Производные тиомочевины или их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция, способ ингибирования обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека

Производные тиомочевины или их фармацевтически приемлемые соли, фармацевтическая композиция, способ ингибирования обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека

Реферат

 

Использование: в медицине и биологии. Сущность изобретения - производные тиомочевины формулы I или их фармацевтически приемлемые соли (R₅R₆R₈)C - CH(R₉) - NH - C(=S) - NHR₁, где R₁ - 5-6-членные гетероциклы, содержащие азот, серу, незамещенные или замещенные алкилом C₁ - C₄, алкокси C₁ - C₃, CN, OH, CH₃S, NO₂, CF₃, галогеном; R₅ - арил, циклоалкил, гетероцикл; R₆ - водород, метил; R₈ и R₉ - независимо водород или метил или R₈ и R₉ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, -циклопропил или циклобутил, или R₆ и R₈ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, - циклопропил; фармацевтическая композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека, включающая в качестве активного начала эффективное количество производных формулы I. 7 табл., 4 с. и 16 з.п. ф-лы.

Изобретение относится к предлагаемым соединениям и их фармацевтически приемлемым солям и способам лечения инфекций ВИЧ и родственных вирусов и/или лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, включающим предлагаемые соединения, и способам применения таких соединений как таковых или в сочетании с другими средствами для лечения и ингибирования СПИД и вирусной инфекции от ВИЧ.

Полагают, что ретровирус, названный вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), является агентом, вызывающим сложное заболевание, названное синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), и относится к членам лентивирусного семейства ретровирусов (M.A.Gonda, F.Wong-Staal. N. R.G. Gallo. Гомологичность последовательностей и морфологическое сходство патогенных лентивирусов: ВЛТЧ III (HTL V III) и вируса Вишну. Science, 227, 173, 1985; P. Sonigo, N.Alizon и др. Нуклеотидная последовательность лентивируса Вишну, связь с вирусом СПИД. Cell, 42, 369, 1985). Вирус ВИЧ, также называемый вирусом СПИД, ранее бы известен под названиями ВЛА (LAY), ВЛТЧ-III или АРВ, а в настоящее время называется как ВИЧ-I. Другие близко родственные варианты ВИЧ-I, включающие ВИЧ-II и ВИО (вирус иммунодефицита обезъян), - их мутанты.

Сложное заболевание СПИД включает прогрессирующее разрушение иммунной системы и вырождение центральной и периферийной нервной системы. Вирус ВИЧ, видимо, преимущественно атакует Т-клетки-помощники (Т-лимфоциты и ОКТ4-несущие Т-клетки), а также другие клетки человека, например определенные клетки мозга. Т-клетки-помощники захватываются вирусом, в результате чего Т-клетки становятся продуцентами вируса. Т-клетки-помощники быстро разрушаются, их число в человеческом организме уменьшается в такой степени, что B-клетки организма, наряду с другими T-клетками, обычно стимулируемые T-клетками-помощниками, перестают нормально функционировать или продуцировать достаточно лимфокинов и антител для разрушения вируса-захватчика или других агрессивных микробов.

Хотя вирус сам по себе не обязательно является причиной смерти, тем не менее он проводит к такому тяжелому поражению иммунной системы, что человек перестает сопротивляться другими заболеваниям, таким как герпес, Pneumocistis carini, токсоплазмоз, цитомегаловирусная болезнь, саркома Каноси, лимфомы, связанные с вирусом Эпштейна-Барра среди прочих. Эти вторичные инфекции, как водится, подвергают отдельному лечению с помощью других медикаментов. На ранних этапах люди-носители ВИЧ живут вроде бы без симптомов болезни или при незначительном их проявлении, но остаются постоянно инфицированными. На более поздних этапах заболевания человек страдает от слабой депрессии иммунной системы с различными симптомами, такими как потеря веса, недомогание, лихорадка и набухание лимфатических узлов. Все эти симптомы получили название синдрома устойчивой генерализованной лимфаденопатии (УГЛ) и связанного со СПИД комплекса (ССК) и позднее переходят в СПИД.

Во всех случаях инфицированные вирусом СПИД, как полагают, остаются устойчиво инфекционными для других. Кроме того, СПИД и связанный со СПИД комплекс спустя некоторое время приводят к смерти.

Описание механизма, которым вирус инфицирует хозяина, приводится в статье (R.Yarchoan и S.Broder. Создание антиретровирусной терапии синдрома приобретенного иммунодефицита и родственных нарушений. New England Journal of Medicine, 316, 557-564, февраль 26, 1987).

Значительные усилия были направлены на борьбу с ВИЧ путем ингибирования обратной транскриптазы ВИЧ, необходимой для репликации вируса (Y.Merluzzi и др. Ингибирование репликации ВИЧ-I с помощью ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, Science, 25, 1411, 1990). К примеру, применяемого в настоящее время такое лекарственное средство, как АЗТ, является ингибитором вирусной обратной транскриптазы (патент США N 4724232). К сожалению, многие известные соединения отличаются токсичностью, отсутствием биодоступности или небольшой устойчивостью in vivo, вирусной устойчивостью или сочетанием того и другого.

Таким образом, цель изобретения заключается в создании соединений и их фармацевтическими приемлемых солей для ингибирования и/или лечения ВИЧ и СПИД.

Другая цель настоящего изобретения заключается в создании терапевтических составов, представляющих ценность для ингибирования и/или лечения инфекций ВИЧ и лечения или ингибирования синдрома приобретенного иммунодефицита.

Еще одна цель заключается в создании способов ингибирования и/или лечения инфекции ВИЧ и возникшего синдрома приобретенного иммунодефицита.

Другие цели, признаки и преимущества для специалиста станут очевидными из нижеследующих описания и формулы изобретения.

Настоящим изобретением являются соединения, применимые для ингибирования и/или лечения ВИЧ и СПИД либо в чистом виде, либо в виде фармацевтически приемлемых солей, компонентов фармацевтической композиции как в сочетании с другими противовирусными средствами, иммуномодуляторами, антибиотиками или вакцинами, так и без них. Кроме того, раскрываются способы лечения СПИД, способы ингибирования репликации ВИЧ и способы лечения или ингибирования ВИЧ у людей.

Соединения, применяемые в способах настоящего изобретения, представляют собой производные тиомочевины общей формулы I где R₁ - бензотиазол, бензимидазол, имидазол, пиразинид, пиразолил, пиридил, пиридазинил, хинолинил, нитразолил, тиазолил, тиадиазолил или триазолил, которые необязательно могут быть замещены заместителями, выбранными из следующей группы: C₁ -C ₄ - алкил, C₁ -C ₃ - алкокси, циано, гидрокси, метилтио, нитро, галоид, трифторметил; R ₅ представляет собой фенил, пиридил, пирролил, тиенил, бензотриазолил, бензоксазолил, нафтил, индолил, циклогексенил, некоторые из которых могут быть замещены вплоть до пяти положений заместителями, выбранными из следующей группы: амино, азидо, циано, нитро, гидрокси, галоген, метил, винил, этинил, трифторметил, C₁ -C₃ - алкокси, фенокси, фенил, метилендиокси, группа формулы -C(=0)R, где R представляет собой C₁ -C₃ - ацетамидометил, карбоксамидометил; R₈ и R₉ независимо представляют собой водород или метил или R₈ и R₉ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропил или циклобутил; R₆ представляет собой водород или метил или R₆ и R₈ вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют циклопропил, или их фармацевтически приемлемые соли, при условии, что соединение формулы I не является соединением формулы где R_d представляет собой водород, галоген, гидрокси, алкил или алкокси, или R₁ не представляет собой группу где R_e и R_f представляют низший алкил, или их соли.

Предпочтительными производными тиомочевины общей формулы I являются следующие соединения: N-(2-цис-фенилциклопропил)-N'-(2-тиазолил)тиомочевина, N-(2-цис-фенилциклопропил)-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-(2-цис-фенилциклопропил)-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(цис-2-пиридил)циклопропил]-N'-[2-(5-бром)пирилил]тиомочевина, N-[2-(цис-2-пиридил)циклопропил]-N'-[2-(5-хлор)пирилил]тиомочевина, N-{ 2-(цис-2-(6-фтор)пиридил] циклопропил}-N'-[2-(5-бром)пиридил] тиомочевина, N-{ 2-(цис-2-(6-фтор)пиридил] циклопропил} -N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{2-[цис-2-(6-метокси)пиридил]циклопропил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-(цис-2-(6-метокси)пиридил]циклопропил}-N'-[2-(5-хлор)пирилил] тиомочевина, N-{ 2-[цис-2-(6-этокси)пиридил)циклопропил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[цис-2-(6-этокси)пиридил] циклопропил} -[2-(5-хлор)пиридил] тиомочевина, N-[2-(3-метоксифенил)этил]N'-N'-[2-(4-циано)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(3-метоксифенил)этил]-N'-[2-(4-трифторметил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(3-метоксифенил)этил]-N'-[2-(4-этил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(3-метоксифенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(3-метоксифенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-этоксифенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-этоксифенил)этил]-N'-[2-(5-[хлор)пиридил]тиомочевина, N -[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[2-(4-циано)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[2-(4-трифторметил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[2-(4-этил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиразинил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифторфенил)этил]-N'-[3-(6-[хлор)пирилазинил]тиомочевина, N-[2-(2-фтор-6-метоксифенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-фтор-6-метоксифенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-хлорфенил)этил]-N'-[2-(4-циано)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(2-хлорфенил)этил]-N'-[2-(4-этил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(2-хлорфенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-хлорфенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(3-хлорфенил)этил]-N'-[2-(4-циано)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(3-хлорфенил)этил]-N'-[2-(4-этил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(3-хлорфенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(3-хлорфенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(1-циклогесенил)этил]-N'-[2-(4-циано)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(1-циклогексенил)этил]-N'-[2-(4-трифторметил)тиазолил]тиомочевина, N-[2-(1-циклогексенил)этил]-N'-[2-(4-этил)тиазолил]тиомочеивна, N-[2-(1-циклогексенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(1-циклогексенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(1-циклогексенил)этил]-N'-[3-(6-хлор)пирилазинил]тиомочевина, N-[2-(2,5-диметоксифенил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиразинил]тиомочевина, N-[2-(2,5-диметоксифенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиразинил]тиомочевина, N-[2-(2-пиридил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-пиридил)этил]-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-пиридил)этил]-N'-[2-(5-трифторметил)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-пиридил)этил]-N'-[2-(5-этил)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2-пиридил)этил]-N'-[2-(5-метил)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-метокси)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-метокси)пиридил]этил}-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-этокси)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-этокси)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-фтор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-фтор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(3-фтор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(3-фтор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-хлор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(6-хлор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[2-(3-метокси-6-фтор)пиридил] этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[2-(3-метокси-6-фтор)пиридил] этил}-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[2-(5-этокси-6-фтор)пиридил] этил} -N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[2-(5-этокси-6-фтор)пиридил] этил} -N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[2-(3-этокси-6-фтор)пиридил] этил} -N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{ 2-[2-(3-этокси-6-фтор)пиридил] этил} -N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(3,6-дифтор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина, N-{2-[2-(3,6-дифтор)пиридил]этил}-N'-[2-(5-хлор)пиридил]тиомочевина, N-[2-(2,6-дифтор-3-метоксифенил)этил]-N'-[2-(5-бром)пиридил]тиомочевина или их соли.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека, включающей активное начало и целевые добавки, причем в качестве активного начала композиция содержит эффективное количество производного тиомочевины формулы I или его фармацевтически приемлемую соль.

Как упомянуто выше, изобретение включает фармацевтически приемлемые соли соединений, определяемых приведенной формулой I. Хотя в целом и нейтральные, конкретные соединения могут обладать достаточно кислыми, достаточно основными или теми и другими функциональными группами, вследствие чего могут вступать в реакцию с любым из целого ряда неядовитых неорганических оснований и неядовитых неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых солей. Кислоты, обычно применяемые для образования соли с кислотой, являются неорганическими кислотами, таким как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и другие, и органическими кислотами, такими как n-толуолсульфокислота, метансульфоновая кислота, щавелевая кислота, n- бромфенилсульфокислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота и т.п. Примеры подобных фармацевтически приемлемых солей, таким образом, включают сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капроат, гептаноат, пропионат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин-1, 4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и т.п. К рекомендуемым фармацевтически приемлемым солям, образованным добавлением кислот, относятся соли с минеральными кислотами, такими как хлористоводородная кислота и бромистоводородная кислота, и органическими кислотами, такими как малеиновая кислота и метансульфоновая кислота.

Соли, образованные добавлением основания, включают соли, происходящие из неорганических оснований, таких как гидроксиды, карбонаты, бикарбонаты и тому подобное, аммония, щелочного или щелочноземельного металла. Таким образом, основания, применяемые для получения солей настоящего изобретения, включают гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, бикарбонат калия, гидроксид кальция, карбонат кальция и т.п.

Фармацевтически приемлемые соли изобретения обычно образуют реакцией соединения изобретения с эквимолярным или избыточным количеством кислоты или основания. Реагенты обычно смешивают в общем для них растворителе, таком как диэтиловый эфир или бензол для солей с кислотами и вода или спирты для солей с основаниями, в результате чего соли обычно осаждаются из раствора в пределах от одного часа до нескольких дней и могут быть выделены фильтрованием или иным обычным методом. Соли соединений изобретения после приема превращаются в само соединение, в силу чего являются предлекарствами. Все предлекарства вводят в количестве, достаточном для образования эффективного количества соединения, контактирующего с вирусом и взаимодействующего с ним (например, с ингибированием его репликации).

Соединения настоящего изобретения, кроме того, включают рацематы, рацемические смеси и отдельные энантиомеры или диастереомеры. Всякие асимметрические формы, отдельные и их комбинации, включены в объем настоящего изобретения. Как отмечено, оптически активные диастереомеры соединений формулы I рассматриваются как часть настоящего изобретения и такие оптически активные изомеры могут быть получены из их оптически активных предшественников по приведенным здесь методикам или разделением рецемических смесей. Разделение может быть осуществимо в присутствии разделяющего средства хроматографией, дробной кристаллизацией или сочетанием указанных методов, хорошо известных специалистам. Дополнительные подробности, касающиеся разделения, можно найти (Jaqgues и др. Энантиомеры, рацематы, их разделение. Джон Вили и сыновья, 1981).

Соединения настоящего изобретения или их предшественники получают методами, известными специалистам. Более конкретно, соединения формулы I синтезируют согласно методикам, иллюстрируемым нижеследующими схемами I, II и III и последующему пояснению к схемам.

Согласно схеме I производное изотиоцианата (1) реагирует с аминогруппой (2) в молярном отношении примерно 1:1 и инертном органическом растворителе, таком как N,N-диметилформамид с перемешиванием в течение 1-72 ч в температурном интервале 0-150 ^o C. Применяемые время и температура зависят от реакционности отдельных реагентов. Продукт (3) может быть выделен обычными методами.

Схему II реализуют в тех же общих условиях реакции, что и схему I.

Схема III иллюстрирует способ, аналогичный способу, описанному в работе (J.Org.Chem., т.49, 4123, 1984), приводимому здесь в качестве ссылки.

Соединения, применяемые в качестве начальных исходных продуктов в синтезе соединений настоящего изобретения, хорошо известны, если не являются товарными продуктами, и легко синтезируются стандартными методами, обычно применяемыми химиками-органиками.

Другие указания на синтез соединений изобретения можно найти в работах (Organic Synthesis, 45, 69, 1965; Journal of the American Cremical Society, 79, 1236, 1957; Organic Synthesis, 20, 69, 1940; Synthesis, май 1983 г, с. 391), приводимых здесь в качестве ссылок.

Испытания вышеперечисленных соединений формулы I показали их активность в качестве ингибиторов ВИЧ. Не желая быть связанными теорией, тем не менее полагаем, что соединения действуют в качестве ингибиторов обратной транскриптазы, вследствие чего ингибируют репликацию вируса.

Ниже следует описание систем испытания, применяемых для анализа эффективности соединений по отношению к ВИЧ.

Испытания А, B, C и D(ХТТ).

Клетки МТ-4 в среде RPMI-1640. 5% ПСТ (плодной сыворотки теленка), пенициллина /стрептомицина доводят до концентрации 2 10₅ клеток /мл и высевают в микропланшеты (96 ячеек/планшет) в количестве 100 мл клеточной суспензии на ячейку, что дает 2 10⁴ клеток на ячейку. Испытуемое соединение готовят в виде смеси концентрацией 10 мг/мл в ДМСО и хранят при -20 ^oC. Соединение в ДМСО разбавляют средой, содержащей 10% ДМСО, в серии с 10-кратным разбавлением и получением растворов концентрацией 1, 10 и 100 мг/мл. Дальнейшее разбавление до концентрации 400, 40, 4 и 0,4 мг/мл проводят в среде, содержащейся в микропланшетах. 50 мл растворов с концентрацией 400, 40, 4 и 0,4 мг/ мл с помощью многоканальной пипетки переносят в содержащие клетки микропланшеты (конечная концентрация 100, 10 и 1 мг/мл). Наконец, в каждую ячейку вносят 50 мл уксусной суспензии (с помощью воспроизводящей многоканальной пипетки Эппендорфа). В каждом планшете имеется по меньшей мере шесть ячеек со следующим: испытание А - вирус ВИЧ-6, испытание В - вирус ВИЧ (II), испытание C - вирус ВИО, испытание D - отсутствие вируса, отсутствие лекарства (контроль вируса) и шесть ячеек без вируса (контроль среды). Планшет помещают в пластиковый мешок и инкубируют шесть дней в атмосфере CO₂. В каждую ячейку планшета вносят 50 мл ХТТ - 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфонил)-5-[(фениламино)карбонил] -2H-тетразолий гидроксид(1 мг/мл в 0,01-0,02 мМ N-метилфеназоний метасульфата. После 6 ч инкубирования в атмосфере CO₂ планшеты покрывают адгезивным уплотнителем планшетов и осторожно смешивают в качалке. Оптическую плотность определяют при длине волны в 450 нм и ссылочной длине волны 650 нм. Процент снижения цитотоксичности, вызываемой вирусной инфекцией, подсчитывают согласно следующему соотношению: Испытания E, F, G, H: ВИЧ-1RT, ВИЧ-2RT, ВИО-RT, отсутствие вируса.

Клетки МТ-4/H9 доводят ло концентрации 2 10⁵ клеток/ мл в среде (RPMI-1640, 5% ПСТ, пенициллин/стрептомицин) и высевают в микропланшеты (96 ячеек/планшет) в количестве 100 мл клеточной суспензии на ячейку, что дает 2 10⁴ клеток/ячейку. Испытуемое соединение доводят до концентрации 10 мг/мл в ДМСО (исходный раствор, хранят при -20 ^oC). Растворенное в ДМСО соединение разбавляют в 25 раз в среде с получением концентрации 400 мг/мл. Дальнейшее разбавление проводят в микропланшетах до концентраций 40 и 4 мг/мл.

Многоканальный пипеткой в "содержащий клетки" микропланшет вносят 50 мл разбавлений в 400, 40 и 4 мг/мл (конечная концентрация 100, 10 и 1 мг/мл).

Наконец, в каждую ячейку вносят 50 мл вирусной суспензии (воспроизводящей многоканальной пипеткой Эппендорфа): испытание E - ВИЧ-1, испытание F-ВИЧ-2, испытание G-ВИО, испытание H-отсутствие вируса.

В каждом планшете имеется по меньшей мере четыре ячейки без лекарства, но с вирусом (контроль вируса) и две ячейки без вируса (контроль среды). Во избежание испарения планшет помещают в пластиковый мешок и инкубируют шесть дней в атмосфере CO₂. Надосадочную жидкость (10 мл) из каждой ячейки многоканальной пипеткой переносят в новый микропланшет в котором в каждую ячейку добавлено 40 мл DVB (50 мМ Трис-HCl с pH 7,6, 35 мМ KCl, 4 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТК, 1,3% Тритона Х-100). Добавление 50 мл реакционной RT-смеси (10 мл надосадочной жидкости культуры, 40 мл DVB и 50 мл реакционной смеси, что дает конечные концентрации в 100 мМ Трис-HCl с pH 7,6, 100 мМ KCl, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ ДТТ, 275 мг/мл ВСА/мл, 5 мг (rA)n(dT)_12-1/мл и 0,3 мМ 3HdTTP (удельная активность 18000 cpm\пмоль) дает конечный объем в 100 мл на ячейку. После 60 мин инкубирования полный анализируемый объем переносят с помощью клеточного сборщика на фильтровальную подушку, предварительно увлажненную 5% ТСА. Фильтр промывают 5% ТСА и один раз ополаскивают этанолом. После высушивания фильтровальной подушки (30 мин при 60 ^oC) каждый фильтрующий элемент (96 на подушку) выдавливают, помещают в сосуды для подсчета, добавляют 2 мл сцинтилляционной жидкости и ведут подсчет (1 мин) или же фильтровальную подушку целиком помещают в пластиковый мешок, добавляют 10 мл сцинтилляционной жидкости и счетчиком "Бекман Бетаплэйт" ведут подсчет для фильтровальной подушки. Процент уменьшения RT-активности определяют сравнением RT-активности для контроля вируса с RT-активностью, определенной для каждого разбавления соединения.

Испытание 1 [ВИЧ-RT(rAdt)].

Соединения испытывают на прямую ингибирующую активность относительно ВИЧ-RT в объеме 100 мл рекомбинантного ВИЧ-RT (разбавлен в лизирующем клетки буфере с получением 200000 cpm).

100 мМ Трис-HCl c pH 7,6, 100 mM KCl, 4 мМ MgCl₂, 4 мМ ДТТ, 275 мг/мл БСА, 0,5 мг (rА)_n(dT)_12-18 и 0,3 мМ H₃=dTTR (удельная активность 18000 cpm моль). После 60 мин инкубирования 40 мл дублей наносят в виде пятен на бумажные диски и промывают 5% ТСА. После ополаскивания бумажных дисков эталоном их сушат и ведут подсчет в сцинтилляционной жидкости.

Табл. 1-6 иллюстрируют активность соединений в вышеописанных испытаниях. Цифры показывают процент ингибирования.

К признакам изобретения, кроме того, относятся способ введения человеку, нуждающемуся в том, соединений изобретения или их фармацевтически приемлемых солей для лечения или ингибирования ВИЧ/СПИД с ингибированием репликации вируса ВИЧ/СПИД в инфицированных клетках человека и с ингибированием развития СПИД у человека, инфицированного ВИЧ/СПИД-вирусом, или созданием антител к ВИЧ/СПИД-вирусу.

Настоящее изобретение также раскрывает соединения изобретения и их соли, предназначенные для использования при лечении вышеуказанных симптомов, и применение таких соединений для приготовления фармацевтических составов для лечения указанных симптомов.

В целом, для указанного лечения приемлемая эффективная доза соединения или его фармацевтически приемлемой соли будет 0,5-250 мг на 1 кг массы тела реципиента в день. Введение может быть осуществлено любым приемлемым путем, в том числе перорально, ректально, насально, местно ( в том числе букквально и подъязычно), вагинально или парентерально (в том числе подкожно, внутримышечно, внутривенно или внутрикожно). Разумеется, предпочтительный путь введения может меняться в зависимости, например, от состояния, возраста и массы реципиента.

Вводимые компоненты могут быть использованы в виде лекарства в сочетании с другими лечебными средствами (другими противовирусными, антибактериальными соединениями, а также соединениями, применяемыми для профилактики возникающих вторичных или сопутствующих заболеваний, связанных с ВИЧ/СПИД), такими как AZT, ddI, ddC, 9-{[2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этокси]метил}гуатин, 9-(2-гидроксиэтоксиметил)гуанин (ацикловир), 2-амино-9-(2-гидроксиэтоксиметил)пурин, сурамин, рибаварин, сурмяновольфрамат (HPA-23), интерферон, например интерферон, интерлейкин II и фосфоноформиат (фоскарнет), или в сочетании с другими иммунными модуляторами, в том числе трансплантантами костного мозга или лимфоцитов, или иными медикаментами, такими как левамизол или тимозин, способными повысить число лимфоцитов и/или их функционирование.

К примеру, изучение комбинации AZT с соединением формулы показывает синергический эффект. Комбинация исследования против ВИЧ-1 в клетках CEM по методике Prichard u Shipman (Anfiviral Researсh, 14, 181-206, 1990). Пик синергизма наблюдается при 0,5 мкг/мл соединения приведенной формулы и 0,005 мкг/мл AZT.

Хотя используемые компоненты могут быть введены по отдельности, тем не менее рекомендуется их представление в виде части фармацевтического состава. Составы настоящего изобретения включают по меньшей мере вводимый компонент, определенный выше, в смеси с одним или несколькими приемлемыми носителями и возможно другими лечебными компонентами. Носитель(и) должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими компонентами и не оказания вредного действия на реципиента.

Такие составы исключают составы, пригодные для перорального, ректального, насального, местного (в том числе букквального и подъязычного), вагинального или парентерального (в том числе подкожного, внутримышечного, внутривенного и внутрикожного) введения. Составы могут быть представлены в единичных дозированных формах, например таблетках или капсулах отложенного действия, которые могут быть приготовлены известными фармацевтическими методами.

Такие методы включают стадию смешивания подлежащих введению компонентов с носителем, состоящим из одного или нескольких дополнительных компонентов. В целом, составы получают равномерным и тщательным смешиванием активных компонентов с жидкими носителями или мелко помолотыми носителями, или с тем и другим с последующим при необходимости формованием продукта.

Составы настоящего изобретения, пригодные для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, крахмальные облатки или таблетки, каждая из которых содержит заданное количество активного компонента, в виде порошка или гранул, в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости или в виде жидкой эмульсии типа масла в воде или типа вода в масле, в виде болюса и т.д.

Что касается композиций для перорального введения (например, таблеток и капсул) термин "приемлемый носитель" относится к обычным наполнителям, таким как связующие средства, например сироп, камедь акации, желатин, сорбит, трагакант, поливинилпирролидин (повидон), метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, сахароза и крахмал, наполнители и носители, например зерновой крахмал, желатин, лактоза, сахароза, микрокристаллическая целлюлоза, каолин, маннит, дикальцийфосфат, хлорид натрия и альгиновая кислота, дезинтеграторы, такие как микрокристаллическая целлюлоза, зерновой крахмал, натрийгликолят крахмала, альгиновая кислота и смазки, такие как стеарат магния и стеараты других металлов, стеариновая кислота, силиконовая жидкость, тальк, воск, масла и коллоидная окись кремния. Могут быть также использованы ароматизирующие добавки, такие как перечная мята, масло грушанки, вишневая отдушка и т.п. Может оказаться желательным добавление красителя с приданием дозировочной форме более приятного эстетического вида и с целью облегчения индентификации продукта.

Таблетки могут быть изготовлены прессованием или формованием, возможно с одним или несколькими дополнительными компонентами. Прессованные таблетки могут быть получены прессованием в подходящей машине активного компонента в свободно текучем состоянии, например, в виде порошка или гранул, возможно в смеси со связующим средством, смазкой, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным веществом или диспергирующим средством. Формованные таблетки могут быть получены формованием в подходящей машине смеси порошкообразного соединения, увлажненной инертным жидким разбавителем. На таблетки может быть нанесено покрытие или бороздки, таблетки могут быть приготовлены таким образом, чтобы обеспечить медленное или регулируемое выделение из них активного компонента.

Составы, пригодные для местного введения, включают лозенджис, включающий компоненты в ароматизирующей основе, обычно сахарозе и камеди акации или трагаканте, пастилке, включающие активный компонент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, сахароза или камедь акации, а также составы для полоскания рта, включающие подлежащий введению компонент в приемлемом жидком носителе.

Составы, пригодные для местного внесения в кожу, могут быть представлены мазями кремами, гелями и пастами, содержащими активный, подлежащий введению компонент и фармацевтически приемлемый носитель. Пример системы для местного введения представлен трансдермальным пластырем, содержащим подлежащий введению компонент.

Составы для ректального введения могут быть представлены свечами на соответствующей основе, например масле какао или салицилате.

Составы для насального введения, в которых носитель является твердым веществом, включают грубые порошки с размером частиц, например, в интервале 20-500 мкм, вводимые путем вдыхания, например при быстрой ингаляции через носовой ход, из контейнера с порошком при его поднесении близко к носу. Приемлемые составы, в которых носитель является жидкостью, представлены, например, насальными аэрозолями или насальными каплями в виде масляного или водного раствора активного компонента.

Составы, пригодные для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессария, тампона, крема, геля, пасты, пены или состава для опрыскивания, содержащих помимо активного компонента такие носители, которые, как известно, подходят для таких случаев.

Составы, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиокислители, буферные вещества, бактериостаты и растворимые вещества, придающие составу изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства и загустители. Составы могут быть представлены единичными дозами или в виде контейнера со многими дозами, например в виде запаянных ампул и сосудиков, и могут храниться в высушенном вымораживанием (лиофилизованном) состоянии, требующем всего лишь добавления стерильного жидкого носителя, например воды, для инъекций непосредственно перед употреблением. Импровизированные растворы и суспензии для инъекций могут быть получены из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа.

К рекомендуемым единичным дозированным составам относятся составы, содержащие ежедневную дозу, ежедневную субдозу согласно вышеприведенному определению или их соответствующую долю активного компонента.

Противовирусные соединения формулы I могут быть использованы в качестве поверхностных дезинфекторов. Растворы, содержащие всего лишь 0,1 мас.% противовирусного соединения, могут оказаться эффективными для целей дезинфекции. Рекомендуется, чтобы такие растворы также содержали детергент или другое осветляющее средство. Растворы могут быть использованы для дезинфекции таких объектов, как стеклянное оборудование, зубные и хирургические инструменты и поверхности, например стены, полы и столы, в тех местах, где важно поддержание стерильных условий, например в больницах, местах приготовления пищи и т.п.

При осуществлении способа лечения или ингибирования ВИЧ и/или СПИД антивирусное средство может быть введено в единичной ежедневной дозе или в виде нескольких доз в день. Режим лечения может потребовать введения в течение продолжительного времени, например в течение нескольких дней, нескольких месяцев или лет. Количество, вводимое с дозой, или общее вводимое количество зависит от таких факторов, как природа и тяжесть инфекции, возраст и общее состояние здоровья пациента, толерантность и пациента, и микроорганизма или микроорганизмов, участвующих в инфекции, к антивирусному соединению.

Нижеследующие примеры представляют собой характерные фармацевтические составы, содержащие соединения, относящиеся к настоящему способу. Составы в качестве активного компонента могут включать любое соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль. Примеры даются лишь с целью иллюстрации и ни в коей мере не предназначены для ограничения объема изобретения.

Состав 1.

Твердые желатиновые капсулы приготовляют, используя следующие компоненты, мг/капсула: Предлагаемое соединение - 1250 Высушенный крахмал - 200 Стеарат магния - 10 Указанные компоненты смешивают и смесью заполняют твердые желатиновые капсулы в количестве 460 мг.

Состав 2.

Таблетированный состав получают, используя приведенные компоненты, мг/таблетка: Соединение - 250 Микрокристаллическая целлюлоза - 400 Окись кремния, пыль - 10 Стеариновая кислота - 5 Стеарат магния - 10 Компоненты смешивают и прессуют в таблетки каждая массой 675 мг.

Состав 3.

Получают аэрозольный раствор, содержащий следующие компоненты, г: Соединение - 0,25 Этанол - 29,75 Пропеллент 22 (хлордифторметан) - 70,00 Активное соединение смешивают с этанолом и смесь добавляют к части пропеллента 22, охлаждают до -30 ^oC и переносят в заполняющее устройство. Затем контейнер из нержавеющей стали заполняют необходимым количеством и разбавляют оставшейся частью пропеллента. После этого на контейнере устанавливают клапан.

Состав 4.

Таблетки, каждая из которых содержит 60 мг активного компонента, получают из следующих компонентов, мг: Соединение - 60 Крахмал - 45 Микрокристаллическая целлюлоза - 35 Поливинилпирролидон (в виде 10%-ного раствора в воде) - 4 Натрийкарбоксиметилкрахмал - 4,5 Стеарат магния - 0,5 Тальк - 1 Активный компонент, крахмал и целлюлозу пропускают через сито N 45 меш (ст. США) и тщательно смешивают. Раствор поливинилпирролидона смешивают с полученным порошком и затем пропускают через сито N 14 меш (ст. США). Полученные в результате гранулы сушат при 40-60 ^oC и просеивают через сито N 18 меш (ст. США). К гранулам добавляют натрийкарбоксиметилкрахмал, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сито N 60 меш (ст. США), и после смешивания прессуют в таблетирующей машине с получением таблеток каждая массой 150 мг.

Состав 5.

Капсулы, каждая из которых содержит 80 мг лекарства, получают из следующих компонентов, мг: Соединение - 80 Крахмал - 59 Микрокристаллическая целлюлоза - 59 Силиконовая жидкость - 2 Активный компонент, целлюлозу, крахмал и стеарат магния смешивают, пропускают через сито N 45 меш и полученной смесью в количестве 200 мг заполняют твердые желатиновые капсулы.

Состав 6.

Свечи, каждая из которых содержит 225 мг лекарства, получают из следующих компонентов, мг: Соединение - 225 Глицериды насыщенных жирных кислот - 2 Активный компонент просеивают через сито N 60 меш (ст. США) и суспендируют в глицеридах насыщенных жирных кислот, предварительно расплавленных с применением минимального количества необходимой теплоты. Смесь затем выливают в форму для свеч номинального объема в 2 г и оставляют охлаждаться.

Состав 7.

Состав для внутривенного введения получают из следующих комп