Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций

Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций

Реферат

 

Использование: биотехнология, генная инженерия, медицина. Сущность изобретения: аналоги человеческого инсулина с замещениями одного или более аминокислотных остатков в А- и В-цепях инсулина человека на более гидрофильние аминокислотные остатки получают путем трансформации штамма дрожжей плазмидой, содержащей ДНК-последовательность, кодирующую предшественник аналога инсулина. Полученный предшественник превращают в аналоги с помощью реакции со сложным эфиром L-треонина в органическом растворе в присутствии трипсина. Предпочтительными аминокислотными замещениями являются Asp, Glu, Ser, Thr, His и Ile. 3 с.п. ф-лы, 11 ил., 1 табл.

Изобретение относится к новым аналогам человеческого инсулина, отличающимся быстрым наступлением требуемого эффекта после подкожной инъекции, и растворам инсулина для инъекций, содержащим подобные аналоги инсулина и к способам получения новых аналогов инсулина.

Для лечения сахарного диабета в рассматриваемой области техники предлагались многие разновидности инсулиновых препаратов. Некоторые из этих препаратов являются быстродействующими, тогда как другие обеспечивают более или менее продолжительное действие.

Быстродействующие инсулиновые препараты могут применяться в острых ситуациях, таких как гипергликемическая кома, во время хирургических операций, беременности и в случаях тяжелых инфекций. Кроме того, многократные, ежедневные инъекции быстродействующих инсулиновых препаратов могут улучшать контроль течения болезни у диабетиков, которые испытывают трудности при контроле использованием инсулина длительного действия.

В последние годы все возрастает интерес к лечению инсулином, которое приближается к выделению инсулина бета-клетками здорового организма, то есть выработке инсулина в сочетании с приемом пищи и поддержанию базального уровня содержания инсулина. Клинические исследования показали, что диабетики могут получать инсулин и глюкозу в нормальных концентрациях с помощью одной суточной инъекции инсулина продолжительного действия для покрытия базальной потребности, дополненной инъекциями меньших количеств (болюс) быстродействующего инсулина перед приемом значительных количеств пищи.

Быстродействующие инсулины также используются в смесях с инсулинами промежуточного и длительного действия для лечения диабетиков, для которых требуется более сильный начальный эффект в дополнение к замедленному действию инсулинов промежуточного и длительного эффекта.

Наконец, быстродействующий инсулин используется в системах непрерывного поступления инсулина.

При подкожной инъекции растворов быстродействующего инсулина наблюдалась начальная задержка всасывания (Binder, Diabetes Care , 7, N 2 (1984), 1988-199 ). Однако задержка всасывания, обусловленная замедленным наступлением эффекта, является нежелательной, если ставится задача обеспечения строго метаболического контроля. Смешивание растворов быстродействующего инсулина с инсулиновыми препаратами длительного действия может, кроме того, приводить к снижению скорости всасывания быстродействующего инсулина.

Соответственно, существует потребность в растворах быстродействующего инсулина, обеспечивающих ускоренное наступление эффекта после подкожной инъекции и улучшенную смешиваемость с инсулиновыми препаратами продолжительного действия.

Другим недостатком известных растворов быстродействующего инсулина является склонность инсулина к фибрилляции и выпадению из растворов инсулина, используемых для непрерывной доставки инсулина, что ведет к забиванию механических узлов и доставочных катетеров.

Наконец, существует потребность в альтернативных инсулиновых препаратах для лечения пациентов, трудно поддающихся лечению нормальным инсулином.

Целью настоящего изобретения является создание новых растворов быстродействующего инсулина с одной или большим числом нижеследующих улучшенных характеристик: 1) быстрое наступление эффекта при подкожной инъекции или при введении другими методами, 2) улучшенная смешиваемость с инсулиновыми препаратами продолжительного действия, 3) пониженная склонность к фибрилляции при использовании в имплантированных системах доставки, и 4) пригодность для лечения резистентных пациентов (низкое сродство к ранее существовавшим антителам).

Указанные цели настоящего изобретения достигаются с помощью водных растворов для инъекций новых аналогов человеческого инсулина, описываемых ниже.

Известно большое число аналогов инсулина. Так, Marki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360 (1979), 1619-1632) описывают синтез аналогов человеческого инсулина, которые отличаются от человеческого инсулина замещением аминокислоты в положениях 2, 5, 6, 7, 8 и 11 A-цепи и 5, 7, 13 и 16 B-цепи, что дает новые представления об интересной зависимости структура - активность в случае инсулина. В дальнейших исследованиях модифицирована главная область связывания рецептора в инсулине (В(22) - В(26)) для изучения влияния такой мутации на рецептор-связывающую активность. Однако известные аналоги человеческого инсулина не проявляют характеристик, к которым стремились авторы настоящего изобретения.

Известно, что сульфатированные инсулины обладают существенно более слабой склонностью к фибрилляции ( Albisser et al., Desired Characteristics of insulin to be used in infusion pumps, в работе Jueriguian J.L. et al. (ред.) US Pharmacopeial Concention, Rockville, Maryland с. 84-95) и проявляют слабую антигенность. Однако сульфатированные инсулины представляют собой гетерогенную смесь минимум девяти разных производных инсулина, содержащих в среднем 4,5 эфирсульфатные группы на молекулу. Далее, сульфатированные инсулины проявляют пониженную инсулиновую активность, составляющую около 20% активности нативного инсулина. Дальнейший недостаток сульфатированных инсулинов в сравнении с нативным инсулином заключается в том, что они без надобности содержат аминокислотные остатки, которые химически модифицированы, то есть аминокислоты, которые в природе не встречаются.

Поэтому дополнительной целью настоящего изобретения является создание аналогов инсулина, которые однородны, имеют более высокую биологическую активность, чем сульфатированные инсулины, и, кроме того, содержат предпочтительно лишь встречающиеся в природе аминокислоты.

Термином "аналоги инсулина" в материалах заявки обозначается соединение, имеющее молекулярную структуру, аналогичную структуре человеческого инсулина, включая дисульфидные мостики между A(7) Cys и B(7) Cys, между A20) Cys и B(19) Cys и внутренний дисульфидный мостик между A(6) Cys и A(11) Cys, и проявляющее инсулиновую активность.

Настоящее изобретение основывается на том, что некоторые аналоги инсулина, в которых минимум один из аминокислотных остатков человеческого инсулина замещен встречающимися в природе аминокислотными остатками, проявляют требуемую быстродействующую активность.

В своем расширенном толковании настоящее изобретение предлагает новые, быстродействующие аналоги человеческого инсулина, образованные замещением одного или нескольких аминокислотных остатков человеческого инсулина, встречающихся в природе, аминокислотными остатками, приводящими к меньшему само-ассоциированию в димеры, тетрамеры, гексамеры или полимеры, и имеющие тот же заряд или больший отрицательный заряд при нейтральном pH, нежели человеческий инсулин.

Для достижения меньшей склонности к самоассоциированию в димеры, тетрамеры, гексамеры или полимеры, некоторые остатки человеческого инсулина предпочтительно замещены другими аминокислотными остатками, которые более гидрофильны, чем природный аминокислотный остаток в соответствующем положении в молекуле. Кроме того, в некоторых положениях молекулы инсулина замещение более объемистым аминокислотным остатком ведет к понижению склонности молекул инсулина к ассоциации в димеры, тетрамеры, гексамеры или полимеры.

На фиг.1 представлены предлагаемые новые производные инсулина общей формулы I, где X - представляют собой аминокислотные остатки человеческого инсулина или другие аминокислотные остатки, суммарная функция которых заключается в придании молекуле того же или большего отрицательного заряда при нейтральном pH по сравнению с человеческим инсулином при условии, что по крайней мере один X отличается от аминокислотных остатков человеческого инсулина в соответственном положении и молекулы инсулина, и когда X в положении A(8) является His или Phe, X в положении A(21) является Asp, X в положении B(5) является Ala, X в положении B(9) является Leu, X положении B(10) является Asn или Leu, X в положении B(12) является Asn или X в положении B(26) является Ala, то по меньшей мере один из остающихся X отличается от аминокислотных остатков человеческого инсулина в соответствующем положении молекулы инсулина, и при дальнейшем условии, что один или несколько аминокислотных остатков может быть удален с N- и/или C-концов A-цепи и/или B-цепи.

Предпочтительно по крайней мере большинство замещений аминокислотных остатков являются более гидрофильными, чем аминокислотный остаток на соответствующем сайте молекулы человеческого инсулина, и более предпочтительно, чтобы все замещения аминокислотных остатков были более гидрофильными, чем соответствующие аминокислотные остатки человеческого инсулина.

В отношении гидрофильности делается ссылка на работу C. Trommel, J. Theor. Biol. 111 (1984), 247-260 (табл.1).

Со ссылкой на приведенную формулу I отметим, что предпочтительно не более 7 заместителей Х отличаются от аминокислотного остатка в соответствующем положении молекулы человеческого инсулина. Предпочтительнее наличие 2-4 замещений.

Предпочтительные варианты воплощения изобретения.

Замещения аминокислотных остатков предпочтительно выбирают, из группы, включающей Asp, Glu, Ser, Thr, His и Ile , и более предпочтительно - отрицательно заряженные аминокислотные остатки, т.е. Asp и/или Glu.

Новый аналог человеческого инсулина может предпочтительно содержать Asp и/или Glu вместо одной или большего числа гидроксиаминокислот человеческого инсулина, или вместо одного или нескольких Glu и Asn человеческого инсулина.

Новые аналоги человеческого инсулина могут, кроме того, предпочтительно содержать Ser и/или Thr или Asp и/или Glu вместо одного или нескольких аминокислотных остатков человеческого инсулина с алифатической и/или ароматической боковой цепью.

Новые аналоги человеческого инсулина могут также предпочтительно содержать His вместо одного или нескольких аминокислотных остатков человеческого инсулина с алифатической и/или ароматической боковой цепью, или вместо одной или нескольких гидроксиаминокислот человеческого инсулина.

Предпочтительными сайтами замещений являются B9, B10, B12, B26, B27 и B28, предпочтительно B9, B12, B27 и B28, и в этих положениях одно замещение может быть достаточным для достижения пониженной склонности к самоассоциированию и большего быстродействия при употреблении.

Замещение аминокислотного остатка в положении B9 может быть выбрано из группы, включающей Asp, Pro, Glu, Ile, Leu, Val, His, Thr, Gln, Asn, Met, Tyr, Trp и Phe, и более предпочтительно из группы, включающей Asp, Glu, Gln, Asn и His.

Замещение аминокислотного остатка в положении B12 может быть выбрано из группы, включающей Ile и Tyr. Замещение аминокислотного остатка в положении B10 может быть выбрано из группы, включающей Asp, Arg, Glu, Asn и Gln, и в положениях B26, B27 и B28 замещения аминокислотных остатков являются предпочтительно Asp или Glu.

И в остальных положениях молекулы инсулина в минимум двух замещениях (предпочтительно в сочетании с вышеупомянутыми положениями) необходимо добиться улучшенных характеристик. B этих положениях могут быть сделаны замещения, представленные на фиг.2.

Дальнейшими предпочтительными соединениями согласно настоящему изобретению являются аналоги инсулина, в которых замещения находятся в следующих положениях: B27, B12, B9, (B27+B9), (B27+A21), (B27+B12), (B12+A21), (B27+B17), (B27+A13), (B27+B16), (B27+A10), (B27+B28), (B27+B26), (B27+B10), (B27+B1), (B27+B2), (B27+B5), (B27+B14), (B27+B18), (B27+B20), (B12+B17), (B12+A10), (B12+A13), (B12+B16), (B12+B1), (B12+B2), (B12+B5), (B12+B10), (B12+B26), (B12+B28), (B9+B17), (B9+A13), (B9+B16), (B9+A8), (B9+A9), (B9+A10), (B9+B1), (B9+B2), (B9+B5), (B9+B10), (B9+B12), (B9+B14), (B9+B28), (B9+B18), (B9+B20), (B9+B26), (B27+B9+A21), (B9+B27+A8), (B27+B12+A21), (B27+B12+B9), (B9+B12+B27+B17), (B9+B12+B27+A13), (B9+B12+B27+B16) и (B12+B16+B17+B27+A10+A13).

Предпочтительными воплощениями вышеприведенной формулы I являются соединения, представленные на фиг.3, где X определены выше.

Другие предпочтительные аналоги инсулина формулы I согласно настоящему изобретению таковы, что в положении B27 X представляет собой Glu, в положении B12 X - Ile или Tyr, X в положении A21 - Asp и в положении B27 - Glu, X в положении B9 - Asp, X в положении A21 и в положении B9 - Asp, и в положении B27 - Glu, X в положении A8 - His, в положении B9 - Asp и в положении B27 - Glu, X в положении B10 - Asp, X в положении B28 означает Asp или X в положении B9 - Asp и в положении B27 - Glu.

B соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предлагаются растворы для инъекций, обладающие инсулиновой активностью. Инсулиновые растворы для инъекций согласно настоящему изобретению содержат описанные выше аналоги человеческого инсулина или их фармацевтически допустимую соль в водном растворе, предпочтительно при нейтральном pH. Водная среда может быть приготовлена изотонической добавлением, например, хлористого натрия и глицерина. Кроме того, могут быть добавлены буферы, такие как ацетат или цитрат, и консерванты, такие как м-крезол, фенол или метиловый эфир 4-гидроксибензойной кислоты. Далее, растворы инсулина могут содержать ионы цинка.

Аналоги человеческого инсулина согласно изобретению могут заменять человеческий или свиной инсулин в быстродействующих инсулиновых растворах, известных до сих пор.

Получение аналогов инсулина.

После появления методов рекомбинантных ДНК возможности конструирования белков стали огромными. С помощью методов так называемого сайт-специфичного мутагенеза появилась возможность изменять генное кодирование встречающихся в природе белков путем замещения любого одного или нескольких кодонов нативного гена кодоном(ами) для других встречающихся в природе аминокислот. B альтернативе модифицированный ген может быть создан химическим синтезом полной ДНК-последовательности общеизвестными методами. Цель такой манипуляции с геном природного белка в типичном случае заключается в изменении свойств природного белка в том или ином требуемом направлении.

Новые аналоги инсулина могут быть получены изменением проинсулинового гена путем замены кодона(ов) в подходящем сайте нативного гена человеческого проинсулина кодоном(ами), кодирующим(и) требуемое(ые) замещение(я) аминокислотных остатков или путем синтеза полной ДНК-последовательности, кодирующей требуемый аналог человеческого инсулина. Новый модифицированный или синтетический ген, кодирующий требуемый аналог инсулина, затем вставляют в подходящий экспрессионный вектор, который при переносе в подходящий организм-хозяин, например E. coli, Bacillus или дрожжи, вырабатывают требуемый продукт. Продукт экспрессии затем выделяют из клеток или культурального бульона в зависимости от того, является ли продукт экспрессии секретом клеток или нет.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ получения новых аналогов инсулина, описанный Marki et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360 (1979), 1619-1632). Они могут быть также получены из отдельно приготовленных in vitro A- и B-цепей, содержащих подходящие замещения аминокислотных остатков, после чего модифицированные A- и B-цепи связывают вместе путем установления дисульфидных мостиков согласно известным методикам (например, Chauce et al., b Rick DH, Gross E. (ред.) Peptides: Synthesis-Structure-Function Proc. of Am 7th American peptide Symp., с.721-728).

Новые аналоги инсулина предпочтительно получают реагированием биосинтетического предшественника, имеющего общую формулу II, представленную на фиг. 4, где Q_n - пептидная цепь с n встречающимися в природе аминокислотными остатками; R - Lys или Arg; n - целое число от 0 до 33; m - 0 или 1, а X - определены выше при условии, что пептидная цепь - Q_n-R - не содержит двух соседних основных аминокислотных остатков с L-треониновым эфиром в присутствии трипсина или производного трипсина и последующим преобразованием полученного треонинового эфира аналога человеческого инсулина в аналог человеческого инсулина известными методами. Так называемая реакция "транспептизации" описана в патенте США N 4343898 (материалы которого включены в виде ссылки).

С помощью реакции транспептизации мостик - (Q_n-R)_m между аминокислотой 29 в B-цепи и аминокислотой 1 и в A-цепи вырезается и треонинэфирная группа связывается с C-концом B29 Lys.

Предшественники вышеприведенной формулы II могут быть получены по методике, аналогичной описанной в европейском патентном описании N 0163529A, материалы которого включены сюда со справочными целями. С помощью этого метода ДНК-последовательность, кодирующая рассматриваемый предшественник, связывается с подходящим вектором экспрессии, который затем при переносе в дрожжевую клетку способен обеспечить экспрессию и секрецию требуемого соединения с правильно расположенными дисульфидными мостиками. Затем продукт экспрессии выделяют из культурального бульона.

Предлагаемые аналоги инсулина могут быть также получены реагированием биосинтетического предшественника общей формулы III, представленной на фиг. 5, где V и T представляют собой каждый Lys или Arg), а X - определены выше, в водном растворе с трипсином и карбоксипепсидазой-B, и выделением аналога человеческого инсулина из реакционного раствора.

Предшественники вышеприведенной формулы III могут быть получены по методике, аналогичной описанной в европейском патентном описании N 86302133.3, материалы которого включены сюда со справочными целями. Согласно этой методике ДНК-последовательность, кодирующую предшественник, встраивают в подходящий вектор экспрессии, который при переносе в дрожжи способен обеспечить экспрессию и секрецию продукта с правильно расположенными дисульфидными мостиками в среду культивирования.

Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предлагается способ получения новых аналогов инсулина, в котором дрожжевой штамм, содержащий реплицируемый вектор экспрессии, включающий ДНК-последовательность, кодирующую предшественник аналога инсулина, культивируют в подходящей питательной среде и предшественник выделяют из культуральной среды и преобразуют в новый аналог инсулина с помощью ферментно-химической конверсии in vitro.

Настоящее изобретение относится также к новым предшественникам новых аналогов инсулина, ДНК-последовательностям, кодирующим такие новые предшественники, векторам экспрессии, содержащим такие ДНК-последовательности, и дрожжевым штаммам, трансформированным с помощью таких векторов экспрессии.

Модифицированные аналоги инсулина.

Настоящее изобретение охватывает также некоторые производные и дальнейшие замещения аналогов инсулина при условии, что такие производные или дальнейшие замещения не оказывают значительного влияния на достижение вышеописанной цели изобретения. Соответственно, представляется возможным внести производные одной или нескольких функциональных групп в аминокислотных остатках. Примером такого получения производных является известное само по себе преобразование кислотных групп в молекуле инсулина в сложноэфирные или амидные группы, преобразование спиртовых групп в алкоксигруппы или наоборот и избирательное деамидирование. Например, A21 Asn может быть деамидирован в A21 Asp гидролизом в кислой среде, или B3 Asn может быть деамидирован в B3 Asp в нейтральной среде.

Возможно, далее, модифицировать рассматриваемые аналоги инсулина либо присоединением, либо удалением аминокислотных остатков на N- или C-концах. Аналоги инсулина согласно настоящему изобретению могут не иметь до четырех аминокислотных остатков на N-конце B-цепи и до пяти аминокислотных остатков на C-конце B-цепи, что не оказывает значительного влияния на общие свойства аналога инсулина. Примерами таких модифицированных аналогов инсулина являются аналоги инсулина, в которых отсутствует аминокислотный остаток B1 Phe или B30 Thr.

Кроме того, встречающиеся в природе аминокислотные остатки могут быть присоединены к одному или больше концу полипептидных цепей при условии, что это не оказывает значительного влияния на достижение вышеописанной цели.

Такие исключения или добавления на концах полипептидной цепи предлагаемых аналогов инсулина могут быть осуществлены in vitro на аналогах инсулина с аминокислотными замещениями согласно настоящему изобретению. В альтернативе ген новых аналогов инсулина согласно изобретению может быть модифицирован либо путем присоединения, либо удалением кодонов, соответствующих лишним аминокислотным остаткам или отсутствующим аминокислотным остаткам на концах полипептидной цепи соответственно.

Используемые для аминокислот сокращения соответствуют приводимым в J. Biol. Chem, 243 (1968), 3558. Аминокислоты находятся в конфигурации L.

Как использовано в последующем тексте, B(1-29) означает укороченную B-цепь человеческого инсулина от B1 Phe до B29 Lys, а A(1-21) означает A-цепь человеческого инсулина.

Замещения, произведенные в молекуле человеческого инсулина при реализации настоящего изобретения обозначаются приставкой со ссылкой на человеческий инсулин. Например, B27 Ghi-человеческий инсулин означает аналог человеческого инсулина, в котором вместо Thr в положении 27 в B-цепи вставлен Glu. B27 Glu, B9 Asp-человеческий инсулин означает аналог человеческого инсулина, в котором Glu вставлен вместо Thr в положении 27 B-цепи, и A Asp вставлен вместо Ser в положении 9 B-цепи. B27 Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-человеческий инсулин означает предшественник аналога инсулина (см. формулу II), в котором вставлен вместо Thr в положении 27 укороченной B-цепи (см. выше), а B(1-29)-цепь и A-цепь (A(1-21)) соединены пептидной последовательностью Ala-Ala-Lys. Если нет иных указаний, то следует понимать, что B(1-29)-цепь и A(1-21)-цепь соединены дисульфидными мостиками между A(7) Cys и B(7) Cys, между A(20) Cys и B(19) Cys соответственно, как в человеческом инсулине, и что A-цепь содержит внутренний дисульфидный мостик между A(6) Cys и A(11) Cys.

Как уже отмечалось, цель настоящего изобретения заключается в создании растворов быстродействующего инсулина для инъекций. В ходе достижения поставленной цели авторы изобретения впервые установили, что существуют значительные различия между инсулином в депо или болюсе и инсулином в кроветоке, включая совершенно неизбежное различие в концентрации инсулина. Более конкретно, инсулин в кроветоке является сильно разбавленным при содержании от 10^-11 до 10^-8 М и находится в мономерной форме, причем возможно некоторое количество инсулина находится в димерной форме. В гораздо более высокой концентрации накапливается в B-клеточных гранулах поджелудочной железы и в обычно принимаемом растворе находится в основном, если не главным образом, в неактивной гексамерной форме, например в виде общеизвестного 2-цинкгексамера.

Известно, что человеческий инсулин в растворе существует во многих молекулярных формах, а именно в виде мономера, димера, тетрамера и гексамера (Blundell et al. , Advances in Protein Chemistry, Academic Press, N.Y. -Zondon, 26, с. 279-330, 1972), причем олигомерным формам способствуют высокие концентрации инсулина, а мономер является наиболее активной формой инсулина. Тетрамер и гексамер не являются активными формами, и даже димер может быть неактивным. Заложенным в основу настоящего изобретения принципом является предположение автором, что выявленные ранее широко известные явления задержанного всасывания (Binder, Diabetes Care 7, N 1 (1984), 188-199) в значительной степени могут быть отнесены за счет времени, необходимого для диссоциирования инсулина из гексамерной, тетрамерной и димерной формы в (активную) мономерную форму.

Аналоги человеческого инсулина согласно изобретению обеспечивают свое быстродействие благодаря молекулярной структуре, которая не столь восприимчива к образованию димера, тетрамера, гексамера или полимера, т.е. характеризуется пониженной склонностью к самоассоциированию в димеры, тетрамеры, гексамеры или полимеры в присутствии или в отсутствии ионов цинка.

Давно признано, что значительные видовые различия аминокислотной последовательности, имеющейся в инсулине, свидетельствуют о том, что не все присутствующие в молекуле инсулина аминокислотные остатки являются важными для инсулиновой активности и что не существенные для инсулиновой активности некоторые аминокислоты важны для обеспечения физических свойств молекулы инсулина. Действительно, известно, что инсулин морских свинок не способен димеризоваться. Сульфатированный инсулин и тетранитротирозин-инсулин не димеризуется. Таким образом, многие из аминокислотных остатков молекулы человеческого инсулина могут быть изменены без существенного снижения инсулиновой активности. Предлагаемые здесь аминокислотные замещения в молекуле человеческого инсулина направлены на предотвращение образования димеров, тетрамеров, гексамеров или полимеров, не нарушая инсулиновой активности.

Аминокислотные остатки в положениях A-цепи и B-цепи формулы I, где могут быть произведены замещения, не являются критическими для инсулиновой активности, но они важны для обеспечения способности человеческого инсулина агрегироваться в димеры, тетрамеры, гексамеры или полимеры или для растворимости человеческого инсулина. Вносимые замещения аминокислотных остатков мешают соприкосновению атомов соседних молекул инсулина, которое способствует агрегированию в димеры, тетрамеры, гексамеры или полимеры.

Как и можно было бы ожидать, с точки зрения замещения изменения в некоторых положениях молекулы человеческого инсулина более эффективным, чем другие. В большинстве случаев одно единственное замещение в B-цепи может оказаться достаточным для ослабления склонности к самоассоциированию, тогда как для других остатков может потребоваться минимум два изменения. Замещения в A-цепи служат главным образом для улучшения растворимости диссоциированной молекулы. Предпочтительными положениями для осуществления замещений аминокислотных остатков являются B9, B12, B10, B26, B27 и B28 по отдельности, в сочетании друг с другом или вместе с замещениями в других местах молекулы инсулина, как это представлено в формуле I.

Замещение одного или большего числа отрицательно заряженных аминокислотных остатков вместо незаряженного или положительно заряженного аминокислотного остатка производится для создания более отрицательного заряда аналога человеческого инсулина при нейтральном pH и понижения изоэлектрической точки по сравнению с человеческим инсулином. Характерно, что аналоги человеческого инсулина согласно изобретению имеют тот же или более отрицательный заряд (при нейтральном pH) и более низкую изоэлектрическую точку, чем человеческий инсулин.

В большинстве случаев 1-3 замещения обеспечивают достижение непосредственных целей настоящего изобретения, а именно - получение более быстродействующего инсулина, что и составляет предпочтительные варианты воплощения изобретения. При использовании 2-3 замещений может быть достигнута улучшенная смешиваемость с защищенными инсулиновыми препаратами. Однако считается выгодным тот факт, что непосредственные цели настоящего изобретения могут быть достигнуты благодаря более, чем трем замещениям, поскольку это позволяет реализовать желательные вторичные цели.

В частности, дополнительный уровень замещения, например присутствие 4 или 5 аминокислотных остатков-заместителей, может давать аналог человеческого инсулина, который, кроме того, менее подвержен фибрилляции или полимеризации на границе раздела фаз, что является особенно желательным свойством, когда раствор инсулина предназначен для непрерывного вливания. В большинстве случаев для получения аналога человеческого инсулина согласно изобретению в молекуле инсулина реализуется не более 7 замещений. Предпочтительно 2-4 замещения.

Гены, кодирующие предшественники предлагаемых аналогов инсулина, могут быть получены модификацией генов, кодирующих описанные выше предшественники инсулина формулы II или III, в которых все X являются аминокислотными остатками человеческого инсулина, методами сайт-специфического мутагенеза для вставки или замещения кодонов или кодонами, кодирующими требуемую мутацию, ДНК-последовательность, кодирующая предшественник аналога инсулина, может быть получена ферментным синтезом из олигонуклеотидов, соответствующих всему или части гена предшественника аналога инсулина.

ДНК-последовательности, содержащие ген с требуемой мутацией гена инсулина, затем комбинируют с фрагментами, кодирующими TPI-промотор (TPIp) (T. Alber and G. Kawasaki, "Nucleotid Sequence of the triose phosphate isomerase gene of Saccharomycea cerevistac. J. Mol. Applied. Jenet. I (1982) 419-434), MF I-лидер-последовательность (J. Kurjan and I. Herskowitz "Structure of an yeast pheromone gene (MF альфа I): A putative -factor precursor contains four tandem coptes of mature -factor. Cell 30 (1982) 933-943) и последовательность окончания транскрипции из TPI дрожжей S. cerevisiae (TPI_T). Эти фрагменты дают последовательности, обеспечивающие высокую скорость транскрипции гена кодирования предшественника, а также дают предпоследовательность, которая может обеспечивать локализацию предшественника в секреторном контуре и в дальнейшую его экскрецию в среде для выращивания. Экспрессионные единицы, кроме того, снабжаются дрожжевым 2-мк началом репликации и выбираемым маркером LEU2.

Во время созревания альфа-фактора in vivo в дрожжах, последние (C-конец шесть аминокислот MF I-пептида-лидера (Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala) удаляют из предшественника альфа-фактора последовательно с помощью эндопептидазы, распознающей последовательность Lys - Arg, а аминодипептидазы, которая удаляет остатки Glu-Ala (Julius D. et al., Cell 32 (1983) 839-852). Для устранения необходимости в дрожжевой аминодипептидазе последовательность, кодирующую C-концевую Glu-Ala-Glu-Ala MF I-лидера, удаляют из MF I-последовательности-лидера с помощью мутагенеза in vitro. В последующем тексте "MF I-лидер" означает всю лидер-последовательность, тогда как "MF I-лидер (минус Glu-Ala-Glu-Ala)" означает лидер-последовательность, в которой удалена C-концевая последовательность Glu-Ala-Glu-Ala.

Пример 1. Построение синтетического гена, кодирующего B(1-29) Ala-Ala-Lys, -A-(1-21)-человеческий инсулин.

Дрожжевой кодон - оптимизированный структурный ген для В(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-человеческого инсулина строят следующим образом.

Нижеследующие 10 олигонуклеотидов, представленные на фиг. 6, синтезируют на автоматическом ДНК-синтезаторе с использованием фосфорамидитовых химпрепаратов на стеклянном носителе с контролируемым размером пор (S.Z. Beancage & M.H. Caruthers (1981) Jetrehedren Letters 22, 1859-1869).

Из указанных (фиг. 6) 10 лигонуклеотидов образуют 5 дуплексов A-E, как показано на фиг.7.

20 пмолей каждого из дуплексов A-Е образуют из соответствующих пар 5'-фосфорилированных олигонуклеотидов I-X нагреванием в течение 5 мин при 90^oC последующим охлаждением до комнатной температуры в течение 75 мин. 33-мер (X) в диплексе E не подвергают 5'-фосфорилированию, чтобы избежать димеризации комплементарных Xba I-однонитевых концов во время лигации. Пять дуплексов смешивают и обрабатывают T4-лигазой. Синтетический ген выделяют в виде полосы 182/183 п.о. после электрофореза лигационной смеси на 2% агарозном геле.

Полученный синтетический ген представлен на фиг.7.

Синтетический ген лигатируют с 4 к.п.о. KpnI-EcoRI-фрагментом и 8 к.п.о. XbaI-KpnI-фрагментом из pMT644 и 0,3 к.п.о. EcoRI-Hgal-фрагментом из pKFN 9 с получением следующей структуры: TPIp-MF I-лидер-B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-TPL_T.

Плазмида pMT644 содержит ДНК-последовательность TPIp-MF I-лидep-B(1-29)-A(1-21)-TPI_T и ее построение описано в патенте Дании N 1293/85. Построение плазмиды pKFN9 описано ниже.

Лигационная смесь использована для трансформации компетентного штамма E. coli (r^-, m⁺) (MT172). 30 ампициллин-резистентных колоний переносили на чашки, содержащие минимальную среду M9 (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Sprig Harbor Lab. 1982, с. 68), что приводило к 8 Leu⁺-колониям. Определение последовательности по Максэму-Джилберту для ³²P-XbaI-EcoRI-фрагмента показало, что три плазмиды содержат ген с требуемой последовательностью. Для дальнейшего использования использована одна плазмида pKFN27.

Конструкция плазмиды pKFN27 представлена на фиг.8.

Построение плазмиды pKFN9. Цель построения плазмиды pKFN9 заключается в получении плазмиды, содержащей сайт Hga I непосредственно после MF I-лидера. Плазмиду pMT544 (конструкция которой описана в патенте Дании N 278/85) разрезают с помощью Xba I и около 250 оснований удаляют с 3'-концов обработкой ExoIII-нуклеазой. Синтетическую 32-мерную вставочную затравку GGATAAAAGAGAGGCGCGTCTGAAGCTCACTC, содержащую Hga I-последовательность, гибридизуют до частично однонитевой ДНК. Двухнитевую кольцевую ДНК получают с использованием полимеразы Кленова и лигируют с помощью T4-лигазы. После трансформации E.coli (r^-, m⁺) (MT172) колонии, содержащие мутированную плазмиду, идентифицируют гибридизацией колоний с 5'-³²P-меченной 32-мерной вставочной затравкой. Появление нового Hga I-сайта подтверждается методом расщепления рестрикционным ферментом (EcoRI + HgaI, Hind 3 + HgaI). После повторной трансформации для дальнейшего использования выбирают "чистый" мутант pKFN9. Конструкция pKFN9 представлена на фиг.9.

Пример 2. Получение B27 Glu-человеческого инсулина.

B27 Glu-человеческий инсулин получают транспептидизацией B27 Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-человеческого инсулина с помощью Thr-OBu⁺ и ацидолизом полученного треонинового эфира трифторуксусной кислотой. Процесс получения состоит из следующих стадий: I. Построение гена, кодирующего B27 Glu, B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-инсулин.

Плазмиду pKFN27 располагают по единственному XbaI-сайту, расположенному сразу же за геном предшественника синтетического инсулина. Чтобы не разрушить XbaI-сайт при связывании на описанной ниже стадии, каждый конец линейной плазмиды лигируют 19-мерным Hind 3-XbaI-двунитевым линкером XbaI - Hind3 CTAGAAGAGCCCAAGACTA TTCTCGGGTTCTGATTCGA Линкер 5'-фосфорилирован на XbaI-однонитевом конце, но оставлен нефосфорилированным на Hind 3-конце, благодаря чему исключается полимеризация линкера во время стадии лигирования и получения кольцевой ДНК (см. фиг.10).

5'-мононуклеотиды удаляют с 3'-концов полученной линейной двунитевой ДНК с помощью обработки ExoIII-нуклеазой. Обработку ExoIII-нуклеазой осуществляют при 23^oC в условиях, при которых около 250 нуклеотидов удаляется с каждого 3'-конца ДНК (L. Guo and R.Wu (1983), Methods in Enzymdogy, lOO, 60-96).

5'-фосфорилированный 25-мерный мутагенный праймер d(GTTTCTTCTACGAACCTAAGGCTGC) гибридизуют мутационным сайтом. После связывания с помощью полимеразы Кленова в присутствии T4-лигазы двунитевую ДНК переваривают с помощью XbaI. Затем гетеродуплексную кольцевую ДНК с мутацией в одной нити с помощью T4-лигазы.

Лигированную смесь трансформируют в E.coli (r^-, m⁺) (MT172), выбираемые по резистентности к ампициллину.

Мутанты идентифицируют гибридацией колоний с 5'-32P-меченой 25-мерной мутагенной затравкой. После повторной трансформации показано, что плазмида pKFN37 на одной из результирующих колоний содержит требуемую мутацию по данным определения ДНК-последовательности 0,5 к.п.о. XbaI-EcoRI-фрагменты (A. Maxam and W.Gilbert (1980) Methods in Enzymology, 65, 499-560).

II. Трансформация.

S.cerevisiae штамм MT663 (E2-7B X EII-ЗC a/альфа, tpi/tpi, pep 4-3/pep 4-3) выращивают на YPGAL (1% бакто-дрожжевого экстракта, 2% бакто-пептона, 2% галактозы, 2% лактата) до получения оптической плотности ОД, равной 0,6 при длине волны 600 нм.

100 мл культуры центрифугируют, промывают 10 мл воды, повторно центрифугируют и вновь суспендируют в 10 мл 1,2 М сорбита, 25 мМ Na₂ЭДТК pH 8,0, 6,7 мг/мл дитиотреитола. Суспензию инкубируют 15 мин при 30^oC, центрифугируют и клетки повторно суспендируют в 10 мл 1,2 М сорбита, 10 мМ Na₂ЭДТК, 0,1 М цитрата натрия pH 5,8, 2 мг "Новозима 234". Суспензию инкубируют 30 мин при 30^oC, клетки собирают центрифугированием, промывают в 10 мл 1,2 М сорбита и в 10 мл CAS (1,2 М сорбита, 10 мМ CACl₂, 10 мМ Трис (Трис = трис(гидроксиметил)-аминометан) pH 7,5) и повторно суспендируют в 2 мл CAS. Для трансформации 0,1 мл CAS-ресуспендированных клеток смешивают с приблизительно 1