицами бактериальных изоферментов, за исключением того, что около 90 аминокислот в амино-конце дрожжевого белка, как полагают, вовлечены в транслокацию белка в митохондрию. До описываемого здесь изобретения не было никакой информации относительно структуры генов растений, кодирующих АЛС, или аминокислотной последовательности ферментов АЛС растений.

Изофермент I кишечных бактерий представляет собой единственную АЛС в природе, который является нечувствительным к ингибированию сульфометуронметилом и хлорсульфуроном. Поэтому кишечные бактерии чувствительны к этим гербицидам только в присутствии валина, который ингибирует изофермент I. Идентифицированы сульфонилмочевинные гербицидустойчивые мутантные формы кишечных бактерий Salmonella typhimurium и E. coli (отобранные в присутствии валина), дрожжей S. cerevisiae и высших растений Nicotaiana tabacum (табак), Arabidopsis thaliana и Zea mays (маис). Эти мутантные фенотипы расщепляются совместно с гербицид-устойчивыми формами АЛС посредством генетических кроссов. В S. typhimurium гербицидустойчивые мутации генетически связаны с геном, кодирующим АЛС, а в E. coli и S. cerevisiae эти мутации заключены в структурных генах для АЛС. В высших растениях мутации, ответственные за устойчивость, наследуются как единственные, доминантные или полудоминантные ядерные признаки. В табаке эти мутации картируются к одному из двух несцепленных генетических локусов.

Химическая борьба с нежелательными сорняками, ассоциируемыми с сельскохозяйственно полезными культурами, требует использования чрезвычайно селективных химических гербицидов. В некоторых случаях очень трудно идентифицировать какое-нибудь химическое вещество, которое убивает сорняки, не повреждая при этом сельскохозяйственную культуру. Интродукция устойчивости к гербицидам в качестве биологического признака могла бы преодолеть эту трудность.

Многие гены, вовлеченные в структуру и функцию дифференцированных растительных тканей и органов, не экспрессируются в недифференцированных тканях; те же, которые участвуют в основных клеточных функциях, экспрессируются и могут быть отобраны в дезорганизованном каллюсе или культуре клеточной суспензии. Это было продемонстрировано во многих случаях путем отбора фенотипа в тканевой культуре, из которой были регенерированы растения, экспрессирующие такой же фенотип. Примеры включают отбор in vitro растений, устойчивых к гербицидам, патотоксинам или заболеваниям, антибиотикам, аминокислотным аналогам, солям и т.д. (см. работы Chaleff, 1981; Evans и др. 1983; Vasil, 1986).

Поскольку ацетолактатсинтаза представляет собой фермент, вовлеченный в основную клеточную метаболическую активность аминокислотного биосинтеза, ожидалось и было продемонстрировано, что гены, кодирующие этот фермент, экспрессируются в каллюсной ткани также, как и в целом растении. Сульфонилмочевинные устойчивые мутанты табака, описанные в этом патенте, S4, C3 и Hra, вначале были отобраны в тканевой культуре и затем регенерированы на целые растения, в которых устойчивые фенотипы были сохранены генетически стабильным образом (Chaleff и Ray, 1984). Каллюсные ткани, происходящие от регенерированных растений или их потомства, продолжают расти при концентрациях гербицида, которые ингибируют рост каллюса дикого типа. Таким образом, устойчивость к гербициду на основе сульфонилмочевины на уровне клеток растений прогнозируется устойчивостью на уровне целого растения. Кроме того, в бактериях, дрожжах и высших растениях было продемонстрировано, что мутации, приводящие к получению гербицидустойчивой АЛС, достаточны для того, чтобы придать устойчивость на клеточном уровне и в случае использования растений на уровне всего растения. Следовательно, данные наблюдений за гербицидустойчивой АЛС в экстрактах растительных клеток также прогнозируются гербицидустойчивым ростом культурных растительных клеток и гербицидустойчивым ростом целых растений.

Существуют ограничения для получения гербицидустойчивых сельскохозяйственных растений посредством тканевой культуры или мутагенеза семян: 1) метод тканевой культуры ограничен теми культурами растений, которые подвергаются манипулированию и регенерации из тканевой культуры, 2) растения, происходящие от мутагенеза семян и возможно из тканевой культуры, могут иметь нежелательные фенотипы, которые потребуют проведения многочисленных генетических обратных скрещиваний, и 3) перенос устойчивого гена путем размножения был бы ограничен до культурных сортов одних и тех же видов, а также потребовал бы осуществления многократных генетических обратных скрещиваний. Поэтому выделение фрагмента нуклеиновых кислот, способного придать гербицидную устойчивость, и его последующее интродуцирование в сельскохозяйственные культуры посредством генетической трансформации должны позволить осуществление быстрого, межвидового переноса гербицидной устойчивости и устранить многие из вышеуказанных ограничений.

Хотя гены, выделенные из одного растения, были интродуцированы и экспрессированы в других растениях, нерастительные гены были экспрессированы в растениях только как химерные гены, в которых кодирующие последовательности нерастительных генов были сцеплены с растительными регуляторными последовательностями, необходимыми для генной экспрессии. Однако было бы трудно интродуцировать гербицидную устойчивость в растения путем введения химерных генов, состоящих из бактериальных или дрожжевых генов гербицидустойчивых форм АЛС, поскольку (а) эти микробные АЛС-ферменты, как полагают, не содержат специфическую сигнальную (транзитную) пептидную последовательность, требуемую для ввода в растительные хлоропласты, представляющие собой клеточное местоположение растительной АЛС, (б) бактериальные изозимы состоят из двух различных полипептидных субъединиц и (в) микробные АЛС-ферменты оптимально не могут функционировать в чужеродной клеточной среде высших растений. Следовательно, существует необходимость во фрагментах нуклеиновых кислот, которые (1) кодируют гербицидустойчивую форму растительной АЛС и (2) придают гербицидную устойчивость, когда они интродуцированы в гербицидчувствительные растения.

Ближайшим решением к предлагаемому способу является способ в статье "Herbicide Resistant Mutants from Tobacco Cell Cultures", написанной авторами Chaleff и Ray (Science, v. 223. 1984, 1148 1151). В этой статье описано получение растений, устойчивых к гербицидам, путем изоляции селекцией спонтанных мутаций в культуре табачной клетки и регенерации табачных растений из устойчивых клеток.

Однако в указанной статье не содержится сведений, относящихся к молекулярной биологии по устойчивости к гербицидам, и не имеется сведений о возможности идентифицирования и изолирования последовательности ДНК, кодирующей устойчивую к гербицидам форму биосинтетического фермента ацетолактатсинтазы и о способе регулирования роста нежелательной растительности путем трансформации различных культурных растений новыми последовательностями ДНК и обработки трансформированных культур эффективными количествами гербицидов для полного подавления сорняков без повреждения культурных растений. Данное изобретение является первым отчетом о такой успешной трансформации растений. Подобных сведений по молекулярной биологии ацетолактатсинтазы не имеется. Так как культивирование сахарной свеклы, картофеля и Brassica является исключительно важным в России, заявленный способ регулирования роста нежелательной растительности путем применения гербицида в локусе, где культурные растения включают в себя трансформированные растения, устойчивые к гербицидам, является весьма полезным в связи со всеобщей практикой ежегодного семяоборота после использования сульфонилмочевинных гербицидов. Устойчивость к гербицидам влечет за собой увеличенную надежность, которая будет обеспечивать семяоборот без повреждения.

Согласно настоящему изобретению предлагается способ получения устойчивых к сульфонилмочевинным гербецидам двудольных растений, предусматривающий культивирование клеток на селективных средах, отбор устойчивых к гербициду клеток и получение регенерантов. Отличительной особенностью способа является предварительное конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующей устойчивую к гербициду ацетолактатсинтазу, нуклеотидная последовательность которого содержит по крайней мере одну из консервативных субпоследовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности A, B, C, D, E, F и G, перенесение плазмидной ДНК в Agrobacterium tumefaciens в результате тригибридного скрещивания, трансформирование протопластов растений агробактериями и отбор трансформантов, при этом аминокислотная последовательность A представляет собой последовательность из четырех аминокислот, гомологичных последовательности пролин-глицин-глицин (₂)- аланин(₁), соответствующих 119 122 аминокислотам ацетолактатсинтазы растения, где ₁ является любой аминокислотой, кроме аланина, ₂ любой аминокислотой, кроме глицина; аминокислотная последовательность B представляет собой последовательность из 4 аминокислот, гомологичных последовательности глицин-глутамин-валин-пролин(₁), соответствующих 194 197 аминокислотам ацетолактатсинтазы растения, где ₁ является любой аминокислотой, кроме пролина; аминокислотная последовательность C представляет собой последовательность из 8 аминокислот, гомологичных последовательности изолейцин-глицин-треонин-аспарагиновая кислота-аланин(₂)-фенилаланино-глутамин-глутаминовая кислота, соответствующих аминокислотам 201 208 ацетолактатсинтазы растения, где ₂ является любой аминокислотой, кроме аланина; аминокислотная последовательность D представляет собой последовательность из трех аминокислот, гомологичных последовательности -пролин-лизин(₁)-аспарагиновая кислота, соответствующих последовательностям 255 257 ацетолактатсинтазы растения, причем ₁ является любой аминокислотой, кроме лизина; аминокислотная последовательность E представляет собой последовательность из пяти аминокислот, гомологичных последовательности -аргинин-фенилаланин-аспарагиновая кислота-аспарагиновая кислота (₁)-аргинин, соответствующих аминокислотам 381 385 ацетолактатсинтазы растения, где ₁ является любой аминокислотой, кроме аспарагиновой кислоты; аминокислотная последовательность F представляет собой последовательность из десяти аминокислот, гомологичных последовательности -глицин-метионин-валин(₈)-валин-глутамин-триптофан(₃)-глутаминовая кислота-аспарагиновая кислота-аргинин-фенилаланин(₇), соответствующих аминокислотам 586 595 ацетолактатсинтазы растений, где ₃ является любой аминокислотой, кроме триптофана, ₈ является любой аминокислотой, кроме валина, ₇ является любой аминокислотой, кроме фенилаланина; аминокислотная последовательность G представляет собой последовательность из шести аминокислот, гомологичных последовательности -метионин-лейцин-глицин-метионин(₁)- гистидин-глицин, соответствующих аминокислотам 356 361 ацетолактатсинтазы растения, где ₁ является любой аминокислотой, кроме метионина.

Используемый фрагмент, кодирующий ацетолактатсинтазу растений, способен вводиться в конструкцию нуклеиновых кислот, используемую для трансформации растения, содержащего ацетолактатсинтазу дикого типа, которое является чувствительным к сульфонилмочевинному гербициду, причем данный фрагмент нуклеиновых кислот, имеющий по крайней мере одну точечную мутацию относительно фрагмента нуклеиновых кислот дикого типа, кодирующего ацетолактатсинтазу растений таким образом, что при трансформации данной конструкцией нуклеиновых кислот указанное растение содержит данный фрагмент нуклеиновых кислот и приобретает устойчивость к сульфонилмочевинному гербициду.

Настоящее изобретение позволяет получить белок ацетолактатсинтазы, который устойчив к сульфонилмочевинному гербициду, содержащему аминокислотную последовательность, в которой происходит замещение по крайней мере одной аминокислоты, а также конструкцию нуклеиновых кислот двудольных растений, которые содержат определенный фрагмент нуклеиновых кислот. Изобретение позволяет трансформировать растения определенными фрагментами, проводить селекцию трансформированных растительных клеток и выращивать трансформированные растения.

Селекцию растительных клеток, трансформированных фрагментом нуклеиновых кислот, можно проводить интродукцией фрагментов в растительные клетки, чей рост чувствителен к ингибированию гербицидами, к которым АЛС, кодируемая фрагментом, является устойчивой. В этом случае трансформированные растительные клетки, чей рост устойчив к отобранному гербициду, можно идентифицировать селекцией при концентрации гербицида, которая ингибирует рост нетрансформированных растительных клеток.

Настоящее изобретение позволяет также контролировать нежелательный вегетативный рост в очаге, где культивируют гербицидустойчивое, агрономически полезное растение (трансформированное фрагментом нуклеиновых кислот настоящего изобретения) путем внесения в защищаемый очаг эффективного количества гербицида. Изобретение позволяет определить с помощью фрагмента нуклеиновых кислот, содержащего фрагмент нуклеиновых кислот, кодирующий ацетолактатсинтазу, придающую гербицидную устойчивость, второй фрагмент нуклеиновых кислот, кодирующий второй признак. Причем первый фрагмент нуклеиновых кислот используют для трансформации растения, и экспрессию гербицидной устойчивости указанным растением при внесении соединения сульфонилмочевины используют для определения наличия второго фрагмента нуклеиновых кислот в данном растении.

Фиг. 1 представляет собой физическую карту вставочных фрагментов нуклеиновых кислот, содержащих гены АЛС, выделенные из геномной библиотеки ДНК из мутанта Hra табака.

Фиг.2 представляет собой схему плазмиды pAGS 152, показывающую физическую карту фрагмента нуклеиновых кислот из табака, кодирующего гербицидустойчивую АЛС.

Фиг.3 представляет собой физическую карту вставочного фрагмента нуклеиновых кислот в фаговом клоне 35, выделенном из геномной библиотеки ДНК из мутанта C3 табака.

Фиг. 4 представляет собой нуклеотидную последовательность гена мутанта Hra табака, кодирующего гербицидустойчивую форму АЛС, и выведенную из нее аминокислотную последовательность.

Фиг.5 представляет собой нуклеотидную последовательность гена мутанта C3 табака, кодирующего гербицидустойчивую форму АЛС, и выведенную из нее аминокислотную последовательность.

Фиг. 6 и 7 представлены сравнения выведенных аминокислотных последовательностей больших субъединиц бактериальной АЛС и дрожжевых и растительных АЛС-ферментов.

Фиг.8 представляет собой физическую карту вставочного фрагмента нуклеиновых кислот и суб-фрагментов, происходящих от фагового клона 21, выделенного из геномной библиотеки ДНК свеклы сахарной.

Фиг. 9 представляет сравнение выведенных аминокислотных последовательностей растительных АЛС-ферментов.

Получение ДНК-фрагментов, кодирующих гербицид-устойчивую ацетолактатсинтазу (АЛС) Каллюсные культуры чувствительного табака (Nicotiana tabacum, разновидность Xanthi) подвергают воздействию сульфометуронметила при 2 частях на биллион (ppb) в соответствии с методом, описанным Chaleff в патенте США N 4443971. Отбирают устойчивые клеточные линии, обозначенные C3 и S4. Стандартный генетический анализ растений, регенерированных из этих клеточных линий, показывает, что каждая из линий C3 и S4 несет единственную полудоминантную ядерную генную мутацию, отвечающую за признак гербицидной устойчивости, а также то, что мутации C3 и S4 не связаны генетически, то есть находятся в различных генах, обозначенных SURA и SURB соответственно. Как показывает анализ, линии C3 и S4 продуцируют активность фермента АЛС, в 100 раз более устойчивого к сульфонилмочевинным гербицидам хлорсульфурон и сульфометуронметил, чем АЛС от дикого типа. Гербицидустойчивой АЛС-активность расщепляется в генетических кроссах и наследуется совместно с устойчивостью к ингибированию роста растений гербицидами. Наблюдение за двумя различными генами, которые мутировали с образованием гербицидустойчивой АЛС, не дало неожиданных результатов, поскольку N. tabacum, как полагают, представляет собой аллотетраплоид, образованный из N. tomentosiformis и N. sylvestris, по существу, содержащих два полных генома. Так, каждая клеточная линия C3 и S4 содержит один мутант и один ген АЛС дикого типа. Линию клеток S4 подвергают воздействию сульфометуронметила при 200 ppb, избирательная концентрация которого полностью ингибирует рост S4. Идентифицируют линии клеток, устойчивые к 200 ppb; одну такую линию обозначают Hra. Hra переносят концентрации сульфометуронметила в 1000 раз большие, чем те, которые требуются для полного ингибирования роста каллюса дикого типа. Как показывает анализ, линия Hra кросс-резистентна к хлорсульфурону. Растения регенерируют из каллюсных культур Hra. Генетический анализ растений показывает, что Hra и S4-мутации связаны, что говорит о том, что линия Hra содержит вторую мутацию в мутантном гене прародительской линии S4. Определяют активность АЛС в экстрактах листьев дикого типа и растениях табака гомозиготного мутанта Hra. Активность АЛС в экстракте из растений мутанта Hra приблизительно в 1000 раз более устойчива к хлорсульфурону, чем активность растений дикого типа. Растения мутанта Hra кросс-резистентны к некорневому питанию следующими соединениями: 2-(2-хлорэтокси)-N-[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)- аминокарбонил] бензолсульфонамид; 2-хлор-N-[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)аминокарбонил] - бензолсульфонамид; 2-[[(4-хлор-6-метоксипиримидин-2-ил)аминокарбонил] аминосульфонил] бензойная кислота, сложный этиловый эфир; N-[(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)аминокарбонил] -2,3-дигидро-2- метилбензо[]тиофен-7-сульфонамид, 1,1-диоксид; 7-хлор-N-[(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)аминокарбонил] -3,4-дигидро-2-метил- 2H-1,2-бензотиазин-8-сульфонамид, S,S-диоксид; 2-[[(4-метокси-6-метилпиримидин-2-ил)аминокарбонил] аминосульфонил]-6-метилбензойная кислота, сложный метиловый эфир; 2-[[(4,6-диметилпиримидин-2-ил)аминокарбонил] аминосульфонил] бензойная кислота, сложный метиловый эфир.

Для того, чтобы клонировать ген гербицидустойчивой АЛС, ДНК табака выделяют из гомозиготной мутантной линии S4 Nicotiana tabacum. Порции по 50 г каллюсной ткани замораживают в жидком N₂ и затем лиофилизуют. Полученную высушенную ткань измельчают при температуре около 23^oC в мешалке с использованием 15-секундных импульсов до превращения в порошок. 10 объемов сахарозного буферного раствора (0,3 М сахароза, 50 мМ трис-HCl pH 8,0, 5 мМ MgCl₂) добавляют в смесь и полученную суспензию инкубируют при температуре 0^oC в течение 5 мин. Суспензию фильтруют через марлю и центрифугируют при 350g в течение 10 мин. Зернистый осадок ресуспендируют в лизисном буферном растворе (20 мМ ЭДТК; 50 мМ трис-HCl pH 8,0, 1% Sarkosyl), добавляют CsCl с получением 0,95 г на мл буферного раствора, и полученную смесь центрифугируют при 17000g в течение 20 мин при температуре 4^oC. Бромид этидиума бромид соединения этила с металлом: MeC₂H₅ - добавляют к полученному супернатанту до концентрации 400 мкг на мл, показатель преломления регулируют до 1,39 и полученный раствор центрифугируют при 90000g в роторе Beckman Ti 70 при температуре 20^oC в течение 3 дней. Полученную флуоресцентную полосу ДНК отщепляют от градиента и обрабатывают изопропанолом для экстрагирования бромида этидиума. ДНК диализуют против буфера ТЭ и осаждают путем прибавления этанола.

Геномную библиотеку Nicotiana получают из этой ДНК следующим образом, используя фаг лямбда-вектора EMBL4, описанный в работе Frischauf и др. J. Mol. Bio. 170: 827 (1983). Фаг EMBL4 получают из биомассы с агаровых чашек, получаемой по методу Davis и др. Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1980). Фаговую ДНК получают, как описано Silhavy и др. Experiments with Gene Fusions (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1984), путем концентрирования фага полиэтиленгликолем, удаления полиэтиленгликоля экстракцией хлороформом и очистки фага с использованием ступенчатых градиентов глицерина. Полученный очищенный фаг затем обрабатывают дезоксирибонуклеазой и рибонуклеазой перед экстракцией фенолом. Фаговую ДНК извлекают из этанола. Для получения плечей фага EMBL4 фаговую ДНК последовательно переваривают эндонуклеазами Sal I и Bam HI. Плечи отжигают и затем отделяют от центрального фрагмента на 10 40%-ном сахарозном градиенте, как описано в работе Maniatis и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1982). Плечи полностью денатурируют и повторно отжигают перед лигированием к ДНК табака. ДНК табака, полученную, как ранее описано, частично переваривают эндонуклеазой Sau3A и осаждают посредством градиента 10 40%-ной сахарозы. Фракции от сахарозного градиента анализируют электрофорезом на 0,5%-ных агаровых гелях. Фракции, содержащие фрагменты 20 40 кб, диализируют, осаждают и лигируют к плечам ДНК лямбда-фага. ДНК лигируют при концентрации 135 мкг на мл вектора и 45 мкг на мл вставки ДНК. Полученные лигированные конкатамеры затем упаковывают с использованием экстрактов упаковки лямбда ДНК. Полученный выход фага составляет приблизительно 4,510⁵ фагов на мкг вставки ДНК. Конструируют библиотеку из приблизительно 400000 фагов, представляющую вычисленную 99%-ную полную библиотеку для табака, которая имеет приближенное геномное содержание 1,65 пг или 1,5210⁹ пар оснований (Zimmerman и др. Chromosoma 59: 227, 1977).

Полученную фаговую библиотеку ДНК Nicotiana выращивают и высевают на чашки на штамме LE 392 E. coli (ATCC 33572), как описано Silhavy и др. Experiments with Gene Fusions. (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1984). Фаги высевают на чашки с получением 2000 5000 пятен на 90 мм чашках Петри или 50000 пятен на 150 мм чашках Петри. Подъемы пятен осуществляют по методу Benton и др. Science 196: 180 (1977). Вслед за переносом фаговой ДНК к нитроцеллюлозным фильтрам фильтры предварительно гибридизируют путем инкубирования в течение приблизительно 4 ч при температуре 56^oC в 6SSPE, содержащем 0,5% ДДС Na, 100 мкг на мл денатурированной ДНК телячьего тимуса и 10 раствора Denhardt. Гибридизацию осуществляют так, как описано Maniatis и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1982, с. 326). На этой стадии добавляют свежую аликвоту гибридизационного раствора вместе с приблизительно 10⁸ отсчетов в минуту радиоактивного зонда гена дрожжевой АЛС. Гибридизацию проводят в течение 24 48 ч при температуре 56^oC. В этот момент фильтры вначале промывают в течение приблизительно 4 ч в 6SSPE при температуре 56^oC, затем промывают еще трижды в течение 20 мин каждый раз в 2SSPE при температуре около 23^oC. Затем фильтры сушат и подвергают воздействию при температуре -70^oC в течение 2 дней рентгеновской пленки Kodak XAR или XRP и усиливающего экрана Du Pont Cronex Lighting Plus^TM. Открытые пятна на пленке указывают положение зон гемолиза, потенциально содержащих гены АЛС Nicotiana.

Авторадиограммы, полученные, как описано выше, затем ориентируют над первоначальными, бактериофаг-содержащими чашками Петри. Используя широкий конец стерильной пастеровской пипетки, выщипляют бляшки, соответствующие наиболее темным пятнам на авторадиограммах. Собранные бляшки затем элюируют буфером SM и высевают на свежие чашки Петри диаметром 90 мм. Каждая чашка получает около 100 200 фагов. Затем повторяют полный процесс определениям местоположения фагов, используя вновь приготовленный зонд. Таким образом повторяют стадии определения местоположения и выделения фагов до тех пор, пока большинство бляшек не покажет присутствие фага, содержащего ДНК, способной гибридизироваться к зонду гена АЛС дрожжей.

Мини-препараты ДНК из очищенного от пятен фага, обозначенного NtAI 3, выделяют, как описано, и обрабатывают, как описано Maniatis и др. Molecular Cloning: A Lanorarotv Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, 1982, с. 371). Фрагменты мини-препаратов ДНК, полученные с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRI, подвергают электрофорезу через 0,7% агарозные гели и блоттингу на нитроцеллюлозных фильтрах. Фрагменты, содержащие ген АЛС, затем идентифицируют путем гибридизации с зондом дрожжевого АЛС-гена. Фрагменты, способные гибридизироваться с зондом, затем выделяют и субклонируют в векторы pBR 322, M13 mp 9 или M13 mp 18. Эти фрагменты затем секвенируют с использованием олигонуклеотидных праймеров в методике дидезокси-терминации цепи, осуществляемой, в основном, как описано в работе Sanger и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977). Используют комплект приборов, поставляемый New England Biolabs (Беверли, Масс. США). Использование синтетических олигонуклеотидных праймеров позволяет осуществить наращивание ДНК-последовательности вдоль клонированного фрагмента в перекрывающихся сегментах. ЭВМ-анализ последовательности ДНК идентифицирует открытую рамку считывания 667 кодонов. Выведенная аминокислотная последовательность этой открытой рамки считывания в основном гомологична последовательностям, ранее определенным из гена ILV2 Saccharomyces cerevisiae и гена ilvG E. coli, что указывает на то, что фрагмент ДНК, восстановленный из геномной библиотеки Nicotiana, содержит ген АЛС табака. Для того, чтобы определить, кодирует ли ген АЛС гербицидустойчивый фермент дикого типа или мутантный гербицидустойчивый фермент из линии S4, ген интродуцируют в гербицидустойчивый табак дикого типа посредством Agrobacterium tumefaciens опосредованной трансформации.

Требуется генетический маркер для отбора трансформированных растительных клеток. Используют устойчивость к антибиотику G-418, получаемую в результате экспрессии в растениях, бактериального гена NPT II, кодирующего неомицинфосфотрансферазу. Для осуществления экспрессии NPT II регуляторные последовательности растений сливают с областью кодирования NPT II в векторе pKNK. Вектор pKNK происходит от традиционно используемой плазмиды pBR322 в результате отщепления сайтов Hind III и BamH I и инсерции в сайт Cla I фрагмента Cla I (приблизительно 2,3 кб), который состоит из следующих компонентов: а) последовательность Cla I-Bgl II длиной 320 п.н. содержащая промоторную область гена неомицинфосфотрансферазы (NPT II) транспозона Tn 5, получена в результате преобразования сайта Hind III в сайт Cla I [Beck Е. Ludwig G. Auerswald E.A. Reiss В. и Schaller H. (1982) Gene, 19: 327 336] б) последовательность Sau 3 A-Pst I длиной 296 п.н. содержащая промотор нопалинсинтазы (NOSP), получена от гена нопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды -263 до +33 относительно сайта начала транскрипции) [Depicker A. Stachel S. Dhaese P. Zambryski P. и Goodman H.J. (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1: 561 - 574] путем создания сайта Pst I у кодона инициации; в) последовательность Hind III- BamH I длиной 998 п.н. содержащая кодирующую последовательность для гена NPT II, получена от Tn 5, путем создания сайтов Hind III и BamH I у нуклеотидов 1540 и 2518 [Beck Е. Ludwig G. Auerswald E.A. Reiss В. и Schaller H. (1982) Gene, 19: 327 336] соответственно; г) последовательность BamH I-Cla I длиной 702 п.н. содержащая 3'- область гена нопалинсинтазы (NOS) (нуклеотиды 848 1550) [Depicker А. Stachel S. Dhaese P. Zambryski P. и Goodman H.J. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561 574] Нуклеотидная последовательность у слияния NOSP и последовательности кодирования NPT II выглядит следующим образом: NOS Последовательность NPT II Последовательность AATAATCTGCAGCAAGCTTGCGGGGATCGTTCGC ATG Pst I Hind III Вектор pKNK расщепляют рестрикционным ферментом Sal I (BRL) и полученный линейный вектор после экстракции фенолом соединяют в присутствии ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs) с очищенным фрагментом Sal I (2,1 кб), несущим бактериальный ген неомицинфосфотрансферазы I (NPT I) в качестве селектируемого маркера для бактериальной устойчивости к канамицину. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток HB 101 Е. coli, и трансформанты селектируют на чашках, содержащих 100 мг/л канамицина. Полученную рекомбинантную плазмиду, обозначенную pKNKS, подвергают очистке.

Плазмиду pKNKS расщепляют рестрикционным ферментом Eco RI (BRL) и ее концы делают затупленными фрагментом Кленова (BRL). Полученную линейную ДНК соединяют в присутствии ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs) с фосфорилированными линкерами Bgl II. Вслед за экстенсивным перевариванием рестрикционным ферментом Bgl II (BRL) для удаления избыточных линкеров ДНК пропускают через колонку гель-фильтрации Сефадекс G-150 (очищенный) (Pharmacia) с тем, чтобы отделить ее от линкеров. Фрагмент ДНК выделяют и объем регулируют с получением концентрации ДНК около 78 мкг/мл. 1 мкл ДНК самолигируют в присутствии ДНК-лигазы T4 (New England Biolabs) в общем объеме 5 мкл и используют для трансформации компетентных клеток Е. coli HB101. Ампициллинустойчивые клетки содержат плазмиду pKNKSG, которая идентична плазмиде pKNKS, за исключением того, что рестрикционный сайт EcoRI замещен сайтом Bgl II.

Фрагмент Sma I фага NtA13 содержит область, которая гибридизируется к дрожжевому гену АЛС. Фаг NtA13 частично переваривают рестрикционным ферментом Sma I (New England Biolabs) и вслед за экстракцией фенолом присоединяют к фосфорилированным линкерам BamH I (New England Biolabs) в присутствии ДНК лигазы T4 (New England Biolabs). После переваривания BamH I и удаления избыточных линкеров путем электрофореза на агарозном геле рестрикционный фрагмент BamH I (16 кб), содержащий ген АЛС табака от фага NtA13, выделяют из геля электроэлюированием и используют для дальнейшего клонирования.

Вектор pKNKSG линеаризуют рестрикционным ферментом Bgl II (BRL) и вслед за дефосфорилированием кишечной фосфатазой теленка (Boehringer Mannheim) его присоединяют в присутствии ДНК-лигазы Т4 (New England Biolabs) к рестрикционному фрагменту (16 кб) BamH I, происходящему из фага NtA13. Лигазную смесь используют для трансформации компетентных клеток E. coli HB101, и ампициллинустойчивые трансформанты содержат рекомбинантную плазмиду, обозначенную pIV13. Ориентация фрагмента-вставки в pIV13 такова, что открытые рамки считывания гена NOS NPT II в векторе и гена АЛС во вставке находятся в противоположных направлениях. Е. coli HB 101 (pIV13) после очистки тремя штриховыми разводками одной колонии используют для трехродительского скрещивания.

3 мл ночных культур Е. coli HB101 (pIV13) и Е. coli HB101 (pRK 2013) (номер ATCC 37159) в среде ЛБ, содержащей 25 мг/л канамицина, выращивают при температуре 37^oC, Agrobacterium tumefaciens GV 3850 в среде ЛБ при температуре 28 29^oC. Клетки собирают при комнатной температуре в клинической центрифуге, промывают один раз в среде ЛБ, не содержащей лекарства, собирают и ресуспендируют в 3 мл ЛБ. 0,25 мл аликвоты всех трех штаммов смешивают в пробирке и смесь переносят на миллипоровый фильтр (2,5 см HAWP, 0,45 мкм), помещенный на пов