Способ получения аминокислотных или нуклеиновокислотных последовательностей на субстрате, способ скрининга большого количества аминокислотных последовательностей, субстрат для скрининга

Способ получения аминокислотных или нуклеиновокислотных последовательностей на субстрате, способ скрининга большого количества аминокислотных последовательностей, субстрат для скрининга

Реферат

 

Использование: в биохимии при изучении биологических систем для выяснения взаимосвязи между строением молекул и их активностью. Сущность изобретения: способ получения аминокислотных или нуклеиновокислотных последовательностей на субстрате путем воздействия на первую область субстрата (выбран из группы, состоящей из полимеризованной пленки Лэнгмюра-Блоджетта, стекла с функциональными группами, германия, кремния, полимеров политетрафторэтилена, полистирола, арсенида, галлия и комбинаций перечисленных материалов) активатором для удаления защитных групп, воздействия на первую область первым аминокислотным или нуклеотидным мономером, воздействия на вторую область активатором для удаления защитных групп; контактирование второй области с вторым аминокислотным или нуклеотидным мономером; способ скрининга большого количества аминокислотных последовательностей на связывание их с рецептором, субстрат для скрининга на биологическую активность, содержащий в предопределенных областях 10³ или более различных пептидных или нуклеиновокислотных лигандов. 6 с.п. и 26 з.п. ф-лы, 17 ил., 3 табл.

Изобретение относится к синтезу и размещению материалов в определенном месте. В частности, одним из аспектов изобретения являются способ получения различных химических последовательностей в определенных местах на поверхности одного субстрата и устройство для его осуществления. Эти способ и устройство могут использоваться, например, для получения олигомеров, пептидов, нуклеиновых кислот, олигосахаридов, фосфолипидов, полимеров или обладающих лекарственными свойствами препаратов, в частности, для возможности получения большого количества различных химических соединений для использования их при скрининге на биологическую активность.

Выяснение взаимосвязи между строением молекул и их активностью является главной задачей при изучении биологических систем. Знание такой зависимости имеет важное значение, например, для понимания механизма функционирования ферментов, путей взаимодействия клеток друг с другом, а также для клеточного контроля и действия систем обратной связи.

Известно, что некоторые молекулы взаимодействуют и связываются с другими молекулами, имеющими весьма специфическое трехмерное пространственное и электронное распределение. Любую большую молекулу, обладающую такой специфичностью, можно рассматривать как рецептор независимо от того, является ли она ферментом, катализирующим гидролиз метаболического промежуточного соединения, белком поверхности клетки, служащим промежуточным звеном при мембранном транспорте ионов, гликопротеином, служащим для идентификации конкретной клетки по отношению к ее соседним клеткам, антителом ИгГ-класса, циркулирующим в плазме, олигонуклеотидной последовательностью ДНК в ядре и т.п. Различные молекулы, селективно связывающие рецепторы, известны под названием лиганды.

Существуют многочисленные методы анализа для определения степени сродства известных рецепторов и лигандов, однако информация, которая может быть получена из такого рода экспериментов, часто ограничивается числом и типом известных лигандов. Новые лиганды открываются иногда случайно или благодаря использованию новых методов для изучения строения молекул, включая рентгеновский кристаллографический анализ и рекомбинантные генетические методы исследования белков.

Пептиды небольших размеров являются типичной системой для выяснения взаимосвязи между их строением и биологической активностью. Пептиды представляют собой последовательности аминокислот. При конденсации двадцати природных аминокислот в полимерные молекулы возникает огромное количество трехмерных конфигураций, структура которых зависит от конкретной последовательности аминокислот и природы растворителя. Так, например, из 20 природных аминокислот в принципе может быть получено 20⁵ или 3,2 миллиона различных пентапептидов. Вероятность того, что молекулы такого размера могут оказаться полезными при изучении образования рецепторных связей, подтверждается данными эпитопного анализа, из которых следует, что некоторые антитела распознают с высокой специфичностью последовательности, состоящие из нескольких аминокислот. Кроме того, средний молекулярный вес аминокислот ставит пептиды с небольшими размерами молекул в один ряд со многими использующимися в настоящее время фармацевтическими препаратами.

Одной из задач поиска, основанного на таком изучении взаимосвязи между строением молекул и их активностью, является обнаружение соединений, обладающих лекарственными свойствами. В большинстве случаев современный поиск лекарственных препаратов можно рассматривать как поиск новых лигандов с нужным характером специфичности к биологически важным рецепторам.

Другим примером является поиск новых соединений для использования в сельском хозяйстве, например, в качестве пестицидов и гербицидов.

Иногда попытки создания рациональных подходов к конструированию лигандов оказываются трудными или непродуктивными. Известные способы получения большого количества различных полимеров при попытке использования их в масштабах, достаточных для эффективного рационального или случайного скрининга, оказались весьма непродуктивными. Так, например, метод Merrifield (J. Am. chem. Soc. , 1963, 85, 2149-2154), на который мы все время ссылаемся в настоящей заявке использовался для синтеза пептидов на твердой подложке. По этому способу аминокислота ковалентно связывается с подложкой из нерастворимого полимера. Другая аминокислота с защищенной альфа-группой подвергается взаимодействию с вышеуказанной ковалентно-связанной кислотой с образованием в результате дипептида. После промывки защитную группу удаляют и добавляют к дипептиду третью кислоту с защищенной альфа-группой. Этот процесс продолжают до получения пептида нужной длины и с нужной последовательностью. Использование метода Merrifield экономически неоправданно для синтеза более, чем нескольких пептидных последовательностей в день.

Для синтеза большого количества полимерных последовательностей было предложено также использовать несколько реакторов для синтеза полимеров. Так, например, для синтеза линейного полимера на твердофазной подложке можно использовать трубчатый реактор с автоматическим последовательным добавлением реагентов. Этот способ, однако, не позволяет синтезировать достаточно большое количество полимерных последовательностей для эффективного и экономически оправданного скрининга.

Известны также способы получения большого количества полимерных последовательностей, по которым в перфорированную емкость помещают заданное количество реакционноспособных частиц, размер которых больше размера отверстий. Такие емкости могут быть подвергнуты селективному взаимодействию с нужными материалами для получения целевых молекул с нужными последовательностями. Как и в случае других известных способов, этот способ нельзя, в частности, использовать для синтеза достаточно большого количества различных полипептидов для эффективного скрининга.

В литературе описаны также другие способы и среди них синтез пептидов на 96 пластиковых штифтах, соответствующих формату стандартного титрационного микропланшета. К сожалению, несмотря на определенный прогресс этих способов, они не позволяют решить главных проблем. Так, например, с их помощью нельзя экономично синтезировать и исследовать большое количество различных последовательностей.

Из всего вышесказанного следует, что существует необходимость в разработке усовершенствованного способа и устройства для синтеза большого количества различных химических последовательностей в определенном месте.

Описаны усовершенствованные способ и устройство для получения различных полимеров.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения на субстрате иммобилизируются сшивающие молекулы, концевые реакционноспособные функциональные группы которых защищены фотоотщепляемыми защитными группами. С помощью литографических способов фотоотщепляемая защитная группа подвергается воздействию света и удаляется из сшивающих молекул в первых выбранных областях. Субстрат затем промывают или другим образом подвергают контактированию с первым мономером, который реагирует со свободными функциональными группами сшивающих молекул. По предпочтительному варианту осуществления изобретения указанным мономером является аминокислота, имеющая фотоотщепляемую защитную группу у аминного или карбоксильного конца, и сшивающая молекула связывается с аминной или карбоксильной группой, защищенной фотоотщепляемой защитной группой.

После этого воздействию света подвергаются вторые выбранные области, в результате чего в этих областях удаляется фотоотщепляемая защитная группа из комплекса сшивающая молекула - защищенная аминокислота. Субстрат затем подвергают контактированию с вторым мономером, имеющим фотоотщепляемую защитную группу, в результате чего происходит взаимодействие его со свободными функциональными группами. Этот процесс повторяют, используя соответствующим образом подобранные мономеры, до тех пор, пока не получают полимеры нужной длины с нужной химической последовательностью. Фотолабильные группы затем при желании удаляют и последовательность при желании обрывают. Защитные группы боковой цепи при наличии их в молекуле также удаляют.

Благодаря использованию литографической техники, описанной в настоящей заявке, становится возможным направлять свет на относительно небольшие и точно определенные участки субстрата. В результате обеспечивается возможность синтезировать определенные химические последовательности с определенным местоположением на субстрате.

Полученный в результате субстрат может использоваться для различных целей, в том числе, например, для скрининга большого количества полимеров, направленного на определение их биологической активности. Для определения биологической активности субстрат подвергают выдержке с одним или несколькими рецепторами, такими как полные клеточные антитела, рецепторы на пузырьках, липиды, или любыми другими рецепторами. Выбранные рецепторы предпочтительно метят, например, флуоресцентной или радиоактивной меткой, или меченным антителом, способным взаимодействовать с рецептором. Положение метки на субстрате определяют с помощью, например, фотонного детектора или авторадиографии. Зная последовательность материала в месте ее связи, определенном путем детектирования, можно быстро определить, какая последовательность связана с рецептором. Поэтому такой способ может использоваться для скрининга большого количества пептидов. Другие возможные области применения настоящего изобретения включают диагностические определения, при которых различные антитела против конкретных рецепторов размещают на субстрате, например, скрининг сыворотки крови на иммунодефицит. Другими областями применения являются, например, селективное "легирование" органических материалов в полупроводниковых устройствах и т.п.

Одним из предметов настоящего изобретения является усовершенствованная реакторная система для синтеза полимеров. Такая реакторная система включает держатель субстрата, расположенный вокруг него таким образом, что между субстратом и держателем образуется реакционное пространство, через которое или в которое подаются насосом или протекают жидкие реагенты. На субстрате размещается или фокусируется маска и освещается таким образом, чтобы удалить защитные группы в определенных областях субстрата в реакционном пространстве. Мономер прокачивают через реакционное пространство или другим образом подвергают контактированию с субстратом, в результате чего происходит взаимодействие его с областями с удаленными защитными группами. Путем создания на субстрате областей с селективно удаленными защитными группами и пропускания через реакционное пространство определенных мономеров можно синтезировать нужные полимеры с известным расположением.

Предметом изобретения являются также усовершенствованные способы детектирования и устройство для их осуществления. В предлагаемых способе и устройстве для детектирования используется субстрат с большим количеством полимерных последовательностей, расположенных в определенных точках его поверхности. Такой субстрат подвергается взаимодействию с имеющим флуоресцентную метку рецептором, который связывается с одной или несколькими полимерными последовательностями. Субстрат затем помещают в детекторный микроскоп для идентификации локаций, в которых произошло связывание. Микроскопное детектирующее устройство включает монохроматический или полихроматический источник света для облучения субстрата, средства для детектирования флуоресцентного излучения субстрата и средства для определения места, из которого исходит флуоресцирующее излучение. В некоторых вариантах осуществления средства для детектирования флуоресцентного излучения могут включать счетчик фотонов. Средства для определения места, из которого исходит флуоресцентное излучение, могут включать координатный стол для субстрата. Передвижение каретки и сбор данных осуществляются с помощью цифрового компьютера по специальной программе.

Более подробно суть настоящего изобретения и его преимущества излагаются в других частях описания и на прилагаемых чертежах.

На фиг. 1 изображены маскирование и облучение субстрата в первой области, поперечный разрез субстрата; на фиг. 2 - субстрат после взаимодействия с мономером "A"; на фиг. 3 - облучение субстрата во второй области; на фиг. 4 - субстрат после взаимодействия с мономером "B"; на фиг. 5 - облучение мономера "A"; на фиг. 6 - субстрат после второго взаимодействия с "B"; на фиг. 7 - субстрат после окончания обработки; на фиг. 8 и 9 - два варианта реакторной системы для формирования на субстрате большого количества полимеров; на фиг. 10 - детекторное устройство для определения местоположения флуоресцентных меток на субстрате; на фиг. 11 - иллюстрация способа получения тримеров мономеров "A" и "B"; на фиг. 12 и 13 - флуоресцентные следы для стандартных флуоресцентных бусин; на фиг. 14 - флуоресцентные кривые для NVOC соответственно без облучения светом и после облучения; на фиг. 15 и 16 - формирование предметного стекла с контрольной структурой YGGFL и GGFL, подвергнутого взаимодействию с антителом Герца; на фиг. 17 - картирование шестнадцати последовательностей, синтезированных на двух разных стеклянных предметных стеклах.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления.

Содержание 1. Словарь.

2. Общие положения.

3. Синтез полимеров.

4. Подробное описание одного из вариантов осуществления реакторной системы.

5. Подробное описание одного из вариантов осуществления флуоресцентного детекторного устройства.

6. Определение прочности связывания рецепторов.

7. Примеры.

A. Подготовка предметных стекол.

B. Синтез восьми тримеров "A" и "B".

C. Синтез димера аминопропиловой и флуоресцентной групп.

D. Определение величины сигнала.

E. Определение числа молекул на единицу поверхности.

F. Удаление NVOC и введение флуоресцентной метки.

C. Использование маски при удалении NVOC.

H. Введение YGGFL и последующее взаимодействие с антителом Герца и козьим антимышиным антителом.

I. Мономер-мономерное формирование YGGFL и последующее взаимодействие его с меченым антителом.

J. Мономер-мономерный синтез PGGFL и YGGFL.

K. Мономер-мономерный синтез YGGFL и YPGGFL.

L. Синтез шестнадцати различных аминокислотных последовательностей и определение их сродства с антителом Герца.

8. Другой вариант осуществления изобретения.

9. Выводы.

Словарь Нижеперечисленные термины, использующиеся в настоящем описании, имеют следующие значения: 1. Комплементарный - употребляется для обозначения топологической совместимости или совместимости взаимодействующих поверхностей молекулы лиганда и ее рецептора, т. е. рецептор и его лиганд могут быть названы комплементарными, кроме того, комплементарными являются характеристики контактирующих поверхностей.

2. Эпитоп - часть молекулы антигена, трансдифференцированная областью взаимодействия с подклассом рецепторов, известных под названием антитела.

3. Лиганд - лигандом называется молекула, узнаваемая определенным рецептором, примерами лигандов, которые могут быть исследованы с помощью заявляемого изобретения, являются (этими примерами число таких лигандов однако не ограничивается) агонисты и антагонисты клеточных мембранных рецепторов, токсины и яды, вирусные эпитопы, гормоны (например, наркотики, стероиды и т. д. ), гормонные рецепторы, пептиды, ферменты, субстраты ферменты, лекарства, лектины, сахара, одигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, одигосахариды, белки и моноклональные антитела.

4. Мономер - элемент набора небольших молекул, которые могут соединяться друг с другом, образуя полимер, такой набор мономеров включает, не ограничиваясь, однако, приведенными примерами, в частности, набор природных L - аминокислот, набор D - аминокислот, набор синтетических аминокислот, набор нуклеотидов и набор пентоз и гексоз, в используемом в настоящем описании значения под мономерами имеется в виду любой член базисного набора для синтеза полимера, например, димеры L-аминокислот образуют базисный набор 400 мономеров для синтеза полипетидов, на отдельных стадиях синтеза полимера могут использоваться различные наборы мономеров.

5. Пептиды - полипер, образованный альфа-аминокислотами в качестве мономеров, связанными между собой амидными связями, другое название - полипептиды, в тексте настоящей заявки, когда речь идет об аминокислотах, имеются в виду как L - оптические, так и D - оптические изомеры, молекулы пептидов состоят из более, чем двух, а часто из более, чем двадцати аминокислот, для обозначения аминокислот используются стандартные аббревиатуры (например, P обозначает пролин), эти аббревиатуры приведены в руководстве Stryer, Biochemistry 3-е изд., 1988, которое включено в перечень ссылок.

6. Излучение - энергия, которая может селективно излучаться, включает энергию с длиной волны 10^-14 - 10⁴ м, это может быть, например, излучение электронного пучка, гамма-излучение, рентгеновское излучение, ультрафиолетовое излучение, излучение энергии видимого света, инфракрасное излучение, микроволновое излучение и радиоволновое излучение, под "облучением" имеется в виду обработка поверхности излучением.

7. Рецептор - молекула, имеющая сродство к определенному лиганду, рецепторы могут быть природными и искусственными, они могут использоваться как сами по себе, так и в виде агрегатов с другими частицами, рецепторы могут быть связаны с помощью ковалентных или нековалентных связей со связующим элементом или непосредственно, или через специфическое связующее вещество, примеры рецепторов, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, включают (этими примерами однако не ограничивается число возможных для использования рецепторов) антитела, клеточные мембранные рецепторы, моноклональные антитела и антисыворотки, связанные со специфическими антигенными детерминантами (например, на вирусах, клетках или других материалах), лекарства, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, пептиды, кофакторы, лектины, сахара, полисахариды, клетки, клеточные мембраны и органеллы, иногда рецепторы называют в литературе антилигандами, в настоящей заявке между обоими терминами не делаются различия, "пара лиганды - рецептор" образуется при объединении двух макромолекул в результате молекулярного узнавания и представляет собой комплекс, другими примерами рецепторов, которые могут быть исследованы с помощью настоящего изобретения (этими примерами число таких рецепторов, однако, не ограничивается), являются: а) рецепторы микроорганизмов: обнаружение лигандов, которые могут связываться с рецепторами, например, специфический транспорт белков или ферментов, имеющий важное значение для выживания микроорганизмов, представляет интерес для получения нового класса антибиотиков. В частности, интерес представляет антибиотики против opportunistic fungi, protozoa и бактерий, стойких к существующим антибиотикам, b) ферменты: например, место связывания ферментов, таких как ферментов, ответственных за расщепление нейтротрансмиттеров, обнаружение лигандов, связывающихся с определенными рецепторами с целью модулирования действия ферментов, расщепляющих различные нейротрансмиттеры, представляет интерес для получения лекарств для лечения нарушений нейротрансмиссии, c) антитела: настоящее изобретение может, например, представлять интерес для определения места связывания лиганда в молекуле антитела, связанный с эпитопом исследуемого антигена, определение последовательности, имитирующей антигенный эпитоп, может привести к разработке вакцин, основой иммуногена которых является одна или несколько таких последовательностей, диагностические агенты или соединения, которые могут оказаться пригодными для лечения, например, аутоиммунных заболеваний (например, за счет блокирования аутоантител), d) нуклеиновые кислоты: для получения последовательностей, связывающих ДНК или РНК, могут быть синтезированы последовательности нуклеиновых кислот, e) каталитические полипептиды: полимеры, предпочтительно полипептиды, способствующие протеканию химических реакций, включая конверсию одного или нескольких реагентов с образованием одного или нескольких продуктов. В таких полипептидах обычно имеется рецепторная зона, специфичная по меньшей мере к одному реагенту или реакционноспособному промежуточному соединению, и реакционноспособная функциональная группа, расположенная рядом с этой рецепторной зоной, которая может химически модифицировать связанный реагент. Каталитические пептиды описаны, например, в заявке США N 404920, включенной в перечень ссылок к настоящей заявке.

f) рецепторы гормонов: например, рецепторы инсулина и гормонов роста. Обнаружение лигандов, прочно связывающихся с такими рецепторами, может представлять интерес, например, для получения оральных препаратов взамен ежедневных инъекций, которые необходимо делать больным диабетом для снятия симптомов болезни, а также для замены редкого человеческого гормона роста, который может быть получен только из трупов или с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Другим примером являются рецепторы сосудосуживающих гормонов. Обнаружение лигандов, которые связываются с такими гормонами, может позволить создавать лекарства, контролирующие давление крови, g) рецепторы наркотиков: обнаружение лигандов, которые связываются с рецепторами наркотиков в мозгу, может помочь создавать заменители морфина и других аналогичных лекарств, обладающие менее сильным наркотическим действием.

8. Субстрат - материал с жесткой или полужесткой поверхностью. В большинстве случаев по меньшей мере одна поверхность субстрата является практически плоской, хотя в отдельных случаях может оказаться необходимым физически разделить области синтезов различных полимеров с помощью, например, лунок, выступающих областей, канавок травления и т.п. По другому варианту на поверхности могут быть сформированы маленькие бисеринки, облегающие процесс синтеза.

9. Защитная группа - материал, связанный с мономерным звеном, который может быть пространственно удален путем селективного воздействия активатора, например, электромагнитного излучения. Примерами защитных групп, которые могут использоваться при осуществлении настоящего изобретения, являются нитровератрилоксикарбонил, нитробензилоксикарбонил, диметилдиметоксибензилоксикарбонил, 5-бром-7- нитроиндолинил, o-окси, - метилциннамоил и 2-оксиметиленантрахинон. Другими примерами активаторов являются ионные пучки, магнитные поля, пучки электронов, рентгеновское излучение и т.п.

10. Предетерминированная область - предетерминированной областью называется локализованная поверхность, активирующаяся, проактивированная или предназначенная для активации для образования полимера. Предетерминированная область может иметь любую форму. Она может быть, например, круглой, прямоугольной, эллиптической, клиновидной и т.д. Для кратности в дальнейшем предетерминированные области иногда будут называться просто "областями".

11. Практически чистый - полимер, считается практически чистым в пределах предетерминированной области субстрата, если он имеет характеристики, отличающие его от других предетрминированных областей. Обычно чистоты характеризуют биологической активностью ил функцией однородности последовательности. Как правило, эти характеристики определяют, изучая связанные с определенным лигандом или рецептором.

2. Общие положения Предметами настоящего изобретения являются способ и устройство для получения и использования субстрата с большим количеством полимерных последовательностей, расположенных в определенных, заранее заданных областях. Изобретение описано, в первую очередь, на примере получения молекул, содержащих последовательности аминокислот, однако его можно легко использовать для получения и других полимеров. Такими полимерами могут быть, например, линейные и циклические полимеры нуклеиновых кислот, полисахариды, фосфолипиды и пептиды, содержащие , - или -аминокислоты, гетерополимеры, в которых известное лекарство ковалентно связано с любым из вышеперечисленных полимеров, полиуретаны, полиэфиры, поликарбонаты, полимочевины, поиламиды, полиэтиленимины, полиариленсульфиды, полисилоксаны, полиимиды, полиацетаты или другие полимеры, упоминающиеся в настоящем описании. По предпочтительному варианту настоящее изобретение используется для синтеза пептидов.

Полученный предлагаемым способом субстрат может использоваться, например, для скрининга большого количества различных полимеров на предмет использования их в качестве лигандов для связывания с рецептором, хотя, разумеется, изобретение может использоваться и для синтеза рецепторов для связывания с лигандом. Являющийся предметом настоящего изобретения субстрат может использоваться и для других различных целей, к примеру, для определения пептидов и последовательностей нуклеиновых кислот, связанных с белками, для обнаружения последовательностей, специфически связывающихся с лекарствами, идентификации эпитопов, распознаваемых антителами, для разработки лекарств для клинических и диагностических целей, а также для решения комбинаций вышеперечисленных задач.

По предпочтительному варианту предметом настоящего изобретения является использование субстрата S с поверхностью. На поверхности такого субстрата при необходимости могут быть сформированы мостиковые молекулы L, которые в некоторых случаях служат для облегчения распознавания рецептором синтезированных полимеров.

При желании мостиковые молекулы могут быть химически защищены. Назначением такой защиты является возможность хранения. В некоторых случаях в качестве такой защитной группы, защищающей молекулу от химических изменений, можно использовать, например, t-BOC (третбутоксикарбонил). Такие химические защитные группы могут быть химически удалены путем взаимодействия защищенной молекулы, например, - с кислым раствором. Они служат для защиты поверхности в процессе хранения.

На субстрате или периферийном конце мостиковой молекулы формируется функциональная группа с защитной группой P_o. Защитная группа P_o может быть удалена путем воздействия на молекулу излучения, электрических полей, электрического тока или других активаторов.

По предпочтительному варианту осуществления изобретения в качестве источника излучения используют ультрафиолетовый (УФ), инфракрасный (ИК) или видимый свет. Как будет видно из дальнейшего, защитная группа может быть электрохимически чувствительной и может быть удалена под воздействием электрического поля. Для удаления защитных групп можно использовать также ионные и электронные пучки.

В некоторых случаях подвергаемые воздействию области и таким образом площади, занимаемые отдельными синтезированными полимерными последовательностями меньше примерно 1 см² или 1 мм². Предпочтительно подвергаемая воздействию область меньше примерно 100 мкм², а в некоторых случаях центр связывания состоит из одной молекулы. В этих областях каждый полимер синтезирован практически в чистом виде.

Непосредственно в процессе или после облучения определенной области субстрата светом осуществляют контактирование его поверхности с первым мономерным звеном M₁, которое взаимодействует с функциональной группой, которая подвергалась воздействию на стадии защитной группы P₁. P₁ может быть такой же, как и P₀, но может и отличаться от нее.

В результате после первого цикла определенные первые области поверхности могут включать последовательность: S-L-M₁-P₁, а остальные ее области включают последовательность: S-L-P₀.

После этого действию света подвергают вторые области поверхности (они могут включать и первую область) и осуществлять контактирование их с вторым мономером M₂ (это может быть тот же мономер, что и M₁ или другой мономер), имеющим защитные группы P₂. P₂ может быть такой же, как и P₀ или P₁, но может и отличаться от них. После второго цикла области субстрата могут включать одну или более из следующих последовательностей: S-L-M₁-M₂-P₂ S-L-M₂-P₂ S-L-M₁-P₁ и/или S-L-P₀ Описанный процесс повторяют до тех пор, пока на субстрате не будут синтезированы нужные полимеры нужной длины. Контролируя локализации на субстрате, подвергаемые воздействию света, и реагенты, контактируемые с ним после такого воздействия, можно знать локализацию каждой последовательности.

После этого защитные группы удаляют со всего субстрата или его части и последовательности при желании копируют звеном C. В результате получают субстрат с размещенным на его поверхности большим количеством полимеров общей формулы: S-[L]-(M_i-(M_j)-(M_k)...(M_x)-[C], в которой квадратные скобки означают возможные группы, а M_i... M_x-последовательности полимеров. Количество мономеров может варьироваться в широких пределах. По предпочтительному варианту осуществления оно находится в пределах 2-100.

В некоторых случаях в нескольких локализациях субстрата полимеры должны содержать обычную последовательность мономеров. К примеру, хотят синтезировать последовательность S-M₁-M₂-M₃ в первых и последовательность S-M₄-M₂-M₃ во вторых локализациях. Процесс начинают с облучения первых локализаций и контактирования затем субстрата с M₁-P, в результате чего в первой локализации получают последовательность S-M₁-P. После этого облучают вторые локализации и осуществляют контактирование с M₄-P, получая в результате во вторых локализациях последовательность S-M₄-P. После этого первую и вторую локализации подвергают облучению и осуществляют контактирование с димером M₂-M₃ с образованием в результате последовательности S-M₁-M₂-M₃ в первых и S-M₄-M₂-M₃ во вторых локализациях. Для описанного синтеза, естественно, можно использовать обычные последовательности любой длины, в частности, состояние из 2 или более, 2-100, 2-20, наиболее предпочтительно 2-3 мономеров.

По другому варианту осуществления изобретения для получения первого мономерного слоя используют набор масок, после чего проводят селективное удаление защитных групп, облучая субстрат светом различной длины волны. Так, например, для получения субстрата с вышеизложенными последовательностями вначале выделяют первые области с помощью маски и осуществляют взаимодействие их с первым мономером, имеющим первую защитную группу P₁, которая может быть удалена путем облучения светом первой длины волны (например, ИК). После этого выделяют с помощью маски вторые области и осуществляют защитную группу P₂, которая может быть удалена путем облучения светом второй длины волны (например, УФ). Далее необходимость в масках уже отпадает, поскольку для удаления защитных групп весь субстрат может быть попеременно подвергнут воздействию света первой и второй длин волн.

Полученные на субстрате вышеописанными способами полимеры могут использоваться для различных целей, например, при скрининге на биологическую активность. При таком скрининге субстрат с имеющимися на нем последовательностями подвергают взаимодействию с меченным или немеченным рецептором, например антителом, рецептором на клетке, фосфолипидным пузырьком или любым другим рецептором. По предпочтительному варианту полимеры подвергают взаимодействию с первым немеченным излучаемым рецептором, после чего подвергают взаимодействию с меченным, специфично распознающим указанный рецептор элементом, например антителом. При этом на стадии детектирования будет появляться усиленный сигнал.

Молекулы рецептора могут связываться с одним или несколькими полимерами на субстрате. Присутствие меченного рецептора, а следовательно, и присутствие связанной с этим рецептором последовательности по предпочтительному варианту определяют с помощью авторадиографии, детектирования флуоресценции связывающим заряды устройством, флуоресцентной микроскопии и т.п. Последовательность полимера в локализациях, в которых обнаружена рецепторная связь, может использоваться для определения всей или части последовательности, комплементарной к этому рецептору.

Использование заявляемого изобретения иллюстрируется, в первую очередь, примерами скрининга на биологическую активность. Оно однако может найти и другие области применения. Так, например, оно может использоваться для хранения информации (например, на оптических данных), для получения молекулярных электронных устройств, стационарных фаз, в процессах разделения, для получения красителей и осветлителей, в фотографии и для иммобилизации клеток, белков, лектинов, нуклеиновых кислот, полисахаридов и т.п. на поверхности образцов через молекулярное распознавание специфических полимерных последовательностей. Синтезируя в соседних локализациях одно и тоже соединение в различных прогрессивно меняющихся концентрациях, можно определить градиент для контроля хемотаксиса или для получения dipsticks, которые можно использовать, например, для титрования антитела против возрастающего количества антигена. Синтезируя несколько каталитических молекул, близких по строению, можно путем "координатной иммобилизации" добиться более эффективной многостадийной конверсии. Координатную иммобилизацию можно также использовать в системах с переносом электронов и для придания материалам структурной целостности и других нужных свойств, например смачиваемости, способности оказывать смазывающее действие и т.д.

Кроме того, настоящее изобретение позволяет исследовать биораспределение или фармакокинетические свойства. Так, в частности, для определения стойкости к кишечным или сывороточным протеазам полимеры могут быть копированы флуоресцентной меткой и потом подвергнуты взаимодействию с исследуемой биологической жидкостью.

3. Синтез полимеров.

На фиг. 1 изображен поперечный разрез субстрата 2 в соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения. В принципе для осуществления изобретения может использоваться любой субстрат. Он может быть биологическим, небиологическим, органическим, неорганическим или представлять собой комбинацию любых перечисленных субстратов и находиться в форме частиц, нитей, осадков, гелей, листов, трубок, сфер, контейнеров, капилляров, подложек, срезов, пленок, пластин, предметных стекол и т.п. Субстрат может иметь любую форму, например форму диска, квадрата, сферы, круга и т.д. предпочтительно, чтобы субстрат был плоским, однако он может иметь возвышенные или пониженные участки поверхности, на которых про