Производные маркфортин/парагерквамида, способ подавления вредителей растений, насекомых или нематод штамм гриба

Производные маркфортин/парагерквамида, способ подавления вредителей растений, насекомых или нематод штамм гриба

Реферат

 

Раскрыты 18-тиомаркфортин производные природных продуктов маркфортин А, В и С, С-13 тиопарагерквамида и их производные, новые N-1 маркфортины А, В и С и их производные, новый N-1 парагерквамид и его производные, полезные в лечении и предупреждении инфекций, вызванных гельминтами и членистоногими у животных и растений. Синтетические производные имеют формулу 1. 3 с. и 4 з. п. ф-лы, 2 табл. .

Маркфортины являются известными соединениями и описаны Polonsky et al. B. Journal of the Cemical Society Chemical Communications, 1980, 601-602 (Маркфотин A) и Tetrahedron Letters, 1981, 22 1977-1980 (Маркфотины B и C). Соединения являются грибковыми метаболитами Penicillium rogneforti. Макрофортины структурно относятся к парагерквамидам, которые также являются известными соединениями Парагерквамиды раскрыты Yamazaki at al Tefraheolron Letters 1981 22 135-136, и Blanchflower et.al. Journal of Antibiotirs, 1991, 44, 492-497. Патент США 4 866 060 и 4 923 867 описывают применение маркфортинов A, B и C и нескольких их производных, как пригодных для лечения и профилактики болезней, вызываемых паразитами у животных.

Парагерквамид имеет следующую структуру: Макркфотрин A имеет следующую структуру: Маркфортин B имеет следующую структуру: Маркфортин C имеет следующую структуру: WO 91/09961 (опубл. 11 июня 1991 г.) описывает различные производные маркфортина и парагерквамида и их (12) окисей также как и получение VW 29919 (парагерквамид) и VM 55596 (N(12) окись парагерквамида) (помимо прочего) из Penicillinm Sp. IMI 332995.

Патент США 4 873 247 описывает производные парагеркамида и штамм Penicillinm charlessi MF 5123 (ATCC 20841) для получения парагерквамида. Патент США 4 978 656 (также как и EP 390532-A, EP-301742-A) описывает различные синтетические производные, а также получение парагерквамида из Penicilli um charlelli MF 5123 (ATCC 20841).

Парагерквамид является соединением, продуцируемым при определенных условиях грибкового организмом Penicillium paraherguei. WO 92/00300 (опубл. 9 января 1992 г.) раскрывает синтезы соединений, относящихся к парагерквамиду, полученных из (продуцированных) Penicillium paraherguei депонированном в С. А. В. International Mycological Institute, Ferry Lane, Kew, London под номером CMI 68220.

Данное изобретение касается синтезов C-18 тиомаркфортинов A, B и C и их производных, C-18 тиопарагерквамида и его производных, новых N - I маркфортинов, A, B и C и их производных, нового N - I парагерквамида и его производных, и применения этих соединений в качестве прооивопаразитных агентов.

Цель изобретения состоит в описании этих производных тиомаркфортина, тиопарагерквамида, маркфортина и парагерквамида.

Кроме того, целью данного изобретения является описание способа получения этих соединений.

Дальнейшая цель состоит в описании применения данных соединений в качестве противопаразитных агентов в лечении и профилактике болезней, вызываемых паразитами.

Кроме того, дальнейшей целью является описание композиций для лечения заболеваний, вызываемых паразитами, содержащих новые соединения данного изобретения в качестве их активного ингредиента.

Соединения данного изобретения представлены формулой I: где m - 0 или 1; n = 1; W = 5 или 0, R_14a или R_14b - атом водорода; R₂₄ и R₂₅ образуют двойную связь; R_18a - атом водорода или C₁-C₇ - алкил; R₁ - атом водорода; -C(O)R¹ группа (где R¹ - цикло C₃-C₈ - алкил, феноксикарбонил, -C(O)-C₂-C₂₄-алкил, нитрофеноксикарбонил, 1,3-диоксо-2H-изоиндолил, динитробензолсульфенил, трихлорметилсульфенил, C₁-C₄-алкоксикарбонилсульфенил, бензолсульфонил, тетрагидрофуранил, 1,4-диокси-C₂-C₇-алкенил или R₁ - группа -C(O)-NR₄R₅, где R₄ и R₅ вместе с атомом азота образуют насыщенное гетероциклическое кольцо: пирролидинил, морфолинил, пиперазинил, незамещенный или замещенных C₁-C₄-алкилом, C₁-C₄-алканоилом, C₁C₄-алкоксикарбонилом, 1,3- бензодиоксолил -C₁-C₄-алкилом, пиридинилом, галогенпиридинилом, фенилом (незамещенным или замещенным атомом галогена), хлоркарбонилом, трифтор C₁-C₄-алкоксикарбонилом, трифтор C₁-C₄-алкилтиадиазолинилом, или R₄ и R₅ образуют пиперидинил, незамещенный или замещенный фенилом или моно- или ди-замещенный C₁-C₄-алкилом, или их фармацевтически приемлемые соли, или их гидраты.

Другой аспект данного изобретения составляет 18-тиомаркифтортин или производные формулы II или N-1-маркфтортин IV где заместитель имеют те же значения, что и для формулы I.

Предпочтительны соединения I, где R₁ - , а - насыщенный гетероцикл.

Примеры гетероциклов, образованных -NR₄R₅, , являются 4-морфолин, 4-фенил-1-пиперазин, 4-(2-пиридинил)-1-пиперазин, 2,6-диметил-4-морфолин, 1-пирролидин, 4-метил-1-пиперазин, 1-пиперидин, 4-фенил-1-пиперидин, 2-метилпиперидин, 3-метилпиперидин, 4-метилпиперидин, N-метилпиперазин, 1-метилгомопиперазин, 1-ацетилпиперазин Предпочтительными соединениями изобретения являются 18-тиомаркфортин A (соединение 2), 18-тиомаркфортин B (соединение 2A), 1-пирролидинил-маркфортин A (соединение 12), 1-циклопропилкарбонил-маркфортин A (соединение 12A), 1-феноксикарбонил-маркфортин A (соединение 12B), 1-пальмитоил-маркфортин A (соединение 12C), 1-(4-нитрофеноксикарбонил)-маркфортин A (соединение 12D), 1-(1-пиперидинкарбонил)-маркфортин A (соединение 12F), 1-[[4-(этоксикарбонил)пиперазин-1-ил] карбонил]-маркфортин A (соединение 12G), 1-[[4-(бензил)пиперазин-1-ил]карбонил]-маркфортин A (соединение 12H), 1-[[4-(1,3-бензодиоксол-5-илметил)пиперазин-1-ил] карбонил]- -маркфортин A (соединение 12I), 1-[[4-(метил)пиперазин-1-ил]карбонил]-маркфортин A (соединение 12J), 1-(1,3-дигидро-1,3-диоксо-2H-изоиндол-2-ил)-маркфтортин A (соединение 12K), 1-[[4-(пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил] карбонил] -маркфортин A (соединение 12L), 1-[[4-(фенил)пиперазин-1-ил]карбонил]-маркфортин A (соединение 12M), 1-[[4-(хлорокарбонил)пиперазин-1-ил] карбонил] -маркфортин A (соединение 12N), 10,10''-(1,4-дикарбонилпиперазин)бис(6', 7',8',9',10',10'a- гексагидро-1', 1', 4,4,12'-пентаметил)-[2'S-[2'альфа, 3'а.альфа, 9'а.альфа, 10/2'''R^*, 3'''aS^* 9'''aS, 10'''aR^*)10'a.бета]]-спиро[4H,8H-[1,4]диоксепино[2,3-g]индол- 8,2'(3'H)-[1H,4H-3a,9a](иминометано циклопента[b]хинолизин]-9,11'(10H)-дион (соединение 120), 1-[[4-(фенил)пиперидин-1-ил]карбонил]-маркфортин A (соединение 12P), 1-[[4-(диметил)пиперидин-1-ил]карбонил]-маркфортин A (соединение 12Q), 1-[[4-(5-хлорпиридазин-3-ил)пиперазин-1-ил] карбонил] -маркфортин A (соединение 12R), 1-[[4-(4-хлорфенил)пиперазин-1-ил] карбонил] -маркфортин A (соединение 12S), 10,10''-(1,4-диоксо-2-бутен)бис(6', 7',8',9',10',10'a-гексагидро- 1',1', 4,4,12'-пентаметил)-[2'S-[2'. альфа. , 3'a. альфа. , 9'a.альфа, 10(2'''R^*, 3'''aS^*, 9'''aS^*, 10'''aR^*) 10'a, бета]]-спиро[4H, 8H-[1,4]диоксепино[2,3-g] индол-8,2'(3'H)- [1H, 4H-3a, 9a] (иминометано)циклопента[b] хинолизин] -9,11'(10H)-дион (соединение 12T), 1-[[4-(трихлороэтоксикарбонил)пиперазин-1-ил] карбонил] - маркфортин A (соединение 12U), 1-[[4-(3-трифторометил-тиадиазол-1-ил)пиперазин-1-ил] карбонил] - маркфортин A (соединение 12V), 1-ацетоксиметил-маркфортин A (соединение 13) 1-(2,4-динитробензолсульфенил)-маркфортин A (соединение 14), 1-(4-морфолиносульфенил)-маркфортин A (соединение 14A), 1-(трихлорометилсульфенил)-маркфортин A (соединение 14B), 1-(метоксикарбонилсульфенил)-маркфортин A (соединение 14C), 1-(бензолсульфенил)-маркфортин A (соединение 14D), 1-(4-морфолинкарбонил)-маркфортина AN-окись (соединение 15), 1-(2-тетрагидрофуранил)-маркфортин A (соединение 16).

Фармацевтически приемлемые соли означают соли, полезные при назначении соединений данного изобретения в качестве лекарств, эти соли включают мезилат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, фосфат, ацетат, пропионат, лактат, малеат, малат, сукцинат, тартрат и тому подобные. Эти соли могут быть в гидратированной форме.

Соединение формулы II приготавливают следующими способами.

Неожиданно было найдено, что обработка маркфортинов A, B и C или соответственно их замещенных C-24, C-25, N-1 и N-18a производных пентасульфидом фосфора или предпочтительно 2,4-бис(метоксифенил)-1,3-дитиа-2,4-дифосфетан-2,4-дисульфидом (реагент Lawesson'a) селективно дает соответствующие 18-тио-производные. Подходящие C-24, C-25, N-1 и N-18a замещенные производные маркфортинов A, B и C для этой реакции легко приготавливают способами, приведенными в [1] описание которого включено здесь в качестве ссылки. Реакции проводятся в подходящем инертном растворителе, таком, как пиридин, коллидин, толуол (предпочтительно), ксилол, диоксан, тетрагидрофуран и тому подобных, при температурах 10 - 180^oC, предпочтительно 80 - 140^oC. Или же C-24, C-25 и N-1 производные могут быть приготовлены из 18-тиомаркфортинов. Например, большая серия аналогов 18-тиомаркфортина может быть приготовлен алкилированием или ацилированием N-1 и N-18a замещенных 18-тиомаркфортинов. Такие производные могут быть легко приготовлены последовательной обработкой раствора 18-тиомаркфортина A, N-18a-замещенного 18-тиомаркфортина B или N-18a-замещенного 18-тиомаркфортина C в протонном органическом растворителе, таком, как тетрагидрофуран, диэтиловый эфир, бензол и тому подобные, избытком сильного основания, такого, как гидрид калия (предпочтительно), гидрид натрия, бутиллития, трет.-бутилат калия и тому подобного, с последующей обработкой подходящим алкилирующим или ацилирующим агентом при температурах в интервале 0 - 50^oC от 0,25 до 48 ч.

Подходящие алкилирующие агенты включают алкил бромиды, алкил иодиды, алкил сульфонаты, алкенил иодиды, алкинил бромиды, алкоксиалкил хлориды и тому подобное. Подходящие ацилирующие агенты включают ацил ангидриды, ацил хлориды, ацил бромиды, замещенные бензолсульфонил хлориды, замещенные бензолсульфоновые ангидриды, сульфенил хлориды, изоцианаты, карбамоил хлориды, хлорформиаты и тому подобные.

Дополнительные серии производных могут быть произведены путем модификации C24-C25 двойной связи 18-тиомаркфортионов A, B и C. 24, 25 дигидро аналоги легко приготавливаются перемешиванием раствора подходящего 18-тиомаркфортина в спиртовом растворителе, таком, как метанол, этанол, пропанол и тому подобном с катализатором, таким как палладий, платина, трис (трифенилфосфин) - хлорородий и тому подобные в присутствии газообразного водорода. Продукт, который является аналогом 24,25-дигидро-18-иомаркфортина, может быть выделен и очищен с использованием методов, известных для специалиста в данной технике. Следует отметить, что описанные выше реакции по модификации другой части 18-тиомаркфортин структуры могу также применяться к 24, 25-дигидро 18-тиомаркфортин аналогам для приготовления соответствующих 24, 25 - дигидро аналогов. Дополнительно модифицированные по C24-C25 двойной связи аналоги 18-тиомаркфортинов могут быть получены через 24, 25 дибромид, который легко приготавливают обработкой раствора 18-тиоомаркфортинов в галогенизированном растворителе, таком, как дихлорметан, хлороформ, четырехлористый углерод и тому подобные I молярным эквивалентом брома при интервале температур от -20 до 25^oC за время от 0,25 до 8 ч. Этот способ дает соответствующее производное 24,25-дибромо 24,25-дигидро-18-тиомаркфортина, которое может быть выделено и очищено использованием методов, известных для специалистов в данной технике.

Следует отметить, что 24,25 дихлоро-аналог может быть приготовлен замещением брома на хлор в описанном выше способе. Аналоги 24,25 - дибромо 24,25-дигидро-18-маркофортина, описанные выше, используются в качестве промежуточных соединений для получения дополнительных производных. Так, обработка раствора дибромида в спиртовом растворителе, таком, как метанол, этанол, пропанол и тому подобные, сильным основанием, таким как 1,8 диазабицикло [5.4.0] ундек-7-ен (ДВИ)при интервале температур 0 - 30^oC в течение 0,25 - 24 ч дает аналоги 24-алкокси-25 бромо-24, 25 дигидро-18-тиомаркфортина, которые могут быть выделены и очищены использованием методов, известных для специалистов в данной технике. Эти 24 алкокси, 25-бромо производные могут быть дебромированы обработкой раствора соединения в апротонном органическом растворителе, таком, как бензол, толуол, гексан и тому подобные, восстанавливающим агентом на основе гидрида олова, таким, как три-бутил олово гидрид, три-пентил олово гидрид и тому подобные с добавлением или без добавления радикального инициатора, такого как азобис-изобутиронитрил (AIBN) при интервале температур 25 - 120 ^oC в течение 0,5 - 48 ч. Этот способ дает соответствующие производные 24-алкокси-18-тиомаркфортина (R₂₄= низший алкокси в общей структуре), которые могут быть выделены и очищены использованием методов, известных для специалистов в данной технике.

Основные способы получения гетероароматических N - окисей могут быть найдены в Chapter II of "Chemistry of the Heterocyclic N-Dxides" A.R. Kattitzky and T.M.Ladowski, pyblished 1971 Academic Press (Vol.19 of ORGANIC CHEMISTRY - A Series of Monographs).

Обычно N - окись образуется взаимодействием а надкорбоновой кислотой в апротонном растворителе. Наиболее удобно использовать ароматическую надкислоту в неполярном растворителе, поскольку реакция обычно может быть проведена при комнатной температуре. Подходящие ароматические надкислоты включают надбензойную кислоту, хлоронадбензойную кислоту и перефталевую кислоту.

Соединение формулы IV приготавливают алкилированием или ацилированием N-1 маркфортина A и N-18a замещенных маркфортинов B и C. Эти производные легко могут быть приготовлены последовательной обработкой раствора маркфортина A или N-18a замещенных маркфортинов B и C в апротонном органическом растворителе, таком как, тетрагидрофуран, диэтиловый эфир, бензол и тому подобные с избытком сильного основания, такого, как гидрид калия (предпочтительно), гидрид натрия, бутиллития, трет.-бутилат калия, и тому подобных, с последующей обработкой подходящим алкиллирующим или ацилирующим агентом при интервале температур 0-50^oC в течение 0,25 - 48 ч. Подходящие алкилирующие или ацилирующие агенты включают алканоилоксиалкил бромиды, аминосульфенилхлориды, фосфорил хлориды, фосфонил хлориды, ацил ангидриды, ацил хлориды, ацил бромиды, замещенные бензолсульфенил хлориды, карбамоил хлориды, замещенные феноксихлорформиаты и тому подобные. Обработка маркфортина A и N-18a замещенных маркфортинов B и C и C24-C25 модифицированных маркфортинов при этих условиях дает 1-N-замеещнные аналоги, которые могут быть выделены и очищены использованием методов, известных для специалистов в данной технике.

Приготовление исходного материала Парагервамид выделяют из Penicillium Sp. IMI 332995 и/или Penicillium charlessi МГ 5123 (АТСС 20841), используя стандартные ферментативные и разделительные методики. Выделение детально описано в патентах США 4973247 и 4978656, а также EP 390532-A, EP-301742-A и WD91/09961 (все включены здесь в качестве ссылок).

N-18a замещенные маркфортины B и C и C24-C25 мидифицированные маркфортины легко приготавливаются способами, приведенными в [1].

Маркфортины A, B и C выделены, наряду с ранее известным роквефортином, как грибковые метаболиты Anicillinm roguerforti с использованием стандартных ферментативной и разделительной методике. Выделение, равно как и аналитические и структурные характеристики маркфортина A, детально описаны в Polonsky et al Journal of the Chemical Sosiiety Chemical Communisations 1980, 601-602. Выделение, равно как и аналитические и структурные характеристики маркфортинов B и C, описаны детально в Polonsky et al Ketrahedron Letters 1981, 22, 1977-1980.

Альтернативно и более предпочтительно, Маркфортины A и C могут быть выделены из Penicillium sp. ИС 7780 (порядковый номер штамма в Коллекции культур ИС 7780, The Upjohn Company, Kalamazoo, MI). Этот штамм был выделен из образца почвы, отобранного в Illinois, депонированного в США Department of Alricnetnre patent cnltnre collection in Peoria, IL и внесенного в каталог под номером NRRL 18887. Для дальнейшей характеризации грибка было проведено таксономическое исследование согласно методам и материалам, описанным I. John Pitt, The Genus Pinicillium, Acodemic Press, L ondon, (1979). Споры и поверхности гиф были исследованы путем электронной сканирующей микроскопии согласно методам Dietz, A. and Matthews, J. Appl. Microlilogy 18: 694-696 (1969). Интактные конидиофоры наблюдались визуально с помощью световой микроскопии [A.H.S. Onions et al, Smith's Introduction to Industrial Mycology, John Wiley and Sons, New York, pp 301-302 (1979)] после приготовления микроскопического препарата культур(ы): стеклянную чашку Петри, содержащую стеклянные шарики, микроскопический препарат и покровное стекло стерилизуют. Небольшой блок картофельного агара с декстрозой помещают на микроскопический препарат и инокулируют по четырем сторонам грибковой структурой. Покровное стекло помещают на инокулированный блок агара и добавляют стерильной воды для поддержания влажности. Камеру инкубируют в течение шести дней при 24^oC. Микроскопический препарат приготавливают, удаляя покровное стекло и помещая его на каплю лактофеноловой хлопковой синены.

Характеристики штамма Penicillium sp. ИС 7780 (NRRL 18887) следующие.

Морфология - бимутовчатая кисть (две точки ветвления между конидией и ножкой). Эти ветвления (метулы) поддерживают несущие структуры фиалиды и конидии. Конидиофоры (приблизительно 35 мкм) заканчиваются в мутовках 2-5 (10-14 мкм) метул. Фиалиды имели форму колбочек (как древнегреческий сосуд для вина) в мутовках от 2-5 (7 мкм). Конидии были гладкие и сфероидальные (2 мкм), обычно образующие длинный гиностелий. Стенки ножек были гладкие.

Культуру инокулировали на три чашки Петри на дрожжевой агар Чапека (СУА), из которых одна имела 6 см в диаметре, другая содержала агар с солодовым экстрактом (MEA) и агар с 25%-ным нитратом глицерина (G 25 N). Инокуляция была проведена из полутвердой суспензии (0,5 мл 0,2% агара с 0,05% Твин 80). Инокулирующую петлю с конидиями ввели в пробирку и перемешали. Петлю с суспензией инокулировали в образец в три места на каждую чашку. Для введения инокулята в 6 см чашки была использована игла. Использованный инкубационный режим: одна CYA чашка плюс MEA и G 25 N чашка при 24^oC, одна CYA чашка при 37^oC и 6 см CYA чашка при 5^oC. Через семь дней диаметры, цвета и другие характеристики колоний были зарегистрированы и помещены далее в табл. 1. На картофельном декстрозном PDA, Difco) агаре на нижней части или на обратной стороне колонии появляется темно-красный цвет.

Половой стадии не было отмечено. Эти результаты в культуре (NRRL 18887) определяли по Penicillium. Определителю для определения подкультуры. По Penicillium определителю, только пеницилиновый тип определяет подрод, к которому относится вид. Этот вид имеет некоторые характеристики, которые отличают его от Biverticillium подрода. Например, его кисти являются мутовчатыми. Вид надежно производит колонии более чем 10 мм в диаметре за 7 дней на агаре с нитратом глицерина. Метулы оказываются длиннее, чем фиалиды и в мутовках от 2-5. Эти характеристики позволяют отнести этот штамм Penicillium sp. (NRRL 18887) к подроду Furcatum.

Вышеприведенное описание иллюстрирует штамм Penicillium ИС 7780 (NRRL 18887), который может быть использован в производстве Маркфортина и его производных. Кроме того, данное изобретение также включает мутанты описанного выше микроорганизма. Например, те мутанты, которые получены естественной селекцией, или мутанты, полученные мутирующими агентами, включающими ионизирующее облучение, такое, как ультрафиолетовое излучение, или химическими мутагенами, такими, как нитрозогуанидин, или тому подобными обработками, также входят в цель данного изобретения.

Предметом и предназначением данного изобретения является также включение взаимных или внутренних генетических процессов рекомбинации с помощью генетических методик, хорошо известных для специалистов в данной области техники, таких как, например, конъюгация, трансульция (transultion) и методики генной инженерии.

Penicillium sp. ИС 7780 (NRRL 18887) может быть культивирован в аэробных условиях тем методом, который обычно применяется в технике культивации известного штамма рода Penicillium.

В качестве компонентов среды могут быть использованы какие-либо хорошо известные питательные вещества для Penicillium. Например, в качестве ассимилируемого источника углерод, глюкоза, глицерин, мальтоза, декстрин, крахмал, лактоза, сахароза, меласс, соевое масло, хлопкового семени масло и т.д. , предпочтительно глюкоза и глицерин могут быть использованы и в качестве ассимилируемого источника азота, соевая мука, арахисовая мука, хлопкового семени мука, рыбная мука, жидкая кукурузная пропитка, пептон, рис, отруби, мясной экстракт, дрожжи, дрожжевой экстракт, нитрат натрия, нитрат аммония, сульфат аммония и т.д. могут быть использованы. И такие неорганические соли, как хлористый натрий, фосфаты натрия, карбонат кальция и т.д. могут быть добавлены к среде для культур. При необходимости могут также быть добавлены незначительные количества соли металла. Кроме того, незначительные количества тяжелых металлов могут быть добавлены при необходимости.

В частности, в культивации Penicillium sp. (NRRL 19997) в аэробных условиях с успехом могут быть использованы обычные методы аэробной культивации, такие как, например, выращивание на сухом остатке, выращивание при аэрации и перемешивании (взбалтывании), выращивание при встряхивании и т.д. К ферментативной среде должны быть добавлены следы металлов, например цинк, магний, марганец, кобальт, железо и тому подобные, поскольку должен поддерживаться уровень реверс-осмоса воды.

В проведении культивации при аэрации и взбалтывании могут быть успешно применены противопенные агенты, например силиконовое масло, растительные масла, ПАВ и т.д.

pH среды обычно может быть в интервале pH 3-9 и предпочтительно в нейтральной области или около нее, и температуры культивации обычно могут быть 20-30^oC, в частности предпочтительны около 21^oC.

Культивация может продолжаться до тех пор, пока Маркфортин A будет значительно аккумулироваться в среде для культуры, обычно от 20 до 240 ч, предпочтительно 48 - 168 ч, и после культивации Маркфортин A может быть изолирован и выделен из жидкой среды для культур (культуральный бульон) путем подходящей комбинации различных методов. Например, это может быть экстракция органическим растворителем, например диэтиловым эфиром, этил ацетатом или хлороформом; растворение в более полярном растворителе, например, ацетоне или спирте; удаление примесей менее растворителем, например петролейным эфиром или гексаном, абсорбционная хроматография на активированном углероде или силикагеле; гель фильтрация через колонку "сефадекса" (поставляемого Pharmacia Co., Ltd США) и тому подобное.

Маркфортин B может быть приготовлен из Маркфортина A путем биотрансформации использованием микроорганизма в водой питательной среде, содержащей ассимилируемый источник азота при аэробных условиях.

Данное изобретение также дает биологически чистые культуры (организмы, полученные из коллекции культур, как очевидно открытые организмы) рода Cunnirghamella характеризуемые как виды, выделенные из группы, состоящей из NRRL 1368, 1393 или 3655 и ATCC 8688 a. Метод использования членов рода Cunnirghamella, характеризуемых как виды, выделенные из группы, состоящей из NRRK 1368, 1393 или 3655 и ATCC 8688а, для получения Маркфортина B, который включает присоединение Макрфортина A к метаболизируемым культурам названных микроорганизмов.

Путем "биотрансформации" означает использование микроорганизмов или выделение частично очищенных энзимов для превращения данного субстрата в полезный продукт. Н.С. Davies, et al, "Biotransformations in Dreparative Organic Chemistrg", Akademic Press, N.Y., 1989, p.IX.

Путем "метаболизации" означает проведение процессов метаболизма. Определение метаболизма может быть найдено в A.L.Lehninger, "Principlles of Biochemistry", Worth Pnbl., New York, 1982, p.333.

Путем использования нового метода данного изобретения Маркфортин B получают добавлением Маркфортина A к растущим культурам названных организмов. Род Cunnirghamella является предпочтительным для выполнения этого превращения, включая Cunnirghamella echinulata sublp. elegans (-) NRRL 13b8, Cunninghamella blakesleeana (+) ATTC 8b88a Cunnirghamella echinufata subsp. elegans NRRL 1393, Cunnirghamella echinulata NRRL 3655; в частности штамм NRRL 3655 является предпочтительным.

Подкультура Cunnirghamella echinulata subsp. elegans (-) была взята на депозит Budapest Treaty in the permanent collection of the Northem Region Research Center, ARS; U.S. Dept of Agriculture; Peoria, Illinois, USA.

Ей присвоили номер NRRL 1368. Подкультура Cunninghamella echinulata subsp. elegans (-) была также взята на депозит of the Budapest Treaty in the permanent collection of the American Tupe Culture Collection, Rockville, MD, США.

Ей присвоен номер ATCC 8688b.

Подкультура Cunnirghamella blakesleeana (+) взята на депозит of Budapest Treaty in the permanent collection of the American Tupe Culture Collection, Rockville, MD, USA.

Ей присвоен номер ATCC 8688a.

Подкультура Cunnirghamella echinulata subsp. elegans (-) взята на депозит of the Budapest Treaty in the permanent collection of the Northem Region Research Center, ARS; U.S. Dept of Agriculture; Peoria, Illinois, США.

Ее порядковый номер NRRL 1393. Подкультура Cunnirghamella echinulata subsp. elegans (-) взята на депозит of the Budapest Treaty in the permanent collection of the American Tupe Culture Collection, Rockville, MD, USA.

Ей присвоен порядковый номер ATCC 10028b.

Подкультура Cunnirghamella echinulata была взята на депозит of the Budapest Treaty in the permanent collection of the Nocthern Region Research Center, ARS; U.S. Dept of Agriculture; Peoria, Illinois, USA.

Ей присвоен номер NRRL 3655.

Использование этих микроорганизмов в способе данного изобретения выражается в получении Маркфортина B из Маркфортина A.

Маркфортин B получается, когда Cunnirghamella echinulata subsp. elegans (-) NRRL 13b8, Cunnirghamella blakeslleana (+) ATTC 8b88a Cunnirghamella echinulata subsp. elegans NRRL 1393, Cunnirghamella echinulata NRRL 3b55 ферментируется в водной питательной среде при условиях аэробного погружения в присутствии Маркфортина A. Типично микроорганизм ферментируется в питательной среде, содержащей источник углерода и белковый материал. Предпочтительные источники углерода включают глюкозу, жженный сахар, сахарозу, глицерин, крахмал, кукурузный крахмал, лактозу, декстрин, мелассу и тому подобные. Предпочтительные источники азота включают хлопковую муку (мука из хлопкового семени), жидкую кукурузную пропитку, дрожжи, автолизированные пивные дрожжи с сухим веществом молока, соевую муку, кукурузную муку, сухое вещество молока, казеин переваренный панкреатическим ферментом, вытяжки пептонные животного происхождения, вытяжки из мяса и костей и тому подобные. Преимущественно могут быть использованы комбинации этих источников углерода и азота. Нет необходимости добавлять следы металлов, например, цинка, магния, марганца, кобальта, железа и тому подобных, поскольку в качестве компонентов среды используется вода из-под крана и неочищенные ингредиенты.

Производство Маркфортина B может быть индуцировано при некоторой температуре, способствующей удовлетворительному росту микроорганизма приблизительно между 23 и 32^oC и предпочтительно примерно при 28^oC.

Обычно оптимальное образование Маркфортина B происходит приблизительно в период 1 до 4 дней после добавления Маркфортина A к растущей культуре и предпочтительно за период около 2 дней. Ферментативный бульон обычно остается от слабо кислого до основного (pH 5,8-9,0) во время ферментации. Конечное pH зависит отчасти от наличия буфера, если присутствует и отчасти от начальной pH среды для культур. Выгодно регулировать pH около 6,5-7,5 и предпочтительно 7,2 перед стерилизацией.

Когда рост проводится во встряхиваемой колбе или большом сосуде и сборниках, предпочтительно использовать вегетативную форму микроорганизма для инокуляции, вместо того, чтобы использовать форму спор, чтобы избежать явно выраженной задержки в продуцировании Маркфортина B и сопутствующего неэффективного использования оборудования. Таким образом, желательно получать вегетативный инокулят в водной питательной среде путем инокулирования этой среды аликвотной пробой почвы или культуры на скошенном агаре. Когда молодой, активный вегетативный посевной материал таким образом выделен, его переносят асептически в другие встряхиваемые пробирки или сборники. Среда, в которой вегетативный инокулят получают, может быть той же самой или отличной от той, что использована для получения Маркфортина B, длительность процесса адекватна росту получаемого микроорганизма.

Могут быть использованы различные способы выделения и очистки Маркфортина A из ферментативного бульона, например путем метода абсорбционной хроматографии с последующей элюацией подходящим растворителем, колоночной хроматографии, распределительной хроматографии и кристаллизацией из растворителей, а также комбинацией этих методов.

Предпочтительным способом выделения Маркфортина B является экстракция из (необработанного) цельного пива. Методы колоночной хроматографии, предпочтительно на силикагеле, используются для осуществления начальной очистки. Конечная очистка Маркфортина B достигается хроматографией и кристаллизацией из органических растворителей.

Метод A далее иллюстрирует способ биотрансформации изобретения.

Указанные соединения данного изобретения неожиданно оказались сильно действующими антипаразитарными агентами против эндо и экто паразитов, в частности гельминтов (паразитических червей) и членистоногих, которые приводят к многочисленным болезням вызванным паразитами у человека, животных и растений.

Болезни, вызываемые паразитами, могут обуславливаться как эндопаразитами, так и эктопаразитами. Эндопаразиты - это такие паразиты, которые живут внутри тела хозяина, либо внутри органа (такого, как желудок, легкое, сердце, кишечник и т.д.) либо просто под кожей. Эктопаразиты это такие паразиты, которые живут на наружной поверхности хозяина, но все же вытягивают питательные вещества из хозяина.

Болезни, вызванные эндопаразитами, обычно называемые гельминтозами, являются следствием заражения хозяина паразитическими червями, известными как гельминты. Гельминтозы представляют широко распространенную и серьезную мировую экономическую проблему, связанную с инфекцией домашних животных, таких, как свиньи, лошади, овцы, крупный рогатый скот, козы, собаки, кошки и домашняя птица. Многие из этих инфекций вызываются группой червей, называемых нематодами, которые вызывают заболевания различных органов у животных во всем мире. Эти заболевания часто серьезны и могут привести к смерти инфицированного животного. Наиболее общие роды нематод, инфицирующие упомянутых выше животных, включают Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Tokascaris, and Parascaris.

Многие паразиты являются видоспецифичными (инфицируют только одного хозяина) и большинство также имеет предпочтительный участок инфицирования животных. Так, Haemonchus и Ostertagia преимущественно инфицируют желудок, тогда как Nematodirus и Cooperia в основном атакуют кишечник. Другие паразиты предпочитают задерживаться в сердце, глазах, легких, кровеносных сосудах и тому подобном, тогда как иные неподвижные являются подкожными паразитами. Гельминтозы могут приводить к слабости, потере в весе, анемии, повреждения кишечника, недостатку питания и повреждению других органов. Если это заболевание оставить без лечения, оно может привести к смерти животного.

Инфекция, вызванная эктопаразитическими членистоногими, такими как клещи, клещики, вши, осенние жигалки, жигалки коровьи малые, падальные мухи, блохи и т.п. является также серьезной проблемой. Инфицирование этими паразитами выражается в потере крови, кожных повреждениях, может помешать нормальному усвоению пищи и привести к потере веса. Эти заражения могут также привести к развитию серьезных заболеваний, таких как энцефалиты, анаплазмозам, оспа у свиней и т.п., которые могут привести к фатальному исходу.

Животные могут быть инфицированы несколькими видами паразитов одновременно, поскольку заражение одним паразитом может ослабить животное и сделать его более восприимчивым к инфицированию вторым видом паразитов. Таким образом соединение с широким спектром активности имеет преимущества при лечении таких заболеваний. Соединения данного изобретения имеют неожиданно высокую активность против этих паразитов и в дополнение являются также активными против Dirofilaria у собак, Nematospiroides и Suphacia у грызунов, жалящих насекомых и мигрирующих личино двукрылых, таких как Hypodorma sp. у крупного рогатого скота и Gastrophilus у лошадей.

Данные соединения также полезны против эндо и экто паразитов, которые приводят к заболеваниям, вызванным паразитами у человека. Примеры таких эндопаразитов, которые инфицируют человека, включают гастро энтеральных паразитов рода Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius и т.п. Другие эндопаразиты, которые инфицируют человека, находятся в крови и других органах. Примерами таких паразитов являются ниточные черви Wucheria, Brugia, Onchocerca и тому подобные, также как внекишечные фазы кишечных червей Strongylides и Trichinella. Это паразиты, которые паразитируют на человеке, включают членистоногих, таких, как клещи, блохи, клещики, вши и тому подобные и как с домашними животными, инфицирование этими паразитами может выражаться в развитии серьезных и даже фатальных болезней. Настоящие соединения являются активными против этих эндо и экто паразитов и, кроме того, также активны против жалящих насекомых и других двукрылых паразитов, которые надоедают человеку. Текущие соединения, когда применяются орально или парентерально, назначаются в дозах в пределах приблизительно 0,05 - 20 мг/кг веса тела животного. Данные соединения также полезны против находящихся в помещении вредителей, таких, как Blatella sp (тараканы), Tineola sp (платяная моль), Attagenus sp. (кожееды), Musca domestira (комнатная муха) и против Solenopsis Invicta (муравей Рихтера).

Кроме того, соединения полезны против сельскохозяйственных вредителей, таких, как тля (Acyrthiosiphon sp.), саранча и хлопковый долгоносик, а также против вредных насекомых, разъедающих зерна при хранении, таких, как Tribolium sp. , и против насекомых на незавершенных стадиях развития, живущих в растительной ткани. Соединения также полезны в качестве нематоцида для контроля нематод в почве, который может иметь важное значение для сельского хозяйства. При использовании в качестве противопаразитных агентов для животных соединения данного изобретения могут быть назначены внутренне либо орально, либо путем инъекций, либо локально в виде жидкого орошения или в качестве шампуня.

Для орального применения соединения могут быть назначены в форме капсулы, таблетки, шариков для вливания лекарства или иначе, они могут быть смешаны с едой для животных. Капсулы, таблетки и шарики содержат активный ингредиент в комбинации с соответствующим связующим носителем, таким, как крахмал, тальк, стеарат магния, или дикальций фосфат. Эти единичные дозировочные формы приготавливают путем тесного смешения активных ингредиентов с подходящими растворители, наполнители, дезинтеррирующих агентов, суспендирующих агентов и/или связующих веществ, так, чтобы получались однородные растворы или суспензии. Инертные ингредиенты это такие, которые не будут взаимодействовать с настоящими соединениями и которые не токсичны для животных, подлежащих лечению. Подходящие инертные ингредиенты включают крахмал, лактозу, тальк, стеарат магния, растительные смолы и масла и тому подобные. Эти составы могут содержать широкое количество разнообразных активных и неактивных ингредиентов, зависящих от многочисленных факторов, таких, как размер и тип вида животного и типа и серьезности инфекции. Активные ингредиенты могут также назначаться в виде добавок к пище путем простого смешивания соединения с кормом или нанесением соединения на поверхность корма. Иначе активный ингредиент может быть смешан с инертным носителем и образовавшаяся композиция может быть затем или смешана с кормом или непосредственно скормлена животному. Подходящие инертные носители включают кукурузную муку, цитрусовую муку, ферментативные остатки, соевую муку грубого помола, сухие крупы и т.п. Активные ингредиенты тесно перемешиваются с этими инертными носителями путем размалывания, взбалтывания, дробления или галтования, так что конечная композиция содержит 0,001-5,0 мас.% активного ингредиента.

Иначе соединения могут быть назначены парантерально через инъекции состава, содержащего активный ингредиент, растворенный в инертном жидком носителе. Инъекция может осуществляться внутримышечно, интраруминально, внутритрахеально или подкожно. Составы для инъекций содержат активный ингредиент, смешанный с соответствующим инертным жидким носителем. Приемлемые жидкие носители включают растительные масла, таки, как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло и тому подобные, а также органические растворители, такие, как солкеталь, глицерол формал и тому подобные. В качестве альтернативы могут также использоваться водные парентеральные составы. Растительные масла являются растворением или суспендирован