Способ определения в анализируемой жидкости биологически активного вещества и устройство для его осуществления

Способ определения в анализируемой жидкости биологически активного вещества и устройство для его осуществления

Реферат

 

Изобретение предназначено для определения биологически активных веществ (БАВ), способных взаимодействовать с линейными двухцепочечными молекулами ДНК, регистрацией кругового дихроизма. Способ включает смешение анализируемой жидкости, содержащей БАВ, с нейтральным по отношению к ДНК полимером в условиях, при которых оптические свойства лиотропной жидкокристаллической дисперсии ДНК не нарушаются. Затем непосредственно перед смешением с анализируемой жидкостью формируют лиотропную жидкокристаллическую холестеричную дисперсию ДНК из линейных двухцепочечных молекул ДНК низкой молекулярной массы в водно-солевом растворе упомянутого полимера. Смешивают раствор анализируемой пробы в полимере с раствором ДНК в полимере. Пропускают через полученный раствор циркулярно поляризованное излучение. Регистрируют оптический сигнал на двух длинах волн, одна из которых находится в полосе поглощения ДНК, другая - в области поглощения БАВ. О концентрации БАВ судят по величине отношения полученных сигналов. Устройство для осуществления способа представляет собой дихрограф, в котором селектор, формирующий излучение определенной длины волны, содержит минимальное число оптических элементов для обеспечения максимального светового потока. Селектор содержит электродинамический привод позиционного типа, обеспечивающий возможностью установлениях двух длин волн, на которых проводят измерения. 2 с. и 11 з.п.ф-лы, 18 фиг.

Изобретение относится к медицинской технике и фармацевтической промышленности, а более конкретно к способу определения в анализируемой жидкости биологически активного вещества и устройству для его осуществления.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицинской и клинической биохимии, а также в молекулярной фармакологии при исследовании фармакокинетики биологически активных соединений фармацевтической промышленности и экологии. Наиболее эффективно использование настоящего изобретения в клинической биохимии.

Основная проблема при рациональной фармакокинетике биологически активных веществ (БАВ), в частности синтетических и полусинтетических противоопухолевых соединений, влияющая на возможность эффективной терапии, сводится к быстроте и точности определения концентрации этих соединений в биологических жидкостях (кровь, плазма крови, моча и так далее) после введения пациентам определенного количества противоопухолевого соединения.

Известны две основные группы методов определения наличия и эффективности действия БАВ, основной мишенью которых являются молекулы двухцепочечных нуклеиновых кислот.

Первую группу составляют биологические методы [Современные методы в биохимии. /Под ред. В.Н.Ореховича. М.: Медицина. 1968, с. 372; Методы практической биохимии. /Под ред. Б. Уильямса, К. Уильсона. М.: Мир, 1978, с. 256], заключающиеся в том, что на изученных генетических системах (бактерии, бактериофаги, культуры клеток) проверяют действие веществ, вызывающих хорошо регистрируемые изменения в названных системах. Эти методы осуществляются посредством стандартных микроскопов. Однако на пути проникновения БАВ может происходить модификация их структур, влияющая на точность установления корреляции между структурой вещества, его концентрацией и биологической активностью. Кроме того, указанные методы отличаются длительностью проведения самого эксперимента (от суток до недель).

Вторую группу методов составляют физико-химические методы или различные комбинации таких методов. Начиная с 1980 г., предложено несколько методов определения биологически активных веществ, в частности производных антрахиноновой группы. Среди них различные варианты радиоиммунного анализа [Nicolau G., Szucs-Myers V., McWilliams W., Morrison J., Lanzilotti A. (1985). Investigational New Drugs, 3: pp. 51-55], тонкослойной хроматографии высокого разрешения [Avramis V. (1982), Abstract. Pharmacologist, 24, pp. 241,; Ehninger G., Proksch B., Hartmann F., Gartner H.V., Wilms K., (1984). Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 12, pp. 50-52], метод вытеснения этидиумбромида, связанного с молекулой ДНК [Horvath J., Gueguetchkeri M., Gupta A., Penumatchu D., Weetall H. H., (1995), Biosensor and Chemical Sensor Technology, ed. Rogers K.R. et al., Washington, ASC Symp. Ser. 613. pp. 45-60]. Наибольшее распространение получила колоночная жидкостная хроматография высокого разрешения (HPLC) [Chiccarelli F.S., Morrison J.A., Cosulich D.B., Perkinson N.A., Ridge D.N. (1986), Cancer Research, 46, pp. 4858-4861; Lin K.T. Rivard G.E., Leclerc J.M. (1989). J. Chromatographe, 465, pp. 75-86], осуществляемая при помощи стандартных хроматографов.

Известна модификация метода HPLC для определения одного из важных антрахинонов - митоксантрона (МХ), которая описана сравнительно недавно [Nicoletto M.O., Padrini R., Ferrazi E., Nascimben O., Visona E., Tumolo S., Palumbo M. , Cossta L., Vinante O., Monfardini S., Fiorentino M.V. (1993). Eur. J. Cancer. 29A. pp. 1242-1248]. Согласно этому методу МХ и продукты его метаболизма экстрагируют из крови пациентов, затем их концентрируют и проводят хроматографическое выделение МХ с последующим спектрофотометрическим определением концентрации МХ. Несмотря на точность определения МХ, достигающую несколько десятков нг/мл, указанный метод характеризуется: - длительностью всего процесса определения, достигающей двух суток, что обусловлено необходимостью специальной подготовки образцов (обработка крови пациентов, экстракция и концентрирование МХ и так далее).

- применением дорогостоящего оборудования, а именно хроматографов высокого давления и тому подобных устройств.

- необходимостью использовать высококвалифицированный персонал для проведения всего цикла анализа.

Для лабораторных растворов известен способ определения окрашенных биологически активных веществ, мишенью которых являются молекулы двухцепочечных ДНК, учитывающий взаимодействие БАВ с молекулами ДНК, образующими жидкие кристаллы, иммобилизованными в составе пленочных (гелевых) биодатчиков [1].

Этот способ включает формирование лиотропной жидкокристаллической дисперсии ДНК в водносолевом растворе, содержащем нейтральный полимер, добавление к нему специальных мономеров, способных к полимеризации, и полимеризацию полученной смеси, получение пленки (геля), имеющей форму и размер, удобные для экспериментатора, погружение пленки (геля) в анализируемый лабораторный раствор, содержащий БАВ, и выдерживание пленки в этом растворе в течение промежутка времени, достаточного для диффузии БАВ в пленку и взаимодействия с молекулами ДНК, регистрацию спектра кругового дихроизма (аномальный оптической активности) в области поглощения БАВ, определение наличия БАВ по форме спектра кругового дихроизма.

Однако точное определение концентрации исследуемого БАВ, а следовательно, и практические возможности указанного способа определения БАВ ограничены следующими факторами: - трудностью создания пленок (гелей), отвечающих определенным физикохимическим требованиям (нейтральный по отношению к ДНК характер пленки, ее прозрачность, оптически изотропные свойства и т.д.), - трудностью в поддержании неизменных свойств пленок, даже в течение промежутка времени диффузии БАВ, - значительным промежутком времени, после которого становится возможным регистрация заметной величины оптического сигнала, возникающего в результате диффузии молекул БАВ в полимерную пленку и их последующего взаимодействия с молекулами нуклеиновых кислот, образующими жидокристаллическую дисперсию, - невозможностью точного определения величины аномального оптического сигнала в УФ-области спектра (в полосе поглощения ДНК), что обусловлено недостаточной прозрачностью пленок (гелей) в этой области спектра. Поэтому, хотя наличие исследуемого соединения может быть зарегистрировано, точное определение его концентрации крайне затруднительно, - применением для регистрации аномального оптического сигнала дорогостоящих стационарных дихрографов (Jobin-Yvon, Mark III или MarkV; Jasco - 710-720), имеющихся, как правило, только в специализированных научных лабораториях. Недостатком этих приборов является не только их высокая стоимость, но и невысокая скорость регистрации величины оптического сигнала [Mark III, Performances; Jasco J-710/720 Spectropolarimeter, Instruction Manual].

Известный дихрограф фирмы Jasco [2], который может быть применен как устройство для определения БАВ в анализируемой жидкости, содержит установленные последовательно источник светового излучения; селектор, формирующий световой поток определенной длины волны; поляризатор, формирующий из указанного потока линейно поляризованный световой поток, модулятор поляризации, преобразующий линейно поляризованный световой поток в циркулярно поляризованный световой поток с периодически изменяющимся направлением вращения вектора поляризации; ячейку для размещения исследуемой пробы; фотодетектор, преобразующий оптический сигнал, генерируемый компонентами исследуемой пробы, в пропорциональный ему электрический сигнал; синхронный усилитель, усиливающий указанный электрический сигнал; средство для обработки полученного электрического сигнала и вычисления концентрации биологически активного вещества; блок управления.

При этом в качестве селектора указанный дихрограф содержит имеющий низкий коэффициент пропускания светового потока двойной призменный монохроматор, основанный на синхронном вращении двух полупризм посредством электромеханического привода, содержащего рычажный механизм, приводящийся в действие посредством электродвигателя. Световой поток от источника светового излучения попадает в двойной монохроматор, две призмы которого настроены на определенную длину волны. Наличие рычажного механизма дает возможность перестраивать указанный монохроматор на разные длины волн выходящего из него светового потока.

Однако из-за высокой инерционности указанного привода, содержащего рычажный механизм, указанный селектор обладает малой скоростью перестройки на разные длины волн. В результате этого использование указанного дихрографа для определения БАВ значительно увеличивает время проведения анализа исследуемой пробы, что при исследовании биологических жидкостей, таких как кровь, моча и так далее, может нанести вред здоровью, а в некоторых случаях и жизни пациентов.

Кроме того, из-за сложной конструкции монохроматора он имеет большие потери на оптических элементах, в результате чего обладает низким коэффициентом пропускания светового потока, что приводит к ухудшению чувствительности устройства в целом и не дает ему определить низкие концентрации БАВ в анализируемых жидкостях. При этом указанное устройство многофункционально и обладает большими габаритами и весом, что требует специально оборудованного помещения для его установки и эксплуатации. В результате указанное устройство не обладает мобильностью и не может быть использовано для оперативного проведения срочных анализов в лабораториях клиник или непосредственно в больничной палате.

Названные выше факторы существенно затрудняют быстрое получение информации о концентрации БАВ в анализируемых растворах и ограничивают широкое применение оптических систем для такого рода анализов в условиях клиник и лабораторий.

В основу предлагаемого изобретения положена задача создать способ определенной БАВ в анализируемой жидкости с такими условиями его проведения и такое устройство для осуществления этого способа, которые позволили бы быстро и точно определять концентрацию, в том числе низкую, биологически активного вещества, способного взаимодействовать с линейными двухцепочечными молекулами ДНК, в любых жидкостях, в том числе биологических жидкостях, таких как плазма крови, цельная кровь и тому подобное.

Эта задача решена созданием способа определения в анализируемой жидкости биологически активного вещества, взаимодействующего с лиотропной жидкокристаллической холестерической дисперсией ДНК, сформированной в нейтральном по отношению к ДНК полимере, в котором согласно изобретению лиотропную жидкокристаллическую холестерическую дисперсию формируют в водно-солевом растворе указанного полимера из линейных двухцепочечных молекул ДНК низкой молекулярной массы непосредственно перед смешением с анализируемой жидкостью, содержащей определяемое БАВ, при этом анализируемую жидкость предварительно смешивают с указанным полимером в условиях, при которых оптические свойства лиотропной жидкокристаллической дисперсии ДНК не нарушается, затем через пробу, полученную в результате указанного смешения подготовленной анализируемой жидкости с указанной жидкокристаллической дисперсией ДНК, пропускают поток светового циркулярно поляризованного излучения и регистрируют оптический сигнал, генерируемый жидкокристаллической дисперсией на двух длинах волн, одна из которых находится в области поглощения азотистых оснований ДНК, а другая - в области поглощения определяемого биологически активного вещества, после чего вычисляют соотношение между этими сигналами на указанных длинах волн и по величине этого соотношения определяют концентрацию БАВ по калибровочной кривой. Теория формирования жидкокристаллических дисперсий ДНК в нейтральных по отношению к этой макромолекуле растворах полимеров описана в работе [Yevdokimov Yu. M. , Skuridin S.G., Salyanov V.l. (1988). Liquid Crystals, 3, p.p. 1443-1459], а экспериментальные граничные условия, при которых аномальная оптическая активность жидкокристаллических дисперсий ДНК сохраняется, приведены в работе [Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Акименко Н. М. (1984). Высокомолекулярные соединения, А24, стр. 2403-2410].

Использование предлагаемого способа позволяет быстро, просто, с высокой точностью и чувствительностью определять любые биологически активные вещества, способные взаимодействовать с линейными двухцепочечными молекулами ДНК в любых жидкостях, в которых можно создать условия для сохранения жидкокристаллических дисперсий ДНК, при этом анализ можно осуществлять в любых лабораториях, где не требуется специально организованного места и специальной квалификации обслуживания персонала.

Предлагаемый способ особенно ценен для быстрого, высокоточного и высокочувствительного определения наличия и концентрации (в том числе низкой) БАВ (противоопухолевые препараты, антибиотики, белки и так далее) в крови пациентов в практике онкологии, хирургии, гинекологии, при медико-экологическом скрининге и может спасти здоровье и жизнь пациентов в тех случаях, когда другие способны не применимы или не дают надлежащего результата.

Целесообразно в качестве нейтрального полимера использовать полиэтиленгликоль, поскольку этот полимер является безвредным для экспериментатора, химически нейтральным по отношению к ДНК, обладает высокой растворимостью, необходимой для создания условий фазового исключения ДНК, оптической изотропией и высокой прозрачностью, необходимой для измерения спектров кругового дихроизма, причем препараты этого полимера разной молекулярной массы доступны по разумной цене.

Желательно в качестве анализируемой жидкости использовать биологическую жидкость, поскольку фармакокинетика биологически активных соединений нацелена на применение в таких жидкостях, как кровь, моча и т.д.

Благоприятно в качестве биологической жидкости использовать плазму крови, поскольку в этом случае уменьшается число факторов, влияющих на точность определения биологически активного вещества.

Целесообразно, чтобы биологически активное вещество представляло собой противоопухолевое соединение антрахиноновой группы, поскольку соединения этой группы широко используются как сами, так и в различных комбинациях в химиотерапии онкологических заболеваний.

Желательно, чтобы противоопухолевое соединение антрахиноновой группы представляло собой митоксантрон, поскольку митоксантрон является одним из самых мощных противоопухолевых агентов широкого спектра действия.

Благоприятно, чтобы при определении биологически активного вещества в биологической жидкости с гетерогенным в ней его распределением концентрация биологически активного вещества, полученная по калибровочной кривой, корректировалась с учетом коэффициента его распределения между компонентами в биологической жидкости.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для быстрого, высокоточного и высокочувствительного определения, наличия и концентрации различных биологически активных веществ (противоопухолевые препараты, антибиотики, белки и так далее) в различных жидкостях, в том числе в крови пациентов в практике онкологии, хирургии, гинекологии, при медико-экологическом скрининге и поможет спасти здоровье и жизнь пациентов в тех случаях, когда другие способны не применимы или не дают надлежащего эффекта.

Поставленная задача решена также созданием устройства для определения в анализируемой жидкости биологически активного вещества, содержащего установленные последовательно источник светового излучения, селектор, формирующий световой поток определенной длины волны, поляризатор, формирующий из указанного потока линейно поляризованный световой поток, модулятор поляризации, преобразующий линейно поляризованный световой поток в цикрулярно поляризованный световой поток с периодическим изменением направления вращения вектора поляризации, ячейку для размещения исследуемой пробы, фотодетектор, преобразующий оптический сигнал, генерируемый компонентами исследуемой пробы, в пропорциональный ему электрический сигнал, синхронный усилитель, усиливающий указанный электрический сигнал, средство для обработки полученного электрического сигнала и вычисления концентрации биологически активного вещества, блок управления, в котором согласно изобретению селектор содержит минимально необходимое число оптических элементов и электродинамический (гальванометрический) привод позиционного типа, обеспечивающий измерение сигнала на двух выбранных для определяемого БАВ длинах волн.

Указанное конструктивное выполнение позволяет по меньшей мере в десять раз сократить время селекции требуемой длины волны светового потока при уменьшении энергопотребления и позволяет быстро, точно и с высокой чувствительностью определять концентрацию (в том числе низкую) биологически активных веществ, способных взаимодействовать с молекулами двухцепочечных ДНК в анализируемых жидкостях, в том числе в биологических жидкостях, таких как цельная кровь, плазма крови и так далее.

Желательно, чтобы селектор представлял собой одинарный монохроматор с минимальным числом оптических элементов, включающих и дисперигрующий элемент, при этом один из указанных элементов закреплен на валу двигателя электродинамического (гальванометрического) привода [И.Н. Нестерук, О.Н. Компанец, В.И. Мишин (1988). Квантовая электроника, 15, N 3, стр. 455-459] с возможностью его углового позиционирования для быстрой и точной установки двух выбранных длин волн.

Наличие указанного привода и использование такого монохроматора упрощают конструкцию устройства в целом, они позволяют значительно уменьшить его габариты. Это приводит к значительному удешевлению устройства и позволяет оснастить этим устройством любые лаборатории, так как предлагаемое устройство не требует наличия специально организованного места и специальной квалификации обслуживающего персонала.

Кроме того, использование в качестве селектора простого монохроматора с минимальным числом оптических элементов позволяет упростить оптическую систему устройства, уменьшить потери света на оптических элементах, то есть увеличить коэффициент пропускания светового потока, и благодаря этому усилить чувствительность устройства, уменьшить его размеры и, следовательно, обеспечить мобильность устройства для его использования в любых условиях.

Благоприятно, чтобы диспергирующий элемент представлял собой дифрационную решетку. Это дает возможность обеспечить требуемую (1-5 нм) разрешающую силу монохроматора, а значит не потерять в спектральном разрешении селектора и в точности измерения оптического сигнала.

Возможно, чтобы селектор содержал набор узкополосных интерференционных фильтров, каждый из которых имеет полосу пропускания в области выбранной для определяемого БАВ длины волны, закрепленных на валу двигателя электродинамического (гальванометрического) привода позиционного типа с возможностью их поочередного введения в световой поток.

Использование в селекторе набора интерференционных фильтров, укрепленных на валу двигателя электродинамического (гальванометрического) привода позиционного типа, позволяет при сохранении высокой скорости селекции требуемой длины волны существенно упростить оптическую схему селектора и, следовательно, увеличить коэффициент пропускания светового потока и уменьшить габариты и вес всего устройства.

Целесообразно, чтобы электродинамический (гальванометрический) привод содержал двигатель, имеющий статор и ротор, и датчик угла поворота ротора, представляющий собой индуктивный дифференциальный преобразователь угла поворота ротора в электрический сигнал, при этом указанный датчик содержит модулятор, выполненный в виде кольца, закрепленного на валу ротора, двигатель с эксцентриситетом относительно его оси вращения.

Благодаря наличию указанного эксцентриситета появляется возможность реализовать определенный характер зависимости амплитуды сигнала датчика угла поворота, а значит и длины волны селектора, от угла поворота ротора двигателя, причем характер этой зависимости определяется формой (конструктивным выполнением) модулятора.

Таким образом, использование предлагаемого способа и предлагаемого устройства позволяет быстро, точно и с высокой чувствительностью определять наличие и концентрацию различных биологически активных веществ (противоопухолевые препараты, антибиотики, белки и так далее) в различных жидкостях, в том числе в биологических жидкостях, например, в крови пациентов в практике онкологии, хирургии, гинекологии, при медико-экологическом скрининге, и поможет спасти здоровье и жизнь пациентов в тех случаях, когда другие способы не применимы или не дают надлежащего эффекта.

Кроме того, предлагаемое изобретение позволяет значительно уменьшить размеры и вес устройства, а следовательно, обеспечить его мобильность для использования в любых условиях, не требующих специально оборудованного места.

Предлагаемый способ определения концентрации БАВ осуществляют следующим образом: - непосредственно перед определением БАВ в анализируемой жидкости формируют в водно-солевом растворе нейтрального полимера лиотропную холестерическую жидкокристаллическую дисперсию линейных двухцепочечных молекул ДНК низкой молекулярной массы; - смешивают жидкость, содержащую БАВ, с раствором полимера таким образом, чтобы в полученной смеси создавались физико-химические условия, обеспечивающие сохранение аномальных оптических свойств, в частности кругового дихроизма, характерных для жидких кристаллов ДНК; - центрифугируют полученную смесь и отбирают супернатант, содержащий молекулы БАВ, не взаимодействующие с компонентами анализируемой жидкости; - смешивают супернатант с жидкокристаллической дисперсией ДНК, сформированной в водно-солевом растворе нейтрального полимера, что приводит к получению пробы для анализа, в которой молекулы БАВ быстро (за время 10^-6 с) реагируют с ДНК; - облучают пробу циркулярно поляризованным светом; - измеряют аномальную оптическую активность пробы на двух длинах волн, одна из которых находится в области поглощения азотистых оснований ДНК, другая - в области поглощения БАВ (при этом полоса в области поглощения ДНК используется не только как внутренний стандарт качества сформированной жидкокристаллической дисперсии, но и отражает стабильность и правильность работы предлагаемого устройства, полоса в спектре кругового дихроизма в области поглощения БАВ выступает в качестве индикатора его наличия в исследуемой жидкости, а амплитуда этой полосы отражает концентрацию БАВ); - вычисляют соотношение между величинами оптических сигналов при названных выше длинах волн; - определяют точную концентрацию БАВ по величине этого соотношения с использованием калибровочной кривой зависимости отношения величин сигналов от концентрации БАВ, предварительно построенной по описанному выше способу.

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены примеры, характеризующие различные стадии заявляемого способа со ссылками на прилагаемые чертежи.

Фиг. 1 характеризует спектр поглощения исходного водно-солевого раствора линейной двухцепочечной ДНК, использованной для приготовления частиц холестерической жидкокристаллической дисперсии в координатах - оптическая плотность, A - длина волны, ; C_ДНК 80 мкг/мл; ДНК эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия); Мол. масса ДНК (3-5)10⁵Da.

Фиг. 2 характеризует спектры кругового дихроизма исходной ДНК и ее холестерической жидкокристаллической дисперсии в координатах = _L-_R - длина волны , где величина = A/C_ДНК - молярный круговой дихроизм; _L - молярный дихроизм для левоциркулярно поляризованного света _R - молярный дихроизм для правоциркулярно поляризованного света; A - экспериментально измеренный круговой дихроизм; C_ДНК - концентрация ДНК; кривая 1 - спектр КД холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК; кривая 2 - спектр ДНК водно-солевого раствора исходной линейной ДНК.

Кривая 1 (правая ордината): C_ПЭГ= 170 мг/мл, мол. масса ПЭГ=4000 ("Ferak", Германия); 0,3 M NaCl + 10^-2 M фосфатный буфер; pH 7,0.

Кривая 2 (левая ордината): 0,3 M NaCl + 10^-2M фосфатный буфер; pH 7,0.

Фиг. 3 характеризует спектр поглощения митоксантрона, использованного в качестве примера биологически активного соединения в координатах - оптическая плотность, круговой дихроизм A - длина волны ; 0,3 M NaCl + 10^-2 M фосфатный буфер; pH 7,0; C_tMX=1,510^-5 M.

Фиг. 4 характеризует спектры кругового дихроизма жидкокристаллической дисперсии ДНК, обработанной разными концентрациями митоксантрона, в координатах круговой дихроизм A = A_L-A_R - длина волны , где A_L - дихроизм для левоциркулярно поляризованного света, A_R - дихроизм для правоциркулярно поляризованного света, A - экспериментально измеренный круговой дихроизм; 1 - C_tMX = 0; 2 - C_tMX = 1,55 10^-6 M; 3 - C_tMX = 3,08 10^-6 M; 4 - C_tMX = 5,35 10^-6 M.

C_ДНК = 20 мкг/мл; C_ПЭГ = 170 мг/мл; 0,3 M NaCl + 10^-2 M фосфатный буфер; pH 7,0.

A = A_L-A_R в мм ; 1 мм = 5 10^-5 оптических единиц; L = 1 см.

Фиг. 5 отражает зависимость амплитуды A₆₈₀ отрицательной полосы при 680 нм в спектре кругового дихроизма жидкокристаллической дисперсии ДНК от концентрации (C_tMX) добавленного митоксантрона, причем стрелкой на рисунке обозначена концентрация митоксантрона, вплоть до которой между величинами A₆₈₀ и C_tMX наблюдается прямо пропорциональная зависимость.

C_ДНК = 20 мкг/мл; C_ПЭГ = 170 мг/мл; 0,3 M NaCl + 10^-2 M фосфатный буфер; pH 7,0; A₆₈₀ в мм ; 1 мм = 1 10^-6 оптических единиц; L = 1 см.

Фиг. 6 показывает зависимость амплитуды полосы в спектрах кругового дихроизма жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-МХ) при 680 нм от величины C_tMX в анализируемых пробах и в контрольных растворах (соответственно прямая 1 и прямая 2). Стрелками на фиг. 6 (A Б B = C_tMX) показан способ определения величины C_tMX в анализируемой пробе, учитывающий связывание митоксантрона с форменными элементами крови и высокомолекулярными компонентами плазмы разной химической природы; C_ДНК = 20 мкг/мл; C_ПЭГ = 170 мг/мл.

0,225 M NaCl + 7,5 10^-3 M фосфатный буфер; pH 7,0.

A₆₈₀ в мм; 1 мм = 2 10^-6 оптических единиц; L = 1 см.

Фиг. 7 отражает зависимость величины C^про_tMX^ба от величины C^кон_tMX^троль: C_ДНК = 20 мкг/мл; C_ПЭГ = 170 мг/мл; 0,225 M NaCl + 7,5 10^-3 M фосфатный буфер; pH 7,0.

Фиг. 8 показывает зависимость отношения полос в спектрах КД жидкокристаллических дисперсий комплексов (ДНК-МХ) при 680 нм и ₁ 680 нм и ₂ 275 нм 275 нм от величины C^про_tMX^ба . На фиг. 8 разные точки относятся к экспериментам, проведенным с использованием крови четырех разных доноров.

C_ДНК = 20 мкг/мл; C_ПЭГ = 170 мг/мл; 0,225 M NaCl + 7,5 10^-3 M фосфатный буфер; pH 7,0; A₆₈₀ и A₂₇₅ в мм ; 1 мм = 2 10^-6 оптических единиц; L = 1 см.

Фиг. 9 изображает принципиальную схему подготовки пробы крови для определения наличия БАВ, взаимодействующих с жидкокристаллической дисперсией ДНК. (Следует обратить внимание на то, что в результате предложенного способа подготовки крови исходная концентрация БАВ уменьшается в четыре раза).

Пример 1. Формирование жидкокристаллической дисперсии ДНК.

1.1. Навески NaCl (17,532 г), NaH₂PO₄2H₂O (0,78 г) и Na₂HPO₄12H₂O (1,79 г) помещают в мерную колбу (V = 1000 мл) и растворяют в дистиллированной воде; доводят объем раствора до метки.

Таким образом готовят 1 л 0,3 M раствора NaCl, содержащего 10^-2 M фосфатный буфер.

1.2. 10 мг препарата двухцепочечной ДНК ("Reanal", Венгрия; (0,3-0,5)10⁵ Da) помещают в мерочную пробирку (V=10 мл) и растворяют в растворе, приготовленном по п. 1.1; доводят объем раствора до метки.

Таким способом готовят 10 мл водно-солевого раствора ДНК с фиксированной концентрацией. Концентрацию ДНК определяют спекрофотометрически, исходя из соотношения: 1 мг ДНК соответствует 20 оптическим единицам в мл 1 мл _макс= 258,4 нм ; pH 7,0).

1.3. Навески NaH₂PO₄2H₂O (0,078 г) и Na₂HPO₄12H₂O (0,179 г), NaCl (1,7532 г) и полиэтиленгликоля (ПЭГ) ("Ferak", Германия; ПЭГ = 4000; 34 г) помещают в мерную колбу (V = 100мл) и растворяют в дистиллированной воде; доводят объем раствора до метки.

Таким способом готовят 100 мл водно-солевого раствора ПЭГ (C_ПЭГ = 340 мг/мл; 0,3 M NaCl+10^-2 M фосфатный буфер).

1.4. В стеклянной пробирке (V = 10 мл) смешивают 4,6 раствора 1.1 и 0,4 мл раствора 1.2.

Таким образом готовят 5 мл водно-солевого раствора двухцепочечной линейной ДНК (C_ДНК=80 мкг/мл; 0,3 M NaCl+10^-2 M фосфатный буфер).

После смешения растворов 1.1 и 1.2 регистрируют спектр поглощения водно-солевого раствора ДНК заданной концентрации, приготовленного по п. 1.4 (фиг. 1, где изображен спектр поглощения водно-солевого раствора ДНК), C_ДНК - 80 мкг/мл; ДНК эритроцитов цыплят ("Reanal", Венгрия); Мол. м. ДНК - (3-5)10⁵ Da; 1.5. В стеклянной пробирке (V=15 мл) смешивают 4 мл раствора (1.3) с 4 мл раствора (1.4); полученную смесь интенсивно перемешивают в течение 3 мин.

Таким способом готовят 8 мл стандартной жидкокристаллической дисперсии ДНК (C_ДНК=40 мкг/мл; C_ПЭГ=170 мг/мл; 0,3 M NaCl+10^-2 M фосфатный буфер).

После смешения регистрируют спектр кругового дихроизма (КД) смеси, приготовленной по п. 1.5. Интенсивная отрицательная полоса в области поглощения азотистых оснований ДНК (фиг. 2, кривая 1) свидетельствует о том, что в результате смешениярастворов, приготовленных по п. 1.3 и 1.4, образуется жидкокристаллическая дисперсия ДНК холестерического типа.

Пример 2. Оптические свойства жидкокристаллической дисперсии ДНК, обработанной митоксантроном.

2.1. Навеску (0,4 мг) митоксантрона (МХ; противоопухолеволе соединение антрахиновой группы) помещают в пробирку (V=0,5 мл) и растворяют в 200 мкл раствора 1.1 Таким способом готовят 200 мкл водно-солевого раствора МХ (C_МХ=2 мг/мл; 0,3 М NaCl + 10^-2 M фосфатный буфер).

2.2. Концентрацию МХ в растворе 2.1. определяют спекрофотометрически при помощи спектрофотометра ("Specord" М 40, Германия) пользуясь, известным значением молярного коэффициента поглощения МХ = 21500 М^-1см^-1; _макс= 660 нм. Молярная концентрация МХ в растворе 2.2 составляет 3,868 10^-3 M.

На фиг. 3 приведен спектр поглощения водно-солевого раствора МХ.

2.2. В прямоугольную оптическую кварцевую кювету (V = 4 мл; длина оптического пути 1 см) помещают 2 мл стандартной жидкокристаллической дисперсии, приготовленной по п. 1.5, и записывают ее спектр КД в области длин волн 750-220 нм при помощи дихрографа "Jodin-Yvon, Mark III" (Франция).

2.3. В кювету, содержащую 2 мл дисперсии ДНК, приготовленной по п. 2.2, добавляют по 1 мкг раствора 2.1 (суммарный объем добавленного раствора 2.1 составляет 6 мкл); после каждой добавки раствора 2.1 полученную в оптической кювете смесь перемешивают и регистрируют спектр КД в области длин волн 750-220 нм.

На фиг. 4 спектр КД исходной жидкокристаллической дисперсии ДНК (кривая 1) сопоставлен со спектрами КД этой же дисперсии, в которую добавлены разные концентрации (C_tМХ) МХ (C_tМХ - общая концентрация МХ, добавленного в раствор жидкокристаллической дисперсии ДНК). Добавление МХ сопровождается появлением в спектре КД жидкокристаллической дисперсии ДНК дополнительной интенсивной отрицательной полосы в области поглощения МХ ( 680 нм) . При этом амплитуда полосы при длине волны 680 нм связана с амплитудой полосы при 275 нм следующим образом: при одинаковой концентрации МХ амплитуда полосы при 680 нм тем выше, чем выше амплитуда полосы при 275 нм и наоборот.

Зависимость амплитуды полосы при 680 нм в спектре КД жидкокристаллической дисперсии комплексов (ДНК-МХ) от C_tМХ (фиг.5) показывает, что между величиной A₆₈₀ и C_tМХ наблюдается прямо пропорциональная зависимость в области концентраций МХ от 0 до 1210^-6 M. Поскольку амплитуда полосы в спектре КД в области поглощения МХ (A₆₈₀) зависит только от концентрации молекул МХ, связанных (C_bМХ) в комплекс с молекулами ДНК, и поскольку между величинами C_tМХ и C_bМХ существует простое соотношение: C_tМХ = C_bМХ + C_freeМХ, где C_freeМХ - концентрация в растворе свободных (не связанных в комплекс с молекулами ДНК) молекул МХ, то прямо пропорциональную зависимость между величинами A₆₈₀ и C_tМХ можно рассматривать как указание на низкую концентрацию свободного МХ в растворе.

Величина C_bМХ при фиксированной концентрации ДНК тем ближе к величине C_tМХ, чем ниже концентрация последней. В области фармакологически значимых значений концентрации МХ (нг/мл) можно принять, что величина C_bМХ приблизительно равна величине C_tМХ.

Таким образом, интенсивная полоса в области поглощения МХ в спектре КД в сочетании с наличием прямо пропорциональ