Полипептид, обладающий уратоксидазной активностью, фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), вектор экспрессии, содержащий фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), штамм, экспрессирующий полипептид, обладающий уратоксидазной активностью (варианты), способ получения полипептида, обладающего уратоксидазной активностью

Полипептид, обладающий уратоксидазной активностью, фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), вектор экспрессии, содержащий фрагмент днк, обеспечивающий экспрессию полипептида с уратоксидазной активностью (варианты), штамм, экспрессирующий полипептид, обладающий уратоксидазной активностью (варианты), способ получения полипептида, обладающего уратоксидазной активностью

Реферат

 

Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: новый полипептид с уратоксидазной активностью получен в результете культивирования штаммов, трансформированных ДНК, содержащими фрагмент ДНК уратоксидазы с выведенной аминокислотной последовательностью, которой необязательно предшествует метионин, со специфической уратоксидазной активностью не менее 16 ед/мг, с молекулярной массой 33,5 кд и изоэлектрической точкой, близкой к 8,0. В способе получения полипептида используются штамм бактерий Escherichia coli К 12 RR 1/р 466 или штаммы дрожжей Saccharomyces cepevisiae CNCM 1 - 920 или CNCM 1 - 919, или штамм культивируемых животных клеток Cos/pSV 860. 12 с. и 4 з.п. ф-лы, 14 табл., 16 ил.

Изобретение касается нового белка с уратоксидазной активностью, средств генной инженерии, используемых для производства этого белка, и, в частности, кодирующей его последовательности ДНК, вектора экспрессии этой последовательности, микроорганизмов и эукариотических клеток, трансформированных этим вектором.

Уратоксидаза (EC 1.7.3.3.), называемая также уриказой, является ферментом, участвующим в распаде пуринов. Этот фермент отсутствует у приматов, в частности, у человека, птиц, некоторых рептилий, большей части насекомых, у некоторых пород собак.

У человека пуриновые основания (аденин и гуанин) превращаются в ксантин. Ксантин окисляется ксантиноксидазой до мочевой кислоты, согласно реакции: кстантин + H₂O₂ _ мочевая кислота + O^-₂ Под действием супероксиддисмутазы радикал O^-₂ превращается в перекись водорода.

Являясь метаболитом крови, мочевая кислота присутствует там обычно в виде растворимой мононатриевой соли. Однако, у некоторых людей мочевая кислота осаждается и образует камни. Гиперурикемия (увеличение содержания мочевой кислоты в крови) обусловливает отложение мочевой кислоты в хрящевой ткани и вызывает подагру. Гиперурикемия также может влиять на функционирование почки: избыток мочевой кислоты в почках может к образованию камней, и к повреждению органа Повышенное образование мочевой кислоты может иметь различные причины: врожденные дефекты обмена, синдром Леще-Найхана, избыточное потребление пуринов и белков, лечение заболеваний крови, в частности онкологических, с помощью цитолитиков (химиотерапия) или рентгенотерапия (Gutman, A.Bet. yu T. Fu. (1968) Am. J. Med. 45-759-779).

Уратоксидаза фермент, катализирующий распад мочевой кислоты до аллантоина (соединение, в большей степени растворимое по сравнению с мочевой кислотой, не кристаллизующееся в биологических жидкостях), представляет таким образом терапевтический интерес. Используемая в виде инъекции она имеет преимущества в лечении гиперурикемии и нефролитиеза и прежде всего высокую скорость гипоурикемического эффекта (снижение гиперурикемии примерно на 50% за 24 ч), большую по сравнению с другими препаратами, такими, как аллопуринол (ингибитор ксантиноксидазы). В настоящее время этот фермент главным образом используется в качестве помощника цитолитиков в химиотерапии.

Уратоксидаза, используемая в настоящее время в качестве лекарства, получена по методике, включающей культивирование гриба Aspergillus flavus, выделение уратоксидазы из культуры экстракцией и многочисленные этапы частичной очистки этого белка(SU, патент 421162, 1967; SU, патент 457723, 1973 и др.). Этот метод, позволяющий получать уратоксидазу со специфической уратоксидазной активностью около 8 ед/мг, лишенную токсичных примесей, ограничивается рядом трудностей. Физиология и особенно генетика A. flavus часто не имеют устойчивого воспроизведения (Woloshuk et al. (1989) Applied. environ. microbiol. Vol. 55, р. 86-90). Следовательно, отсутствует возможность получения постоянных источников, которые производили бы данный энзим в больших количествах. С другой стороны, A. flavus продуцирует афлатоксины, которые порой трудно отделить. Таким образом, необходим контроль за тем, чтобы очищенный продукт был свободен от токсинов.

Таким образом, существует потребность в источнике более чистой уратоксидазы, обеспечивающем получение фермента в больших количествах.

Заявитель очистил уратоксидазу, выделенную из A. fiavus, называемую ниже экстрактивной, до значительно превосходящей известную для данного белка степень чистоты, определил частичную последовательность, создал два пула меченых зондов, способных гибридизироваться двумя участками этого белка, и получил кодирующую фермент последовательность DHK. Затем он создал вектор экспрессии, включающий в себя эту кДНК и с его помощью трансформировал штамм. E. coli K12 и убедился в том, что лизат клеток содержал рекомбинантный белок ожидаемой молекулярной массы, обладающий уратоксидазной активностью (способностью превращать мочевую кислоту в аллантоин).

Заявитель создал также множество векторов экспрессии для эукариотических клеток, содержащих кодирующие уретоксидазу фрагменты кДНК с некоторые вариациями последовательности.

Изобретение также касается лекарства, которое содержит описанный выше белок в фармакологически приемлемой форме. Согласно показаниям, оно может с успехом заменить экстрактивную уратоксидазу со специфической уратоксидазной активностью около 8 U/mg, имеющуюся в продаже под названием Урикозим (Vidal, 1990).

Изобретение касается также фрагмента ДНК, характеризующегося тем, что имеет последовательность нуклеотидов, кодирующую синтез белка с последовательностью аминокислот Последовательности 1-19 см. в конце описания.

По причине вырожденности генетического кода существует большое количество видов кодирующей ДНК для белка, аминокислотная последовательность которого отвечает формуле, приведенной выше. Среди них наиболее предпочтительна последовательность 3, в частности, приспособленная для экспрессии в прокариотах.

Последовательность DHK-4 предназначена для экспрессии в аукариотических клетках, например дрожжевых.

Для экспрессии в животных клетках предпочтительна ДНК-последовательность 5.

Ей предшествует нетранслируемая 5'-последовательность, способствующая экспрессии в животных клетках. Эта 5'-последовательность представлена олигонуклеотидом AGCTTGCCGCCACT. С помощью этих векторов были трансформированы эукариотические клетки, причем трансформанты были выращены как в малом, так и в большом объемах. Заявитель установил, что лизаты клеток содержали значительное количество рекомбинантного белка ожидаемой молекулярной массы и обладали уратоксидазной активностью.

Заявитель очистил этот рекомбинантный белок и последовательно сравнил его с уратоксидазой.

Таким образом, изобретение касается нового белка, который характеризуется тем, что проявляется специфическую уратоксидазную активность, равную по меньшей мере 16 ед./мг, и имеет последовательность аминокислот 1, в известных случаях предваряемую метионином или содержащую аминокислотные замещения без изменения активности.

Специфическая уратоксидазная активность этого белка преимущественно равна 30 ед./мг.

Анализом на двумерном геле показано, что рассматриваемый белок образует пятно с молекулярной массой примерно 33,5 кДа и изоэлектрической точной, близкой к 8,0.

Уровень очистки данного белка, определенный с помощью жидкостной хроматографии на колонке с привитым кремнием CB, превышает 80% Следует отметить, что белок, закодированный описанной выше последовательностью кДНК, может подвергнуться воздействию метиониламинопептидазы, которая отщепляет от него метиониновый аминоконцевой радикал.

Изобретение касается также вектора экспрессии, который вкупе с элементами, необходимыми для экспрессии, несет ДНК-фрагмент, описанный ранее.

Для экспрессии в прокариотических клетках, в частности в E.coli, кодирующая последовательность должна быть включена в вектор экспрессии, состоящий, в частности, из промотора, следующего за ним сайта связывания рибосом, находящегося перед структурным геном, и сайта терминации транскрипции, расположенного после него. Вектор должен также включать в себя "ориджин" репликации и селективный маркер. Все элементы должны подбираться в зависимости от вида клетки-хозяина.

Для экспрессии в эукариотической клетке вектор экспрессии, согласно изобретению, несет кодирующую последовательность, описанную выше, вкупе с участками, необходимыми для его экспрессии и репликации в эукариотических клетках, а также для селекции трансформированных клеток. Предпочтительно, чтобы вектор нес селективный маркер, подобранный так, чтобы, например, дополнять мутацию эукариотических клеток-реципиентов и обеспечивать отбор клеток с интегрированной последовательностью.

Для экспрессии в животных клетках, например, в клетках яичника китайского хомяка (CHO), кодирующая последовательность ДНК включается в плазмиду (например, производную pBR 322), имеющую составляющие, необходимые для экспрессии. Последовательность вокруг ATG сайта инициации выбирается согласно описанию Kozak (M. Kozak (1978), Cell. 15, 1109-1123) и располагается перед структурным геном, в то время, как последовательность, включающая сайт полиаденилирования, (например, последовательность полиаденилирования SV40)- в конце встраиваемого гена. Еще одна составляющая включает в себя маркер селекция, например ген, колирующий дегидрофолатредуктазу ( DHFR). Плазмида включается в животные клетки CHO DHFR^-, не способные синтезировать DHFR. Потомство отбирается по его резистентности к метотрексату.

Для экспрессии в эукариотических клетках, таких, как дрожжи, например, Saccharomyces cerevisiae, следует разместить кодирующую последовательность между действующим в дрожжах промотором, с одной стороны, и терминатором транскрипции с другой Совокупность промотор=кодирующая последовательность-терминатор, называемая "кассетой экспрессии", клонируется либо в плазмидном монокопийном или поликопийном векторе для дрожжей, либо интегрируется в геном дрожжей.

Изобретение касается также штаммов культивируемых эукариотических клеток, трансформированных описанным выше вектором экспрессии. Среди них выделяют штаммы вида Saccharomyces cerevisiae в частности те, что содержат мутацию в одном из генов, отвечающих за синтез лейцина или урацила, например, ген Leu 2 или ген Leu 3.

Изобретение касается также линий культивируемых животных клеток, содержащих чужеродный ген вместе с регуляторными областями, нужными для экспрессии. Введение в клетку может осуществляться через трансфекцию выше упомянутым вектором, инфекцией несущего его вируса или микроинъекцией.

Изобретение также рассматривает процесс получения рекомбинантной уратоксидазы, включающей следующие этапы: культивирование описанного выше штамма; лизис клеток; выделение и очистку рекомбинантной уратоксидазы, содержащейся в лизате.

Изобретение легче понять при помощи следующих примеров: большая часть изложенных ниже технологий хорошо известна специалистам и детально изложена в работе Maniatis et. al. "Molecular cloning: a Laboratory manual", опубликованной издательством Cold Spring Harbor Press a New York.

Пример 1. Выделение мРНК из Aspergillus flavus.

Штамм А. flavus, продуцирующий уратоксидазу, был культивирован в условиях производства уратоксидазы, т.е. в среде, содержащей мочевую кислоту и имеющей следующий состав: глюкоза 15 г/л, MgSO₄, 7H₂O 1 KH₂PO₄ 0,75, CaCO₃ 1,2, мочевая кислота 1,2, KOH 0,5 г/л, соевое масло 0,66 мл/л, FeSO₄ 7H₂O 10 мг/л, CuSO₄, 5H₂O 1, ZnSO₄, 7 H₂O 3, MnSO₄, H₂O 1 мг/л.

pH среды был установлен равным 7,0 с помощью 1 М раствора H₂SO₄; далее проводили стерилизацию при 120^oC в течение 80 мин. В колбу Эрленмейера (5 л) высевали 1,5 л серы с количеством спор, равным примерно 1-(310)⁷). Культуру инкубировали примерно 40 ч при 30^oC и постоянном перемешивании (120 об/мин). Мицелий выделяется фильтрацией, промывается водой и замораживается жидким азотом. 15 мг мицелия (влажный вес) размораживается и вновь суспендируется в 45 мл лизирующего буферного раствора, затем повышается в такой же объем шариков (0,45 m в диаметре). Лизирующий буфер состоит из тиоцианата гуанидина. 4M, Трис HCl 10 мМ pH 7,6, ЭДТА 10 мМ, -меркаптоэтанола 50 мл/л. Суспензия мицелия измельчается в виброгенном измельчителе Zeumiihle в течение 5 мин.

Измельченный мицелий вынимается, а шарики отстаиваются. Надосадочная жидкость извлекается (примерно 45 мл) и погружается в 3М конечный раствор хлорида лития. Хранится при 0^oC. Через два дня проводят центрифугирование в течение 60 мин при 10000 об/мин. Надосадочная жидкость удаляется, а осадок помещается в 40 мл LiCl (3М) и вновь центрифугируется в течение 1,5 ч при 10000 об/мин). Прибавляется протеинкиназа K (SIGMA), 40 мг/мл додецилсульфата натрия и ЭДТА до 20 мМ. Инкубируют при 37^oC в течение 3 ч. Осаждение проводят двумя объемами этанола, затем осуществляют промывание 70%ным этанолом, перерастворение в 0,5 мл буфере TE(трис-HCl 10 мМ ЭДТА, 1 мМ pH 7,5), экстрагирование 2 раза в хлороформе, осаждают этанолом. РНК консервируются при -80^oC в спирте.

Пример 2. Очистка фракции поли=A⁺ РНК.

Примерно 1 мг РНК осаждается в течение 20 мин, при 4^oC (15000 об/мин), затем промывается 70%ным этанолом и высушивается.

Остаток растворяют в 1 мл буфере TE-буфере и вновь суспендируют перемешиванием. Олиго=дТ=целлюлоза типа 3 (выпускаемая Collaborative Research Inc. Biomedicals Product Division) готовится согласно рекомендациям изготовителя. РНК помещается на подготовленную олиго=дТ, легко встряхивается и нагревается при 65^oC в течение 1 мин.

Суспензия прибавляется к 0,5 М NaCl и осторожно перемешивается в течение 10 мин. Затем суспензия центрифугируется 1 мин при 1000 об/мин, надосадочная жидкость сливается, а осадок 2 раза промывается 1 мл буфера TE, содержащего 0,5 М NaCl. Надосадочная жидкость сливается. Элюирование полиаденилированной РНК достигается суспендированием осадка вместе с шариками целлюлозы в 1 мл буфера TE, нагреванием этой суспензии до 60^oC в течение 1 мин и перемешиванием в течение 10 мин. Последующее центрифугирование (1 мин при 1000 об/мин) позволяет, с одной стороны, собрать надосадочную жидкость, содержащую свободную растворенную м-РНК, и осадок с целлюлозы с другой стороны. Весь комплекс этих операций, начиная с элюирования, повторяется. Полученные таким образом надосадочные жидкости собираются, избыток целлюлозы удаляется центрифугированием, а надосадочная жидкость осаждается этанолом, содержащим NaCl, по обычной технологии (Maniatis op. prec.).

Пример 3. Создание банка кДНК.

Исходя из м-РНК, выделенных по методу, описанному в предыдущем примере, создается банк кДНК в векторе pTZ 19R (выпускаемом PHARMACIA). Этот вектор является плазмидой, содержащей полилинкер, имеющий уникальный сайт рестрикции.

Использованная техника клонирования описана в работе Caput et. al. Proc. Natl. Acad/ Sci. (USA) (1986) 83, 1670-1674). Она состоит из переваривания вектора с помощью PstI, достраивания цепочки поли ^oC к выступающему 3'-концу и последующей рестрикции с помощью BAmHI. Фрагмент векторной плазмиды очищается на колонке с сефарозой CL4B (PHARMACIA). Он включает цепочку поли- dC на одном конце, а другой конец является "липким" типа Bam HI. С другой стороны, mРНК подвергается обратной транскрипции, начиная с праймер=участка, последовательность которого 5' <GATCCGGGCCCT (12) <3. Таким образом, кДНК оказываются представленными на своем 5' конце последовательностью GATCC, комплементарной липкому концу BamHI.

Гибриды ДНК=РНК, полученные в результате действия обратной транскриптазы, подвергаются щелочному гидролизу, позволяющему освободиться от РНК. Однонитевые кДНК очищаются на колонке с сефарозой CL4B и подвергаются воздействию концевой трансферазы с целью прибавления поли=dG 3' конца, кДНК вводятся в виде простой нити в вектор, подготовленный способом, описанным выше. Следующий олигонуклеотид (адаптор), комплементарный праймеру, необходим для генерации сайта Bam HI, "открытого" на 5' конце кДНК. После гибридизации вектора кДНК и адаптора рекомбинантные молекулы сшиваются под действием лигазы фага T4. Полученный таким способом пул плазмид служит для трансформации штамма MC 1061 и отбора по резистивности к ампициллину (Casabadom Chou et Cohen, J. Bact. (1980) 143 р. 971 980).

Пример 4.

Очистка экстрактивной уратоксидазы A. flavus и ее характеристика.

Получение экстрактивной уратоксидазы из A. flavus (uricozyme Zaboratcries Clin. midy), обладающей специфической уратоксидазной активностью 8 ед./мл (специфическая уратоксидазная активность это отношение активности уратоксидазы, измеренной по тесту, описанному в примере 9, к массе общего белка, измеренной по методу Bradford: Anal. Biochem. 72, 248-254), включала очистку хроматографией на колонке привитой агарозы Redagarose 120 (SIGMA), концентрирование ультрафильтрацией и фильтрацию на полиакриламидагарозном геле Ultrogel ACA 44 (IBF) по следующему протоколу.

Этап 1: афинная хроматография на привитой агарозе Температура: 4^oC Колонка: PHARMACIA к 50/30; диаметр 50 мм; длина 33 см Смола: Red 120 агароза (3000 CI/R 0503 SIGMA); объем геля 410 мл, высота геля 20 см.

Уравновешивающий буфер: глицин/NaOH 20 мМ, pH 8,3.

Элюирующий буфер: глицин/ NaOH 20 мМ, NaCI 2М, pH 8,3.

Расход кондиционирования: 250 мл/ч Функциональный расход: 160 мл/ч Элюционный расход: 60 мл/ч В верхнюю часть колонки вносят раствор урикозима с помощью насоса с постоянным расходом. После адсорбции колонку промывают двумя объемами буфера уравновешивания. Элюируют градиентом следующего состава: глицин, NaOH, 20 мМ, pH 8,3 /глицин, NaOH, 20 мМ + NaCI 2М, pH 8,3. Общий объем градиента равен 10 объемам колонки. Регистрация хроматографирования велась при 280 нм; пул уратоксидазы собирался после отбора фракций, обладающих активностью, большей или равной 16 ед./мг.

Этап 2: концентрирование пула уратоксидазы ультрафильтрацией при помощи системы Биопасс, состоящей из мембраны для ультрафильтрации 10 кДа.

Этап 3: Температура: 4^oC Колонка PHARMACIA к50/100, диаметр 50 мм, длина 100 см.

Смола: полиакриламид агароза с амино- и гидроксильными группами - Ультрагель ACA 44 (IBF), объем геля 1,6 л, высота геля 80 см.

Уравновешивающий буфер: глицин/BaOH 20 мМ, pH 8,3.

Расход кондиционирования: 40 мл/ч Функциональный расход: 24 мл/ч С помощью насоса с постоянным расходом на колонку наносят пул концентрированной уратоксидазы. После нанесения образца продолжают пропускать через колонку буфер следующего состава: глицин НaOH 20 мМ, pH 8,3. После хроматографии промывают 2М НaCI до уровня поглощения при 280 нм < 0,05. Хранят в NaCl 2М при 4^oC. Регистрация процесса хроматографирования производится при длине волны 280 нм.

Пул уратоксидазы собирается после объединения фракций, обладающих следующими общими свойствами: специфическая уратоксидазная активность больше или равна 20 ед./мг. Только две полосы электрофореза при денатурирующих условиях и проявления нитратом серебра: интенсивная полоса 33 34 кДа; слабая полоса 70 71 кДа.

2. Характеристика очищенной экстрактивной уратоксидазы A. flavus.

Частичное секвенирование.

Для того чтобы получить информацию о последовательности аминокислот в очищенной экстрактивной уратоксидазе, позволяющую синтезировать зонды, необходимые для клонирования кДНК, была предпринята попытка прямого аминоконцевого секвенирования белка. Она не удалась по причине блокирования N-концевой аминогруппы (см. ниже).

Тогда было осуществлено частичное секвенирование уратоксидазы: расщепление белка протеолитическими ферментами (трипсин и протеаза V8 золотистого стафилококка): разделение полученных пептидов жидкостной хроматографии при высоком давлении (ЖХВД) с обратной фазой; определение последовательности очищенных пептидов.

Гидролиз уратоксидазы трипсином, последующие очистка и секвенирование проводились следующим образом. Уратоксидаза (9 мг/мл в карбонатно-аммонийном буфере 10 мМ, pH 8,9) была переварена трипсином (Worthington. ТРСК) в весовом соотношении уратоксидаза/трипсин 30:1 при 30^oC в течение 24 ч. После гидролиза трипсином 60 г переваренной уратоксидазы было непосредственно нанесено на колонку ЖХВД с обратной фазой с привитым кремнием Браунли Gl8 (колонка 10 х 0,2 см), уравновешенную смесью 1%-ный ацетонитрил (об/об) и 0,1% -ная трифторуксусная кислота (об/об) в воде. Затем пептиды были элюированы линейным градиентом ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты (об/об) в воде, с увеличением концентрации ацетонитрила от 1 до 60% за 60 мин и расходом 150 mл мин. На выходе из колонки пептиды разделялись по измерению оптической плотности при 218 нм.

Кривая элюирования представлена на фиг. 1, где номера, следующие за буквой "Т" (трипсин) соответствует установленным пикам.

Каждый пик был собран и сохранялся при -20^oC до начала анализа на секвенаторе белков (модель Applied Biosystems), снабженным хроматографом (модель 430 Applied Biosystems), который постоянно анализирует фенилтиогидантоиновые производные, образующиеся после каждого цикла расщепления.

В табл. 1 показаны пептидные последовательности девяти выявленных пиков.

Гидролиз уратоксидазы протеазой V8, последующую очистку и секвенирование пептидов осуществляли следующим образом. Уратоксидаза (в концентрации 2 мг/мл в ацетат-аммонийном буфере 100 мМ, pH 6,8) была переварена протеазой V8 S. aureux (Боерингер-Мангейм) в соотношении оксидаза/протеаза V8 60:1 при 30^oC в течение 72 ч 160 г переваренной оксидазы было затем нанесено на колонку с обратной фазой с привитым кремнием Браунли G18 (колонка 10 х 0,2 см), уравновешенную смесью 1%-ного ацетонитрила и 0,1%-ной трифторуксусной кислоты в воде. Пептиды были затем элюированы линейным градиентом ацетонитрала в растворе трифторуксусной кислоты в воде (0,1% (об/об)) с изменением концентрации ацетонитрила от 1 до 60% за 60 мин, при расходе 150 л/мл.. На выходе из колонки пептиды обнаруживались путем измерения оптической плотности при 218 нм.

Кривая элюирования представлена на фиг. 2. Цифры, следующие за буквой "V" (протеаза V8), соответствуют обнаруженным пикам.

Каждый пик был собран и хранился при -20^oC до начала анализа на упомянутом выше секвенаторе белков.

В табл. 1 представлены также последовательности пептидов из пяти обнаруженных пиков.

Специфическая активность.

Очищенная экстрактивная уратоксидаза обладает специфической активностью порядка 30 ед./мг.

Электрофорез в денатурирующих условиях.

Электрофорез очищенной экстрактивной уратоксидазы на полиакриламидном геле в присутствии SDS с последующим проявлением серебром позволил увидеть весьма интенсивную полосу примерно 33 34 кДа, а также полосу очень слабой интенсивности 70 71 кДа.

Определение изоэлектрической точки.

Последовательность операций: использование гелей, готовых к употреблению, LKB Ampholines Gel Plates dt Pharmacia со значениями pH (3,5 9,5) и (5 8); нанесение 10 л контрольных белков LKB (спектр изоэлектрических точек контрольных белков от 3,5 до 9,5) и очищенной уратоксидазы в количестве 4 г и 8 г цикл 1,5 ч, 6^oC; окраска голубым куммасси (0,1%) в 25%-ном этаноле и 8% -ной уксусной кислоте с последующим обеспечиванием раствором, содержащем 25% этанола и 8% уксусной кислоты; оценка результатов: на каждой из двух сопоставленных полос наблюдаются изоэлектрические точки 8,1 и 7,9.

Анализ на двумерном геле.

Анализ на двумерном геле позволяет разделить белки вначале по их изоэлектрическим точкам, а затем по молекулярным массам.

Протокол.

Образец: раствор очищенной экстрактивной уратоксидазы в глициновом буфере, 20 мМ, pH 8,3.

Подготовка образца: два образца (5 и 10 г уратоксидазы; высушивание центрифугированием в вакууме, помещение в 5 л лизирующего буфера следующего состава: мочевина 2,5 М; (3-(3-холамидопропил)диметиламмоний)-1-пропансульфонат ХАПС (Sigma) (2% (об./об), амфотерные амфолины (LKB) с интервалом pH 5-8 и 3,5-9,5 (4,4%) и -маркаптоэтанол 5% Изоэлектрофокусирование.

Приготовление раствора, содержащего 9,5 М мочевину, 5% CHAPS, амфолины LKB (pH (3,5 9,5) 1% pH (5 8) 1%), 3,5% акриламид/бис-акриламид (28,4/1,7%) и H₂O. Раствор фильтруют и дегазируют, затем добавляют 0,075% тетраметилэтилендиамин (PHARMAKIA) и 0,015% персульфат аммония. Раствор выливают в трубки (16 х 0,12 см) и проводят полимеризацию в течение ночи при 20^oC.

Катодный раствор: NaOH 0,1М дегазированный, анодный раствор: H₃PO₄ 25мМ. Предцикл 45 мин, 4 мА (вольтаж 300 B _ 1 000B); скопление образцов на уровне катода; цикл 19 ч при 1000 B и при 20^oC. Гели вынимаются и уравновешиваются 10 мин при 20^oC в буфере (трис 0,375 М, pH 8,8 SDS 3% дитиотрейтол 50 мМ).

Денатурирующий гель PAGE/SDS.

Приготовление раствора, содержащего акриламид/бисакриламид (30/0,8%) с конечной концентрацией 15% трис-HCl (pH 8,8), 0,375 М, H₂O. Раствор фильтруется и дегазируется, а затем к нему добавляется SDS (0,1%), персульфатаммония 0,05% и ТЕМЕД 0,05%) Полимеризация в течение ночи при 4^oC (гель 16 х 20 х 0,015 см). Гель изоэлектрофокусирования после уравновешивания на поверхность геля PAGE/SDS. Электрофорезный буфер: трис-HCl 25 мМ, pH 8,3, глицин 0,192М, SDS O, 1%); Цикл 100 мА 6 ч, при 6^oC. Гель фиксируется в 50%-ном метаноле, 10% -ной уксусной кислоте, затем окрашиваются нитратом серебра (методика Blum H. Electrophoresis 1987, 8, Р. 93-99). Гель сканируется на видеоанализаторе 2000/Kodak для определения оптической плотности и поверхности каждого пятна, а следовательно, для подсчета количественного соотношения между пятнами. Молярная масса белка определяется при использовании двумерного геля в присутствии контрольных белков.

Результаты следующие: наблюдается два пятна с молекулярной массой, близкой к 33,5 кДа. Большая часть изоэлектрических точек близка к 8,0 интенсивностью 5,2, меньшая часть близка к 7,4 с интенсивностью 0,41.

Определение аминоконцевой последовательности и массы блокирующей аминоконцевой группы проводилось следующим образом.

Аминоконцевая последовательность анализировалась при помощи секвенатора (Applied Biosystem модель 470 А), снабженного анализатором фенилтиогидантоиновых остатков (Applied Biosystem модель 120А). Очищенная уратоксидаза (200 рмоль) была помещена в секвенатор в присутствии 20 рмоль лактоглобулина (контрольного белка). Не было обнаружено никакой аминоконцевой последовательности, уратоксидазы (аминоконцевая последовательность белка-контроля при этом была обнаружена). Следовательно, аминоконец уратоксидазы A. FLAVUS заблокирован.

Определение структуры аминоконцевого пептида из 32-х аминокислот и массы блокирующей N-концевой группы.

Расщепление цианогенбромидом.

Очищенная экстрактивная уратоксидаза с фильтрационного геля переносилась на гель, полученный сшивкой декстрана эпихлоргидрином, Сефадекс G25 (pD 10 - PHARMACIA), уравновешенный раствором, содержащим 7% муравьиную кислоту. Центрифугированием в вакууме концентрация муравьиной кислоты повышается до 70% затем прибавляют бромистый цианоген до конечной концентрации 0,2М; реакцию проводят в течение 20 ч под аргоном, в темноте, при комнатной температуре.

Разделение пептидных продуктов, расщепление белка ионообменной хроматографией.

Пептиды были разделены на ионообменной колонке с гидрофильной моно-S-смолой (PHARMACIA).

Буфер A: ацетат аммония 10 мМ, pH 6,2.

Буфер B: ацетат аммония 1 М, pH 6,2.

Расход: 0,6 мл/мин, определение пиков путем измерения оптической плотности при 278 нм.

Градиенты: от 0% до 100% "B" за 30 мин сбор фракций по 1 мл.

Фракции, полученные на этапе ионообмена, были проанализированы на PAGE/SDS по методике, описанной Schagger ct Uon Jagow (1987) Anal, Biochem. 166 р. 368-379.

Очистка N-концевого пептида ЖХВД с обратной фазой и определение его массы при помощи масспектрометрии.

Пептид, полученный на этапе ионообменной хроматографии и имеющий молекулярную массу примерно 400 Da (PAGE/SDS), был очищен на колонке ЖХВД с обратной фазой.

Расход: 0,3 мл/мин, определение циклов путем измерения оптической плотности при 218 нм.

Буфер A: H₂O/0,1% TFA (трифторуксусная кислота) Буфер B: ацетонитрил/0,1% TFA.

Градиент от 1 до 50% "В" за 60 мин.

После первого этапа ЖХВД с обратной фазой белок собирается и вновь очищается на той же колонке, но с другим градиентом.

Градиент от 1 до 50% "B" за 10 мин.

Полученный пик подвергается масс-спектрометрическому анализу бомбардировкой быстрыми атомами (FAB/MS) с матрицей глицерин+тиоглицерин.

Расщепление N-концевого пепетида химотрипсином и анализ полученных аминокислот, разделенных ЖХВД с обратной фазой.

Для определения структуры пептида, очищенного с помощью ЖХВД с обратной фазой, он был переварен химотрипсином. Полученные пептиды были разделены с помощью ЖХВД с обратной фазой на колонке Бэкман Альтекс C18 (250 x 2,1 мм).

Расход 0,5 мл/мин; определение пиков измерением оптической плотности при 218 нм.

Буфер A: H₂O/0,11% TFA.

Буфер B: ацетонитрил/0,08% TFA.

Градиент от 1 до 50% за 60 мин; и сбор пиков.

Химотрипсиновые пептиды идентифицируют аминокислотным анализом на анализаторе Applied Biosystem (модель 420-130A).

Результаты следующие: представленные ниже результаты, установленные после определения структуры кДНК уратоксидазы A.flavus и последовательности аминокислот (см. пример 6), невозможно понять без освещения следующих вопросов: Масс-спектрометрия аминоконцевого пептида.

Замечена разница, близкая к 42-м единицам атомной массы, между двумя массами, определяемыми масс-спектрометрией (3684 и 3666), и теоретически определенными молекулярными массами, исходя из "выведенной" на основе последовательности кДНК аминокислотной цепи уратоксидазы A.flavus (с учетом отщепления аминоконцевой метиониновой группы): Ser Ala Val Lys Ala Ala Arg Tyr Gly Lys Asp Asn Val Arg Val Tyr Lys Val His Lys Asp Glu Lys Thr Gly Val Gln Thr Val Tyr Gly (3642 или 3624) (см. последовательность 1).

Следовательно, на N-концевом серине имеется блокирующая группа, которая и сообщает дополнительную массу, приблизительно равную 42 ат. ед. м. и возможно, является результатом ацетилирования последнего (масса CH₃CO-масса H-42 ат.ед.м).

Анализ химотрипсиновых пепетидов.

Анализ позволил продемонстрировать повторно, что в структуру концевого пептида, полученного "переваром" цианогенбромидом, входит последовательность 1, определенная выше.

Полная последовательность аминокислот уратоксидазы приведена в последовательности 6.

Пример 5. Бактерии.

Подготовка маркированных зондов.

Два пуда зондов, выведенных из последовательности аминокислот белка, были синтезированы при помощи синтезатора ДНК Biosearch 4600. Первый пул соответствует последовательности His-Tyr-Phe-Clu-Ile-Asn (часть последовательности Т 27), и имеет от 5' к 3'-концу нуклеотидную последовательность Этот пул образован 48 различными олигонуклеотидами.

Второй пул соответствует последовательности аминокислотных остатков Gln-PHe-Trp-Gly-Phe-Leu (часть последовательности V5), имеет от 5' к 3'-концу нуклеотидную последовательность Этот пул образован 64 олигонуклеотидами.

Зонды были маркированы концевой дезоксинуклеотидтрансферазой (TdT).

Реакция осуществляется при использовании 100 нг смеси олигонуклеотидов в растворе объемом 1 мл, приготовленном на буфере "Кобальт" (поставляемом в 10-кратной концентрации IBI Inc: 1,4 M кокодилат R pH 7,2: 300 мМ дитиотреитол, 1 л фермента дезоксинуклеотидил-терминал-трансферазы и 50 Ci дезоксицитидилтрифосфата /dCTP/, маркированного P32).

Реакцию проводили при 37^oC в течение 10 мин и останавливали добавлением 1 л ЭДТА 0,5 М.

Экстрагировали фенолом и диализовали на колонке с Биогель P 10 (Биоред: 150 1050).

Гибридизация и определение колоний, содержащих кДНК уратоксидазы.

Примерно 40000 колоний было проанализировано при помощи гибридизационной техники in situ разработанной Grunstein et Hogness (1975, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA), 423961). Пять из этих колоний были выведены и очищены. Из каждой пяти колоний была изолирована плазмидная ДНК; ее анализировали рестрикцией BamHI или Hind III или BamHI Hind III одновременно.

После анализа на агарозном геле выяснилось, что 5 плазмид были линеаризованы при помощи Bam HI и Hind III. Двойное расщепление позволило высвободить фрагмент, соответствующий целой клонированной ДНК. Размер этого фрагмента приближается к 1,2 кв в трех случаях и к 0,9 кв в двух других. Для последующего анализа были отобраны и субклонированы один из фрагментов 0,9 кв и один из фрагментов размером 1,2 кв (см. пример 6).

Пример 6. Определение последовательности кДНК уратоксидазы.

Один из фрагментов размером 0,9 кв (клон 9A) и один из фрагментов размером 1,2 кв (клон 9C) были субклонированы в репликативную форму ДНК фага М13. ДНК клонов М13, содержащая фрагменты 0,9 и 1,2 кв, была расщеплена с получением вставок. (CycloneI Biosystem iBi). Последние были секвенированы известным методом (Sanger et. al. PNAS-USA-1977, 14, 5463-67).

Нуклеотидная последовательность клона 9C представлена на фиг. 3. Стрелкой обозначено начало клона 9A и нуклеотидным символом со звездочкой нуклеотиды клона 9A, не идентичные таковым клона 9C (после приведения в соответствие двух последовательностей по сайтам рестрикции AccI и Bam HI) (см. пример 10).

Было отмечено, что нуклеотидная последовательность более длинного фрагмента (клон 9C) перекрывает таковую более короткого (клон 9A) и имеет два отличия (фиг. 3). Одно из них "молчащее", а другое представляет собой замещение триптофана на глицин. Различаться они могут, имея или разницу в мРНК (пример 2) или погрешность обратной транскрипции, используемой при создании банка кДНК (см. пример 3). Секвенирование геномной ДНК уратоксидазы A. flavus показало, что более вероятной является погрешность при обратной транскрипции.

В случае более длинного фрагмента кодон ATG (в положении 109 на фиг. 3) начинает собой открытую рамку считывания, соответствующую полипептиду из 302 аминокислот с молекулярной массой около 34240 Da, последовательность которого соответствует секвенированной части последовательности очищенной уратоксидазы A. flavus (см. пример 40.

На фиг. 4 представлена структура ДНК, открываемая кодоном ATG, и кодируемый ею полипептид. Стрелками показаны пептиды, секвенированные (пример 4) после гидролиза уратоксидазы A. flavus трипсином или протеазой V8.

Полипептид заканчивается триплетом Ser Lys Leu типичным для ферментов с пероксисомальной локализацией. (Gould S.J. et al. Cell Biology 108 (1989) 1657 1664).

Пример 7. Конструкция вектора экспрессии кДНК уратоксидазы.

Была сконструирована плазмида p466, представляющая вектор экспрессии для E. coli. Она содержала фрагмент p8R 327, включающий источник репликации гена резистентности к ампициллину, синтетический промотор E. coli (R. Rodrigueg et m. Chamberlin "Promoters Structure and Function (1982 Preager), последовательность Shine Dalgarno полилинкер, представленный уникальными сайтами Nde 1 и Kpn 1, терминатор транскрипции (полученный из фага fd) b uty Laci, Плазмида была сконструирована на основе плазмиды для экспрессии hGH в E. coli (p462) путем замены фрагмента, несущего ген hGH на кДНК уратоксидазы.

Ниже будет более детально описана конструкция плазмиды p466. При ознакомлении с ней следует обращаться к фиг. 5 9.

На фиг. 5 представлена карта рестрикции плазмиды p163.1.

Различные сегменты рестрикции отмечены в произвольной манере на фиг. 6.

На фиг. 7 представлена карта рестрикции плазмиды p160, фрагменты которой Pvu I(I) Xhol-Bam (HI(I) и Pvul-ORI-BamHI происходят соответственно из плазмид p163, 1 и pBR 327, а малый фрагмент которой Bam Hi(2) Bam HI(I) является фрагментом 3, описанным ниже.

Фиг. 8 представляет карту рестрикции плазмиды p373,2.

Различные сегменты регистрации отмечены в произвольной манере на фиг. 9.

Фиг. 10 представляет карту рестрикции плазмиды p466/ Синтетический фрагмент Bgi II Hind III, описанный ниже, представлен в виде Фиг. 11 представляет карту рестрикции плазмиды p466, где фрагмент, содержащий последовательность, кодирующую уратоксидазу, обозначен как Конструкция плазмиды p373,2.

Работа проводилась с фрагментами, полученными из известных плазмид, а также с фрагментами, приготовленными с помощью синтеза, согласно широко используемым в настоящее время технологиям. Используемые технологии клонирования описаны T.Maniatis, E.F. Fritsch et J. Sambrook, Cold spribg Harbor Zaboratory (1982). Синтез олигонуклеотидов осуществлялся при помощи синтезатора ДНК Вiosearch 4600.

Плазмида p163,1 (фиг. 5), описанная в заявке EP A 0245138 и депонированная в CNCM под N 1 530 с датой 17.02.1986, была подвергнута расщеплению Pvu 1 и BamHI. Эта плазмида содержит ген, кодирующий hGH. Фрагмент Pvu 1 BamHI (фрагмент 1), содержащий сайт рестрикции XhoI, пре