Выделенный и очищенный фрагмент днк cry iiic, токсичный для жесткокрылых белок cry iiic, инсектицидная композиция для борьбы с жесткокрылыми насекомыми (варианты), штамм бактерий bacillus thuringiensis - продуцент токсичного для жесткокрылых белка cry iiic (варианты), токсичный для жесткокрылых белок, способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми

Выделенный и очищенный фрагмент днк cry iiic, токсичный для жесткокрылых белок cry iiic, инсектицидная композиция для борьбы с жесткокрылыми насекомыми (варианты), штамм бактерий bacillus thuringiensis - продуцент токсичного для жесткокрылых белка cry iiic (варианты), токсичный для жесткокрылых белок, способ борьбы с жесткокрылыми насекомыми

Реферат

 

Использование: сельскохозяйственная биотехнология, в частности биологическая защита растений от насекомых-вредителей. Сущность: из нового штамма Bacillus thuringiensis получен очищенный и выделенный фрагмент ДНК CryIIIC, который содержит нуклеотидную последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность белка CryIIIC, токсичного для жесткокрылых. Токсичный белок CryIIIC эффективен при использовании его в инсектицидных композициях в способе борьбы с жесткокрылыми насекомыми. 8 с. и 3 з.п. ф-лы, 7 табл., 12 ил.

Из нового штамма B.t. получен очищенный и выделенный ген типа cry III. Ген содержит нуклеотидную последовательность оснований, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 1-3. Белок 74,4 кДа, продуцируемый этим геном, представляет собой кристалл неправильной формы, токсичный для жесткокрылых насекомых, включая картофельного колорадского жука и насекомых рода Diabrotica.

Ген cry III бациллы THURINGIENSIS и белок, токсичный для жесткокрылых насекомых.

Данное изобретение относится к гену, выделенному из Bacillus thuringiensis (далее называется B.t), кодирующему инсектицидный кристаллический белок, обозначаемый Cry III, а также к инсектицидным композициям, содержащим этот белок, и к растениям, модифицированным с помощью этого гена. Инсектицидные композиции и трансформированные растения токсичны по отношению к отряду жесткокрылых и, в частности, токсичны для насекомых рода Diabrotica.

B. t. представляет собой грам-положительную почвенную бактерию, которая продуцирует кристаллические белки в процессе споруляции, особенно токсичные для насекомых определенных отрядов и видов. Было показано, что многие различные штаммы B.t. продуцируют инсектицидные кристаллические белки. Композиции, содержащие штаммы B.t., продуцирующие инсектицидные белки, производятся промышленностью и используются как приемлемые для окружающей среды инсектициды, поскольку они крайне токсичны для конкретного целевого насекомого, но безвредны для растений и нецелевых организмов.

Ряд генов, кодирующих кристаллические белки, были клонированы из нескольких штаммов B. t. Хороший обзор представлен в H. Hofte et al, Microbiol. Rev. , 53, pp. 242-255 (1989). Хотя этот источник не является известным прототипом по отношению к данному изобретению, он дает хороший обзор генов и белков, получаемых из B.t., и их применению, дает номенклатуру и схему классификации генов и белков B.t., а также содержит обширную библиографию.

Кристаллический B.t. белок активен только после того, как насекомое его съест. После съедания щелочная среда и протеолитические ферменты в среднем кишечнике насекомого растворяют кристалл, что позволяет выделить токсические компоненты. Эти токсичные компоненты разрушают клетки среднего кишечника, что заставляет насекомое прекратить питаться и, возможно, приводит к его смерти. Действительно доказано, что B.t. является эффективным и безопасным для окружающей среды инсектицидом при работе с различными насекомыми-вредителями.

Как отмечено Hofte et al, большинство инсектицидных штаммов B.t. активны против насекомых отряда чешуекрылых, т.е. гусеничных насекомых. Другие штаммы B. t. проявляют инсектицидную активность против насекомых отряда двукрылых, т.е. мух и комаров, или против и чешуекрылых, и двукрылых насекомых. В последние годы сообщалось о нескольких штаммах B.t., продуцирующих кристаллический белок, который проявляет инсектицидную активность по отношению к насекомым отряда жесткокрылых, т.е. жуков.

О первом выделении штамма B.t., обладающего токсичным для жесткокрылых действием, сообщалось A. Krieg et al. в Zangew. Ent., 96, pp. 500-508 (1983); см. также Krieg et al., Anz. Schaedlingskde, Pflanzenschutz, Umweltschutz, 57, pp. 145-150 (1984) и патент США N 4766203, выданный 23 августа 1988, A. Krieg et al. Сообщается, что штамм, обозначенный B.t. var. tenebrionis, является токсичным для личинок жесткокрылых насекомых Agelastica alni (жук-листоед голубой ольхи) и Leptinotarsa decemlineata (колорадский картофельный жук). B.t. tenebrionis дает инсектицидный кристаллический белок размером около 65-70 килоДальтон (кДа) (патент США N 4766203; см. также K. Bernhard, FEMS Microbiol Lett, 33, pp. 261-265 (1986).

V. Sekar et al. , Proc. Nate. Acad. Sci. USA, 84, pp. 7036-7040 (1987) сообщает о клонировании и охарактеризовании гена токсичного для жесткокрылых кристаллического белка, продуцируемого B.t. tenebrionis. Размер белка, как выводится из последовательности гена, составлял 73 кДа, однако выделенный белок содержал главным образом компонент 65 кДа. Hofte et al, Nucleic Acid Research, 15, p.7183 (1987) также сообщает о последовательности ДНК для клонированного гена из B.t. tenebrionis, причем последовательность гена идентична сообщаемой у Stkar et al (1987).

Mc Pherson et al., Bio/Technology, 6. pp. 61-66 (1988) раскрывает последовательность ДНК клонированного гена контроля насекомых из B.t. tenebrionis, и эта последовательность идентична сообщаемой у Sekar et al (1987). Обнаружено, что клетки E.coli и Pseudomonas fluorescens, содержащие клонированный ген, токсичны для личинок картофельного калорадского жука.

Токсичный для жесткокрылых штамм, обозначенный B.t. var. San diego, продуцирует, как сообщает C. Herrnstadt et al., Bio/Technology, 4, pp.305-308 (1986), кристаллический белок размером 64 кДа, токсичный для разнообразных жесткокрылых насекомых: сильная токсичность по отношению к Purrhalta luteola (жук-листоед ильма); умеренная токсичность по отношению к Anthonomus grandis (долгоносик хлопковый), Leptinotarsa decemlineata (картофельный колорадский жук), Otiorhinchus sulcatus (долгоносик бахчевый), Tenemrio molitor (хрущак большой мучной) и Haltica tombacina; слабая токсичность по отношению к Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка II-точечная).

Последовательность ДНК клонированного гена токсина жесткокрылых B.t. san diego сообщалась у C. Herrnstadt et al., Gene, 57, pp. 37-46 (1987); см. также патент США N 4771131, выданный 13 сентября 1988 г. Herrnstadt et al. Последовательность гена токсина B.t. san diego идентична сообщаемой у Sekar et al. (1987) для клонированного гена токсина жесткокрылых B.t. tenebrionis.

A. Krieg et al., J. Appl. Ent., 104, pp. 417-424 (1987) сообщает, что штамм B. t. san diego идентичен штамму B.t. tenebrionis, что доказывается разнообразными диагностическими тестами.

Еще один штамм B.t., обозначенный EG 2158, продуцирует, как сообщает W. P. Donovan et al., Mol. Gen. Genet. 215, pp.365-372 (1988), кристаллический белок весом 73 кДа, который является инсектицидом по отношению к жесткокрылым насекомым. Ген, кодирующий токсин, из EG 2158-штамма B.t. клонировали, инсеквенировали, и его последовательность оказалась идентичной последовательности, сообщаемой у Sekar et al. (1987) для клонированного гена B.t. tenebrionis токсина жесткокрылых. Этот ген токсина жесткокрылых назван cry IIIA у Hofte et al, Microbiol Rev., 53, pp. 242-255 (1989).

В патенте США N 4797279, выданном 10 января 1989 г., авторы Karamata et al, раскрывается гибридный микроорганизм, содержащий плазмиду из B.t. Kurstaki с геном токсина чешуекрылых и плазмиду из B.t. tenebrionis с геном токсина жесткокрылых. Гибридный B. t. продуцируют кристаллические белки, характерные для продуцируемых B.t. Kгrstaki, а также для B.t.tenebrionis.

Опубликованная заявка на Европатент N 0303379, опубл. 15 февраля 1989 г. Mycogen Corporation, раскрывает новый изолят B.t., идентифицированный как B. t. MT104, который обладает инсектицидной активностью против и жесткокрылых, и чешуекрылых насекомых.

Опубликованная заявка на Европатент N 0318143, опубл. 31 мая 1989 г, Lubrizol Genetics, Jnc, раскрывает клонирование, охарактеризование и избирательную экспрессию интактного, частично модифицированного гена из B.t. tenebrionis, а также перенос клонированного гена в микроорганизм-хозяин, что дает микроорганизм, способный продуцировать белок, обладающий токсичностью по отношению к жесткокрылым насекомым. Суммируются данные бисанализа на насекомых для B.t. San diego, воспроизведенные по Herrnstadt et al, Bio/Technology, 4, pp. 305-308 (1986). Включены также данные по B.t.tenebrionis из другого источника; сообщают, что B.t. tenebrionis проявляет сильную токсичность по отношению к колорадскому картофельному жуку, умеренную токсичность к western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) и слабую к блошке II-точечной Говарда (Diabrotica undecimpuncata).

Опубликованная заявка на Европатент N 0324254, опубл. 19 июля 1989 г., Jmperial Chemical Jndustries PLC, раскрывает новый штамм B.t., идентифицированный как A30, обладающий инсектицидной активностью против жесткокрылых насекомых.

Опубликованная заявка на Европатент N 0328383, опубл. 16 августа 1989 г. , Mycogen Corporation, раскрывает новый микроорганизм B.t. PS40D1, который обладает инсектицидной активностью против жесткокрылых насекомых.

Опубликованная заявка на Европатент N 0330342, опубл. 30 августа 1989 г. , Mycogen Corporation, раскрывает новый микроорганизм B.t., идентифицированный как B. t. PS86B1, который обладает инсектицидной активностью против жесткокрылых насекомых.

Эти последние четыре публикации не являются прототипами по отношению к данному изобретению.

B. t. tenebrionis, о котором впервые сообщил А. Krieg et al, был открыт вблизи Дармштадта, Германия, и полагают, что B.t.San diego, о котором сообщал Herrnstadt et al, был получен вблизи Сан Диего, Калифорния. B.t. штамм EG2158, о котором сообщал Donovan et al., был выделен из образца зерновой пыли из Канзаса. Таким образом, разнообразные штаммы B.t., выделенные из нескольких удаленных друг от друга местностей, содержали очевидно идентичный ген токсина жесткокрылых, ген cry IIIA.

В литературе нет, по-видимому, сообщений о каком-либо другом гене токсина жесткокрылых, помимо уникального гена B.t., впервые обнаруженного в B.t. tenebrionis более чем семь лет назад.

Более того, даже среди различных штаммов B.t., относительно которых сообщалось, что они имеют кристаллические белки, обладающие инсектицидной активностью против жесткокрылых насекомых, не было ни одного, который обнаружил бы значительную токсичность по отношению к личинкам и взрослым особям рода Diabrotica (жук-блошка длинноусая), который включает Western Corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) блошку II-точечную Говарда (Diabrotica undecimpunctata howardi) и northern corn rootworm (Diabrotica barberi). Ген cryIIIC по данному изобретению экспрессирует белок-токсин, обладающий количественно оцениваемой инсектицидной активностью против насекомых Diabrotica и среди них - жесткокрылых насекомых.

Один из аспектов данного изобретения относится к очищенному и выделенному гену токсина жесткокрылых, имеющему нуклеотидную основную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 1-3, и далее обозначаемому как ген CRYIIIC. Ген cryIIIC содержит кодирующую область, простирающуюся от оснований нуклеотида 14 до 1972, показанных на фиг. 1-3.

Другой аспект данного изобретения относится к инсектицидному белку, продуцируемому геном cryIIIC. Белок cryIIIC содержит аминокислотную последовательность, выведенную из нуклеотидной последовательности гена cryIIIC с основания 14 по 1972, что показано на фиг. 1-3. Белок проявляет инсектицидную активность против насекомых отряда жесткокрылых, в частности колорадского картофельного жука, и против насекомых рода Diabrotica.

Еще один аспект изобретения относится к биологически чистой культуре бактерии B.t., хранящейся в NRRL под номером поступления NRRLB-18533 и обозначаемой штамм B.t.EG4961. Штамм B.t.EG4961 несет ген cryIIIC и продуцирует инсектицидный белок cryIIIC. Биологически чистые культуры других B.t.-бактерий, несущих ген cryIIIC, также входят в объем данного изобретения.

Еще один аспект данного изобретения относится к инсектицидным композициям, содержащим в сочетании с приемлемым в сельскохозяйственном отношении носителем либо белок CryIIIC, либо ферментативную культуру штамма B.t., который продуцировал белок CryIIIC.

Изобретение также относится к методу контроля жесткокрылых насекомых путем нанесения на растение-хозяин таких насекомых инсектицидно эффективного количества белка CryIIIC либо ферментативной культуры B.t., в которой содержится белок CryIIIC. Метод применим к разнообразным жесткокрылым насекомым, включая колорадского картофельного жука, жука-листоеда ильма, завезенного ивового жука-листоеда и жука-блошку длинноусую.

Еще один аспект данного изобретения относится к рекомбинантной плазмиде, содержащей ген cryIIIC, биологически чистой культуре бактерии, трансформированной такой рекомбинантной плазмидой, причем бактерия это предпочтительно B.t., а также к растению, трансформированному геном cryIIIC.

Дальнейший аспект данного изобретения относится к методу повышения инсектицидной активности против жесткокрылых насекомых у инсектицидной композиции, содержащей белок-токсин жесткокрылых, который включает добавление или введение в композицию, содержащую белок CryIII, белка CryI в количестве, обеспечивающем эффект повышения инсектицидной активности композиции. Инсектицидные композиции, содержащие белок CryIIIC, и проявляемая белком CryI повышенная инсектицидная активность направлены против насекомых отряда жуков, в частности против колорадского картофельного жука и жука-блошки длинноусой.

Фиг. 1-3 показывают нуклеотидную основную последовательность гена cryIIIC и выведенную аминокислотную последовательность белка CryIIIC. Указан сайт связывания рибосомы (RBS). Указаны также сайты рестрикции HindIII и BamH1.

Фиг. 4 представляет собой фотографию окрашенного этидия бромидом геля агарозы, содержащего фракционированные по размеру нативные плазмиды штаммов B. t. EG2158, EG2838 и EG4961. Числа справа на фиг. 4 указывают приблизительные размеры в мегадальтонах (МДа) плазмид штамма B.t. EG4961.

Фиг. 5 представляет собой фотографию автора диаграммы, полученной переносом плазмиды, показанной на фиг. 4, на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизацией фильтра с cryIIIB зондом, 2,4 kilobase (кb), меченным радиоактивными изотопами, воздействие фильтра на рентгеновскую пленку. Число справа на фиг. 5 указывает размер в МДа плазмиды B.t. штамма EG4961, которая гибридизуется с зондом cryIIIB. Буква f справа на фиг. 5 указывает фрагменты, образующиеся при распаде плазмиды, гибридизующей cryIIIB.

Фиг. 6 представляет собой фотографию окрашенного этидия бромидом геля агарозы, содержащего ДНК из B.t. штаммов EG2158, EG2838 и EG4961, выделенных с помощью HindIII плюс EcoRI и разделенных на фракции по размерам электрофорезом. Панель, обозначенная stnd, представляет стандартный размер.

Фиг. 7 представляет собой фотографию авторадиограммы, снятой путем переноса фрагментов ДНК фиг. 6 на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизацией фильтра с меченным радиоактивными изотопами зондом cryIIIB, 2,4 кb, и воздействия фильтра на чувствительную к рентгеновским лучам пленку. Числа справа на фиг. 7 указывают размеры в кb рестрикционных фрагментов штамма B.t. EG4961, гибридизованных с зондом cryIIIB. Панель, помеченная stnd, представляет собой стандарт размера.

Фиг. 8 представляет собой фотографию окрашенного Coomassie додецилсульфат натрия - полиакриламидного геля, на котором показаны кристаллические белки, растворенные из B.t.-штаммов EG2158, EG2838 и EG4961. Числа справа на фиг. 8 указывают приблизительные размеры в кДа кристаллических белков, продуцируемых штаммов B.t. EG4961.

Фиг. 9 показывает карту рестрикции плазмиды pEG258. Расположение и ориентация гена cryIIIC показаны стрелкой. Ген, обозначенный "ген cryX", расположен в пределах области, указанной пунктирной линией. Asp заменяет Asp718, Bam заменяет BamH1, H3 заменяет Hind III и P заменяет Pst1 (расщепляющие ферменты). Показан также маркер масштабом 1 kb.

Фиг. 10, в основе которой лежит тот же масштаб, что и для фиг. 9, показывает карту рестрикции плазмиды pEG260, содержащей фрагмент размером 8,3 kb ДНК из штамма B.t. EG4961, где ген cryIIIC показан стрелкой, а ген cryX расположен в пределах области, указанной пунктирной линией. Кроме сокращений, принятых для расщепляющих ферментов на фиг.9, (RV/Asp) обозначает слияние EcoRV и Asp718 сайтов рестрикции, а (RV/Pst)обозначает слияние сайтов рестрикции EcoRV и Pst1.

Фиг.11, в основе которой лежит тот же масштаб, что и для фиг.9, показывает карту рестрикции плазмиды pEG269, содержащей ген cryIIIC, как показано стрелкой, как часть фрагмента ДНК из рекомбинантного штамма E.coli EG7233. Сокращения, использованные для pEC258 на фиг. 9, применимы и к этой фигуре. Кроме того, Sph обозначает сайт рестрикции Sph1, а S3A/Bam обозначает слияние сайтов рестрикции SauIIIA и BamH1.

Фиг. 12 представляет собой фотографию окрашенного Coomassie SDS - полиакриламидного геля. Гель показывает полосы белка, синтезированного следующими бактериальными штаммами: E.coli штамм EG7221 (puC18/Cry^-); E.coli штамм EG7218 (pEG258/CryIIIC⁺ cryX⁺); B.t. штамм EG7211 (pEG220/Cry^-); B.t. штамм EG4961 (cryIIIC⁺cryX⁺); B.t. штамм EG7220 (pEG260/cryIIIC⁺cryX⁺); B.t. штамм EG7231 (pEG269/cryIII⁺cryX^-). Числа справа от геля указывают приблизительные размеры в кДа кристаллических белков, продуцируемых этими штаммами.

Подробное описание предпочтительных примеров исполнения.

Выделение и очистка гена cryIIIC и кристаллического белка CryIIIC, токсичного для жесткокрылых, и характеристики нового штамма B.t. EG4961, который продуцирует белок CryIIIC, описаны в последующих примерах. Использование штамма B. t. EG4961 и кристаллического белка CryIIIC в инсектицидных композициях и методы также иллюстрируются примерами.

Примеры иллюстрируют также синергетические увеличения инсектицидной активности белка CryIII при введении белка CryI. Таким образом, инсектицидные композиции, отличающиеся сочетанием обоих белков CryIII и CryI, обеспечивают повышенную инсектицидную активность, в частности, по отношению к колорадскому картофельному жуку и блошке-жуку длинноусому, а также к другим насекомым.

Ген типа cryIII по данному изобретению, т.е. ген cryIIIC, обладает нуклеотидной последовательностью оснований, приведенной на фиг. 1-3. Кодирующая область гена cryIIIC простирается от нуклеотидного основания в положении 14 до положения 1972, показанного на фиг. 1-3.

Сравнение нуклеотидных пар оснований кодирующей области гена cryIIIC с соответствующей кодирующей областью cryIIIA гена по известному уровню техники указывает на значительные различия между двумя генами. Ген cryIIIC только на 75% гомологичен (позиционно идентичен) с геном cryIIIA.

Сравнение нуклеотидных пар оснований кодирующей области гена cryIIIC с соответствующей кодирующей областью гена cryIIIB, полученного из недавно открытого штамма B. t. EG2838 (NRRL поступление N B-18603), указывает, что ген cryIIIC на 96% гомологичен (позиционно идентичен) с геном cryIIIB.

Белок типа CryIII по данному изобретению, т.е. белок CryIIIC, который кодирует ген cryIIIC, обладает аминокислотной последовательностью, показанной на фиг. 1-3. В данном описании ссылки на "белок" CryIIIC являются синонимом описанию его как "кристаллического белка", "белкового токсина", "инсектицидного белка" и т.п., если из контекста не следует по-иному. Размер белка CryIIIC, как можно сделать вывод из последовательности ДНК гена CryIIIC, составляет 74,4 кДа.

Размер белка CryIIIB, как выводится из последовательности гена CryIIIB, составляет 74,2 кДа. Для известного белка CryIIIA, который кодируется геном cryIIIA, выведен размер 73,1 кДа.

Несмотря на очевидную аналогичность размера, сравнение аминокислотной последовательности белка CryIIIC с последовательностью известного белка CryIIIA показывает, что между ними существуют значительные различия. Белок CryIIIC только на 69% гомологичен (позиционно-идентичные аминокислоты) белку CryIIIA. Белок CryIIIC на 94% гомологичен белку CryIIIB. Тем не менее, несмотря на явную гомологичность белков CryIIIC и CryIIIB, показано, что белок CryIIIC - это совершенно отличный от CryIIIB белок вследствие значительно более высокой инсектицидной активности по сравнению с CryIIIB по отношению к отряду жесткокрылых и, в частности, к насекомым рода Diabrotica. Белок CryIIIC - это первый B.t. - белок, проявляющий заметную инсектицидную активность против жука-блошки длинноусого.

Данное изобретение охватывает мутантов и рекомбинантных или полученных методами генной инженерии производных гена cryIIIC, которые продуцируют белок, токсичный по отношению к жесткокрылым, с практически такими же свойствами, как и белок CryIIIC.

Ген cryIIIC также можно использовать как зонд гибридизации ДНК для определения аналогичных или близкородственных генов cryIII-типа в других штаммах B. t. Ген cryIIIC или его части, или его производные можно пометить для использования в качестве зонда гибридизации, например, радиоактивной меткой с помощью традиционных способов. Меченный зон гибридизации ДНК можно затем использовать способом, описанным в примерах.

Ген cryIIIC и соответствующий инсектицидный белок CryIIIC были вначале идентифицированы в штамме B.t. EG4961, в новом штамме B.t. Характеристики штамма B.t. EG4961 более полно описаны а примерах. Сравнение плазмидного ряда и других характеристик штамма B.t. EG4961 с характеристиками недавно открытого штамма B.t. EG2838 и известного штамма B.t. EG2158 показывает, что эти три токсичных по отношению к жесткокрылым штамма B.t. совершенно различны.

Ген cryIIIC можно ввести в различные микроорганизмы-хозяева с помощью хорошо известных методов трансформирования подходящего хозяина в условиях, позволяющих стабильное существование и экспрессию клонированного гена cryIIIC. Подходящие хозяева, позволяющие экспрессию гена cryIIIC и продуцирование белка CryIIIC, включают Bacillus thuringiensis и другие виды бацилл, такие как B. subtilis или B.megaterium. Должно быть ясно, что подвергнутые генетическим изменениям или полученные методами генной инженерии организмы, содержащие ген cryIIIC, могут также содержать другие гены токсинов, присутствующие в том же микроорганизме, и что эти гены могут одновременно продуцировать инсектицидные кристаллические белки, отличающиеся от белка CryIIIC.

Штаммы Bacillus, описанные в данном изобретении, можно культивировать на традиционной ростовой среде и стандартными ферментативными методами. Штаммы B. t. , содержащие ген cryIIIC, можно сбраживать, как описано в примерах, до тех пор, пока клетки B.t. в культуре не достигнут стадии цикла роста, когда образуется кристаллический белок CryIIIC. Для спорогенных штаммов B.t. сбраживание обычно продолжают и на стадии споруляции, когда вместе со спорами образуется кристаллический белок CryIIIC. Культуру B.t. затем собирают центрифугированием, фильтрацией и т.п. методами, чтобы отделить твердые, в которых содержится кристаллический белок CryIIIC, от водного бульона культуры.

Штаммы B. t. , примеры которых даются в данном описании, представляют собой спорообразующие разновидности (или спорогенные штаммы), но ген cryIIIC также используют в непосредственных штаммах Bacillus,т.е. в штаммах, продуцирующих кристаллический белок без продуцирования спор. Должно быть понятно, что ссылки на "бродящие культуры" штаммов B.t. (в которых содержится ген cryIIIC) в данном описании охватывают спорулированные культуры B.t., содержащие кристаллический белок CryIIIC и споры, и спорогенные штаммы Bacillus, которые продуцировали кристаллический белок на вегетативной стадии, а также неспорогенные штаммы Bacillus, содержащие ген cryIIIC, в которых культура достигла стадии роста, когда действительно происходит продуцирование кристаллического белка.

Отделенные твердые представляют собой главным образом кристаллический белок CryIIIC и споры B.t., а также некоторое количество дебриса, некоторое количество интактных клеток и остатки твердых продуктов среды брожения. При необходимости кристаллический белок можно отделить от других выделенных твердых, что осуществляют традиционными методами, например фракционированием с градиентом плотности сахарозы. Белок CryIIIC высокой чистоты можно получить растворением выделенного кристаллического белка и осаждением потом из раствора.

Белок CryIIIC, как отмечалось ранее, является мощным инсектицидным соединением против жесткокрылых насекомых, таких как колорадский картофельный жук, завезенный жук-листоед ивовый и т.п. Белок CryIIIC в противоположность белкам CryIIIA и CryIIIB проявляет измеримую инсектицидную активность против насекомых Diabrotica, например жука-блошки длинноусого, на которые относительно слабо действуют другие кристаллические белки B.t., токсичные для жесткокрылых. Белок CryIIIC можно использовать как активный ингредиент инсектицидных композиций, используемых для контроля жесткокрылых насекомых, таких как были упомянуты выше. Такие инсектицидные композиции или формулы содержат, как правило, приемлемые в сельскохозяйственном отношении носители или аджуванты в дополнение к активному ингредиенту.

Белок CryIIIC можно использовать в инсектицидных формулах в выделенной или очищенной форме, например в виде собственно кристаллического белка. Напротив, белок CryIIIC может присутствовать в выделенных твердых продуктах брожения, полученных из культуры штамма Bacillus, например Bacillus thuringiensis, или другого микроорганизма-хозяина, несущего ген cryIIIC и способного продуцировать белок CryIIIC. Предпочтительные микроорганизмы-хозяева Bacillus включают штамм B.t. EG4961 и генетически усовершенствованные штаммы B. t. , производные от штамма B.t. EG4961. Последние штаммы B. t. можно получить через плазмидную обработку и/или методом сопряжения, и они содержат плазмиду, содержащую нативный ген cryIIIC из штамма B.t. EG4961. Полученный генной инженерией или трансформированный штамм B.t. или другой микроорганизм-хозяин, содержащий рекомбинантную плазмиду, которая экспрессирует клонированный ген cryIIIC, полученный методами технологии рекомбинантной ДНК, также можно использовать.

Примеры таких трансформантов включают штаммы B.t. EG7231 и EG7220, которые содержат клонированный ген cryIIIC на рекомбинантной плазмиде.

Выделенные твердые продукты ферментации содержат главным образом кристаллический белок и (если используют спорообразующий штамм B.t.) споры, могут также присутствовать клеточный дебрис и остатки твердых продуктов среды брожения. Выделенные твердые брожения, содержащие белок CryIIIC, можно высушить при необходимости перед введением в инсектицидную композицию.

Формулы или композиции по данному изобретению, содержащие в качестве активного компонента инсектицидный белок CryIIIC, используют в количествах, обеспечивающих инсектицидный эффект, которые могут меняться в зависимости от таких факторов, как конкретные контролируемые жесткокрылые насекомые, конкретное обрабатываемое растение или культура и способ нанесения инсектицидной композиции. Количество инсектицидной композиции по данному изобретению, обеспечивающее инсектицидный эффект, применяют по способу контроля насекомых по данному изобретению.

Инсектицидные композиции готовят, соединяя компонент, обладающий инсектицидной активностью, с желаемым, приемлемым в сельскохозяйственном отношении носителем. Композиции могут представлять собой дусты или гранулированный материал, или суспензию в масле (растительном или минеральном), или водные либо масляно-водные эмульсии, или смачиваемые порошки, или в сочетании с любым другим материалом носителя, пригодным для использования в сельском хозяйстве. Подходящие сельскохозяйственные носители могут быть твердыми или жидкими, и они хорошо известны. Термин "приемлемый в сельскохозяйственном отношении носитель" охватывает все аджуванты, например инертные компоненты, дисперсанты, поверхностно-активные вещества, связующие, добавки, придающие липкость, и т.д., которые обычно используют в инсектицидных композициях, они хорошо известны специалистам по инсектицидным композициям.

Формулы, содержащие белок CryIIIC и один или более твердых или жидких аджувантов, готовят известными способами, например смешением, гомогенизацией и/или измельчением компонента, обладающего инсектицидной активностью, - CryIIIC с подходящими аджувантами.

Белок CryIIIC и другие белки-токсины жесткокрылых, такие как CryIIIB и CryIIIA, можно также использовать в сочетании с белком CryI, что обеспечивает неожиданно повышенную инсектицидную активность против целевых жесткокрылых насекомых. Специфическая активность белков CryIIIC, CryIIIB и CryIIIA по отношению к жесткокрылым насекомым сильно возрастает при введении или добавлении белка CryI в инсектицидную композицию, содержащую белок CryIII. Этот метод можно использовать для получения синергетической инсектицидной композиции CryIII-CryI путем физического объединения соответствующих белков CryIII и CryI или через объединение штаммов B.t., продуцирующих соответствующие белки. Предпочтительным белком CryI для использования в инсектицидной синергической CryIII-композиции является CryIA и, в частности, CryIA(c), хотя и полагают, что в синергетических композициях можно использовать другие белки CryI. Удивительно, но не наблюдается увеличения инсектицидной активности белка CryI по отношению к чешуекрылым насекомым, т.е. по-видимому отсутствует "обратный синергизм" для белков CryI в присутствии кристаллических белков CryIII.

При необходимости комбинации белков CryIIIC (или CryIIIB) и CryI по данному изобретению можно получить in sity из культур штаммов B.t. или другого микроорганизма-хозяина, несущего такие гены cryIII и гены cryI, способные продуцировать соответствующие белки CryIII и CryI. Такие штаммы или хозяева можно получить методом обработки плазмид и/или сопряжения с участием B.t. или других штаммов или микроорганизма-хозяина, содержащих рекомбинантную плазмиду, которая экспрессирует клонированные гены cryIII и cryI.

Присутствие в композиции белка CryI в количестве, приблизительно эквивалентном количеству белка CryIII, обеспечивает хорошее повышение специфической инсектицидной активности по отношению к жесткокрылым. Меньшее чем это, равное 1: 1, соотношение CryI:CryIII, вероятно, все еще будет обеспечивать удовлетворительный уровень повышения активности белка CryIII.

Инсектицидные композиции по данному изобретению наносят на среду, окружающую жесткокрылое насекомое, как правило, на листву растения или культуры, которые требуется защищать традиционными методами, предпочтительно распылением. Допустимы также другие методы нанесения, например опыление, опрыскивание, пропитывание, инъекции в почву, покрытие семян, покрытие или обрызгивание саженцев и т.п., и они могут потребоваться для насекомых, вызывающих заражение корней или стеблей. Такие методики нанесения хорошо известны.

Ген сryIIIC или его функциональный эквивалент, далее иногда называемый "геном токсина", можно ввести в разнообразные микроорганизмы. Экспрессия гена cryIIIC приводит к продуцированию инсектицидного токсина - кристаллического белка CryIIIC. Подходящие микроорганизмы включают B.t. и другие виды Bacillus, такие как B. subtilis или B. megaterium. Например, в качестве хозяина для гена cryIIIC можно использовать микроорганизмы, колонизирующие на корнях или на растениях. Существуют различные методики, хорошо известные специалистам, для введения гена cryIIIC в микроорганизм-хозяин в условиях, позволяющих стабильное существование и экспрессию гена в полученном трансформанте.

Трансформанты, т.е. микроорганизм-хозяин, содержащие клонированный ген в рекомбинантной плазмиде, можно выделить в соответствии с традиционными методами, обеспечивающими рост только тех микроорганизмов, в которых содержится рекомбинантная плазмида. Затем трансформанты можно проверить на инсектицидную активность. Эти методы также представляют собой известные стандартные процедуры.

Характеристики, особенно важные при выборе клетки-хозяина для целей продуцирования, включают легкость введения гена в клетку-хозяин, доступность систем экспрессии, эффективность экспрессии, стабильность инсектицидного белка CryIIIC с хозяине и присутствие дополнительных генетических возможностей. Клетка-хозяин, содержащий инсектицидный ген cryIIIC, может расти на любой традиционной питательной среде, где получают экспрессию гена cryIIIC и продуцирование белка CryIIIC, как правило, до спорообразования. Споры с клетками, содержащими кристаллический белок, можно собрать в соответствии с традиционными методами, например центрифугированием или фильтрацией.

Ген cryIIIC можно также внедрить в растение, которое способно к экспрессии гена и продуцированию белка CryIIIC, что делает растение более устойчивым к атакам насекомых. Генную инженерию растений с геном cryIIIC можно осуществлять введением желаемой ДНК, содержащей ген, в ткани или клетки растения, использовав молекулы ДНК различных видов и происхождения, которые хорошо известны по генной инженерии растений. Пример методики введения ДНК в ткань растения описан в заявке на Европатент N 0289479, опубликованный 2 ноября 1988 Monsanto Company.

ДНК, содержащую ген cryIIIC или модифицированный ген cryIIIC, способный продуцировать белок CryIIIC, можно ввести в ткани или клетки растения непосредственно с зараженными плазмидами, такими как Ti, плазмида из Agrobacterium tumefaciens, вирусами или микроорганизмами, такими как A. tumefaciens, с помощью лизосом или липосом, путем микроинъекций механическими методами и другими способами, знакомыми по инженерии растений.

В нуклеотидной последовательности оснований гена cryIIIC можно делать вариации, поскольку различные аминокислоты, формирующие кодируемый геном белок, могут определяться более чем одним кодоном, и это также хорошо известно в данной области. Кроме того, могут быть вариации или усечения в кодирующей области нуклеотидной последовательности оснований cryIIIC, позволяющие экспрессию гена и продуцирование функционально эквивалентных форм инсектицидного белка CryIIIC. Эти вариации, которые средние специалисты могут определить без излишних экспериментов по данному описанию, следует рассматривать как входящие в объем данного изобретения, поскольку они полностью эквивалентны заявляемому объекту.

Далее данное изобретение будет рассмотрено более детально со ссылкой на конкретные нелимитирующие примеры. Эти примеры относятся к работе, которая была действительно сделана с помощью известных методов и на производимом в промышленности оборудовании.

Новый штамм B.t. EG4961 выделили по методике, описанной в примере 1.

Пример 1. Выделение штамма B.t.EG4961.

Пробы зерновой пыли получили из различных источников в США и зарубежом, как правило, из зернохранилищ. Пробы зерновой пыли обработали путем приготовления суспензии пыли в водном буфере и нагревания суспензии при 60^oC в течение 30 мин для обогащения теплостойкими спорообразующими бактериями типа Bacillus, такими как B.t. Обработанные суспензии пыли разбавили водным буфером и распределили разбавления на агаровых пластинах, так чтобы на поверхности агаровой пластины каждая индивидуальная бактерия из зерновой пыли выросла в колонию. Затем часть каждой колонии перенесли с агаровой пластины на нитроцеллюлозный фильтр. Фильтр обработали NaOH, чтобы вызвать лизис колоний и фиксировать ДНК из каждой колонии на фильтре.

Несколько измененную методику обработки разработали для колоний B.t., используемых в процессе гибридизации колоний, т.к. было обнаружено, что стандартные методики, применяемые для E. coli, не годятся для B.t. При проведении вышеописанной обработки требуются особые условия, чтобы колонии B.t. находились в стадии вегетативного роста, что делает их восприимчивыми к лизису под действием NaOH. Соответственно после того, как часть каждой колонии перенесли на нитроцеллюлозный фильтр, фильтр поместили вверх той стороной, на которой имеется колония, на агаровую среду, содержащую 0,5% (вес./об.) глюкозы. Перенесенные колонии затем выращивали на агар-глюкозной среде в течение 5 ч при 30^oC. Введение 5% глюкозы в агаровую среду и цикл выращивания 5 ч, 30^oC оказались критичными для обеспечения вегетативного состояния колоний B.t. и тем самым их восприимчивости к лизису.

Несмотря на мнение, выражаемое одним по крайней мере исследователем, что попытки использования существующего гена токсина жесткокрылых в качестве зонда для выявления нового гена, токсичного по отношению к southern corn rootworm, будут безуспешными, клонированный ген токсина жесткокрылых использовали в качестве специфичного зонда для обнаружения в пробах зерновой пыли других новых и редких штаммов B.t.

Фрагмент рестрикции ДНК по HindIII размером 2,9 кb, содержащий ген cryIIIA, ранее известный как ген cryC штамма B.t. EG2158 и описанный у Donovan et al. , Mol.Gen. Genet. 214, pp. 365 - 372 (1988), использовали как зонд в процессе гибридизации колоний.

Фрагмент ДНК HindIII cryIIIA размером 2,9 кb, содержащий полный ген cryIIIA, пометили альфа-P³²dATP и ферментом Кленова по стандартной методике. Нитроцеллюлозные фильтры, содержащие ДНК из каждой изолированной колонии, термостатировали при 65^oC в течение 16 ч в забуференном растворе, содержащем радиоактивно меченный зонд 2,9 кb HindIII cryIIIA, для гибридизации ДНК из колоний, содержащих ДНК из меченного зонда cryIIIA. Гибридизацию проводили при температуре 65^oC, чтобы быть уверенными, что ДНК-зонд cryIIIA будет гибридизован только с ДНК из колоний, содержащих ген, аналогичный ДНК-зонду cryIIIA.

Зонд ctyIIIA 2,9 кb гибридизовался со многими колониями B.t. из различных проб зерновой пыли. Исследование этих колоний выявило, что они не содержали никаких генов типа cryIII. В этих колониях содержались гены типа cryI. Гены типа cryI кодируют кристаллические белки, токсичные для жесткокрылых или чешуекрылых, молекулярная масса которых составляет около 130 кДа. Компьютерное сравнение последовательности гена cryIIIA с последовательностью нескольких генов тип