Конъюгаты антрациклина, способ их получения и применения

Конъюгаты антрациклина, способ их получения и применения

Реферат

 

Использование: в медицине, а именно в терапии. Сущность изобретения: конъюгат представляет собой соединение формулы (1) [A-O-W-Z]_a - T, в которой часть A-O представляет собой остаток любого антрациклина формулы A-O-H, несущего, по крайней мере, одну первичную или вторичную гидроксильную группу; а - обозначает целое число от 1 до 30; N - остаток формулы (2) в которой B обозначает C₁ - C₆ алкиленовую группу, возможно разорванную, m равно 0 или 1; Z обозначает спейсерную группу, а T - часть носителя. Предложенные конъюгаты могут найти применение в качестве противоопухолевых средств. 12 с. и 13 з.п.ф-лы, 2 табл., 5 ил.

Изобретение относится к конъюгатам терапевтически применяемых антрациклинов с такими носителями, как поликлональные и моноклональные антитела или белки или пептиды естественного или синтетического происхождения; к способам их получения, к содержащему их фармацевтическому составу и к их применению при лечении определенных опухолей у млекопитающих. Изобретение также относится к новым производным антрациклина и к их получению.

В последние годы было синтезировано много высокоцитотоксичных антрациклинов. Например, такие, которые несут морфолино или морфолино-замещенное кольцо, связанное в положении C-3' сахарной части, продемонстрировали многообещающую противоопухолевую активность на экспериментальных опухолях мышей или крыс (см. Bioactive molecules, 55 - 101, vol. 6, Edited by J. Wikkiam Zown, Elveiser 1988).

Сущность настоящего изобретения заключается в создании конъюгатов антрациклина с носителями, такими как моноклональные или поликлональные антитела или белки или пептиды, или с другими носителями синтетического происхождения с целью извлечения преимущества из высокой эффективности антрациклинов, например, морфолино-производных, для улучшения их терапевтической эффективности и снижения их токсичности.

Конъюгаты согласно настоящему изобретению, характеризующиеся наличием чувствительной к кислоте ацеталевой связи, имеют общую формулу (I) (A-O-W-Z-)_a-T в которой часть A-O - обозначает остаток любого антрациклина формулы A-O-H, содержащего по крайней мере одну первичную или вторичную гидроксильную группу; а обозначает целое число от 1 до 30; W обозначает остаток формулы (2): в которой B обозначает C₁-C₆ алкиленовую. группу, возможно гетеропрерванную, а m обозначает 0 или 1; C₁-C₆ алкиленовая группу может представлять собой C₁-C₆ алкиленовую группу, такую как этилен метилен, этилиден или н-пропилен. Гетероатом, прерывающий алкиленовую группу, может представлять собой кислород или азот. Предпочтительно B обозначает -CH₂-O-CH₂-, -CH₂-NH-CH₂-, -CH₂-, -C₃H₆- или -C₆H₁₂-; Z обозначает спейсерную группу, а T - носитель.

Предпочтительными группами Z являются: I) -NH-, а T-Z обозначает остаток носителя формулы T-H₂, несущий по крайней мере одну свободную аминогруппу, или II) -NH-(D)_d-N= CH-, где d обозначает целое число от 0 до 2, (D) обозначает -NH-CO(CH₂)_nCO-NH- ( n равно 2 или 4), а T-Z содержит остаток носителя формулы T-CHO, несущего по крайней мере одну формильную группу.

III) пиперазинилкарбонильная часть или группа формулы -NH-(D)_a-NH-CO-, где (D) и a имеют вышеуказанные значения, а T-Z содержит остаток носителя формулы T-/COOH/_a, в которой a имеет вышеуказанные значения.

В вышеприведенной формуле (1) гликозид антрациклина A-O-H предпочтительно является производным от соединений формулы (3): в которой: R₁ обозначает атом водорода, окси- или метокси-группу; а) R₂ обозначает оксигруппу, а R₄ или R₅ обозначают атом водорода, а другое из R₄ и R₅ обозначает оксигруппу, или R₄ обозначает атом йода и R₅ обозначает атом водорода, или оба и R₄ и R₅ обозначают атомы водорода или б) R₂ обозначает атом водорода и R₄ или R₅ обозначает оксигруппу и другое из R₄ и R₅ обозначает атом водорода; и R₃ обозначает аминогруппу или обозначает атом азота, заключенный в кольцо морфолино (MO) или 3-циано-4-морфолино (CM) или 2-метокси-4-морфолино (MM), в котором атом азота связан в C-3' Антрациклин может быть связан с носителем через гидроксильную группу в положении C-14 или C-4' соединения антрациклина. В одном варианте осуществления носитель, связанный с антрациклином в положении C-14, формула (3'), обозначает часть A-O-: в которой R₁ и R₂ имеют вышеуказанные значения, а R₄ или R₅ обозначает оксигруппу, или R₄ обозначает атом водорода или йода, а R₅ обозначает атом водорода.

В другом варианте осуществления носитель, связанный с антрациклином через оксигруппу в C-4', формула (3''), обозначает часть A-O-: в которой R₁ и R₃ имеют вышеуказанные значения.

Носитель обычно выбирают из поликлонального антитела или его фрагмента, содержащего антигенсвязывающий центр, способный связываться с опухолеспецифическим антигеном; моноклонального антитела или его фрагмента, содержащего антигенсвязывающий центр, способный связываться с антигеном, предпочтительно или селективно экспрессируемого на популяциях опухолевых клеток; пептида или белка, способного предпочтительно или селективно связываться с опухолевой клеткой; и полимерного носителя.

Часть носителя T-NH₂ или T-/COOH/_a конъюгатов таким образом предпочтительно производят из поликлональных антител, направленных против опухолеспецифических антигенов; или из моноклональных антител, связывающихся с антигенами, предпочтительно или селективно экспрессируемых на популяциях опухолевых клеток; или из природных или рекомбинантных пептидов или белков или факторов роста, предпочтительно или селективно связываемых с опухолевыми клетками; или из природных или синтетических полимерных носителей, таких как полилизин, полиглутамовая кислота, полиаспарагиновая кислота и их аналоги и производные, или таких как текстран или другие полимерные углеводные аналоги и их производные; или из синтетических сополимеров, таких как производные из N-(2-оксипропил)метакриламида (ОПМА) (см. S. Kopecek, Macromole cules. H. Benoit and P. Rempp., Ed.: 505 - 520 (1982). Pergamon Press. Oxford, England; или из поли(аминокислотных)сополимеров, таких как поли(GluNa, Ala, Tyr), которые полезны в качестве конъюгируемых носителей лекарственного препарата, обеспечивающих направленную доставку препарата к легочной ткани (P. Lcencan et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers, Vol, 4, июль 1989 г.).

Часть носителя также может быть произведена из частей вышеупомянутых носителей, таких как Fab или F(alo')₂ фрагментов антител, или таких как части вышеупомянутых пептидов или белков, полученных с помощью технологии рекомбинантной ДНК.

Представительными примерами вышеупомянутых антител и соответствующих возможных терапевтических применений являются: анти T-клеточное антитело T101 (Rayston, I. et al., J. Immunal 1980, 125, 725), анти CD5 антитело OKTI (Орто) ATCC CRL 8000 (хронические лимфолейкозы); антитело OKT9 против трансферринового рецептора (Орто) ATCC CRL 8021 (овариальные и другие опухоли); антимеланомное антитело MAb 9.2.27 (Bumol, T.F. et al., Proc. Nat.i. Acad. Sci. USA 1982, 79, 1245 (меланомы); антитело противораковых маркеров, такое как: против карциннэмбрионального антигена 1116 NS-3d AR CC CRL 8019; против альфа-фетопротеина OM 3-1.1 ATCC HB 134 (также гепатомы); 791T/36/Emoleton, M.S. et al., Br.S. Cancer 1981, 43, 582/ (также остеогенная саркома); B 72.3 (патент США N 4.522.918 (1985)) (колоректальные карционмы и другие опухоли); антитело против оварительного рака OVB 3 ATCC HB 9147; антитело против рака груди (HMGF-антиген) (Aboud-Pira E. et al., Cancer ReS. 1988, 48, 3188); против рака мочевого пузыря I 3.10 (Jn.D.S.et al., Eur. S. Urol. 1987, 13, 198).

Иллюстративными примерами вышеуказанных факторов роста и белков природного или рекомбинантного происхождения являются FGF, EGF, PDGE, TGF-, -MS, Интерлейкины, интерфероны, TNF меланотропин (MH) и т.д.

Носитель T-CHO предпочтительно является производным из поликлональных или моноклональных антител, имеющих углеводную часть, предпочтительно размещенную в области Fc, селективно окисленную в альдегидные группы с помощью химических или ферментных методов описано в патенте США N 4671958 (9 июня 1987 г. ). Носитель T-CHO также может быть произведен в результате формилирования или окисления подходящих полимерных носителей, или в результате окисления до альдегидных групп углеводных остатков подходящих гликопротеинов.

Изобретение далее обеспечивает создание способа получения соединения формулы (1), который включает: а) превращение производного формулы 4: A¹-O-W-OH, в которой A¹-O- представляет собой остаток любого антрациклина, несущего по крайней мере одну первичную или вторичную гидроксильную группу и имеющего аминогруппу относящейся к сахару части, которая защищена или заменена производным морфолино, а имеет вышеуказанные значения, в активированное производное формулы 5: A¹-O-W-L, в которой A¹-O и W имеют те же самые значения, что и вышеуказанные, а L обозначает активирующую группу для получения амидной связи, такую как N-оксисукцинамидо, N-оксисульфосукцинамидо или 2,4-динитрофенокси, или 2,3,4,5,6-пентафторфенокси или трет-бутокси карбонилокси; и б) (I) конденсирование полученных соединений формулы (5), как определено выше, с помощью соединения формулы T-NH₂, как указано ранее; или (II) введение в реакцию активированного соединения формулы (5) с производным формулы H₂-(D)_d-NH₂, таким как гидразин (d = 0) или сукциновый (d = 1 и n = 2) или адипиновый (d = 1 и n = 4) дигидразид, возможно со снятием защиты полученного производного формулы (6): A¹-O-W-NH-(D)_d-NH₂, в которой A¹-O-, W, d и (D) имеют вышеуказанные значения, и его конденсирование с помощью соединения формулы T-CHO или T-/COOH/_a как определено ранее, или (III) введение в реакцию соединения формулы (5) с 1,4-пиперазином и конденсирование полученного соединения формулы (7): в которой A¹-O и W имеют вышеуказанные значения, с соединением формулы T/COOH/_a, как определено выше, возможно в присутствии конденсирующего агента, для получения конъюгата формулы (1), в которой непрореагировавшие, возможно присутствующие активированные карбоксильные группы могут быть подавлены с помощью фармацевтически приемлемого амина.

Например, методом активирования для превращения производных формулы (4) и производные N-оксисукцинимидила формулы (5) на стадии (А) настоящего процесса является реакция производного формулы 4 с N-оксисукционимидом или с его водорастворимой солью 3-замещенного сульфоната натрия в присутствии N, N'-дициклогексилкарбодиимида в таком растворителе, как этилацетат или N,N-диметилформамид. В таком случае в формуле (5) - L обозначает остаток: в которой R_a обозначает атом водорода или группу сульфата натрия.

Методы конденсации для получения конъюгатов формулы (1), начиная от вышеупомянутых производных формулы (5) и носителя формула T-NH₂ осуществляются в условиях, способных создать ковалентные связи амидного типа, совместимые со структурой носителя. Предпочтительные условия заключают в себе применение буферированных водных растворов с pH 7 - 9,5, температурой 4 - 37^oC, в течение времени от нескольких часов до нескольких дней.

Например, условия для конденсации (б) (I) между соединениями формулы (5) и антителами T-NH₂ таковы: водный фосфат натрия 0,1М и водный хлорид натрия 0,1М при pH 8, содержащий моноклональное антитело с концентрацией 1 мг/мл, обработанный 30-кратным молярным избытком 10%-ного (вес/объем) раствора вещества 6 в N,N-диметилформамиде, в течение 24 ч при 20^oC. Конъюгат очищают гельфильтрацией на колонке Sephadex G-25 (Pharmacia Fine Chemical, Piscataway, Нью-Джерси), элюируют соляным раствором с фосфатным буфером (PBS).

Способы получения коньюгатов формулы (1),конденсации вышеупомянутых производных 6 с носителем формулы T-CHO осуществляется в условиях, способных создавать ковалентные связи типа гидразона, совместимые со структурой носителя. Предпочтительные условия включают применение буферированных водных растворов при pH 4-7,5, температуре 4-37^oC, в течение времени от нескольких часов до нескольких дней.

Условия для связи (б) (II)между соединениями формулы (6) и антителами T-CHO таковы: водный ацетат натрия 0,1M и водный хлорид натрия 0,1M при pH 6, содержащий моноклональное антитело при концентрации 1 мг/мл, обрабатывали 30-кратным молярным избытком раствора 5 вес.%, объем веществом формулы (8) в том же самом буфере с раствором 50% (вес/объем) вещества 8 в том же самом буфере, в течение 24 ч при 20^oC. Коньюгат очищают гель-фильтрацией согласно вышеизложенному.

Способ получения коньюгата формулы (1) путем конденсирования вышеуказанных производных 6 или 7 носителя формулы T(COOH)_a осуществляется в условиях, способных образовывать ковалентные связи амидного типа, совместимые со структурой носителя.

Предпочтительные условия влекут за собой применение буферсодержащих водных растворов при pH 7-9,5, температуре 4-37^oC в течение от нескольких часов до нескольких дней. Другие условия включают в себя применение сухого диметилформамида или диметилсульфоксида при комнатной температуре в течение 1-3 ч. Предпочтительное условие для конденсации между соединениями формулы 6 или 7 и активированным носителем формулы T(CO-E)_a, в которой E обозначает подходящую активирующую карбонильную группу, такую как n-нитрофенил, - это сухой полярный растворитель, такой как диметилформамид, содержащий от 5 до 50 мг/мл соединения 6 или 7, обработанного с помощью эквивалентного количества соединения T/CO-E/_a в течение 24 ч при комнатной температуре.

В данном случае период "от нескольких часов до нескольких дней" может составлять от 4 ч до 5 дней.

Производные общей формулы 4,5,6 и 7 и их получение являются новыми и находятся в рамках настоящего изобретения. Соединения 4,5,6 и 7 являются как полезными промежуточными соединениями, так и/или терапевтически активными противоопухолевыми агентами. Производные формулы (4) получают с помощью способа, который включает в себя: а) конденсирование возможно защищенного антрациклина формулы A-O-H, как определено выше, при условии, что аминогруппа сахарной части антрациклина A-O-H представлена в форме защищенной аминогруппы, с дигидропиран-карбоксильным производным формулы 8: в которой B и W имеют вышеуказанные значения, а R_x обозначает защитную группу.

б) удаление всех или каждой из защитных групп из полученных промежуточных соединений, с тем, чтобы образовать производное формулы (4): A-O-W-OH в которой W имеет вышеуказанные значения, при условии, что аминогруппа из сахарной части антрациклинового остатка A-O-представляется в форме свободной аминогруппы; и (1) превращение свободной аминогруппы сахарной части антрациклина формулы 4' в морфолино-производное или (II) защита указанной свободной аминогруппы указанного антрациклины формулы 4'.

Промежуточное производное формулы 4' и его получение также обладают новизной и образуют часть настоящего изобретения. Производные являются как полезными промежуточными соединениями, так и или терапевтически активные противоопухолевые вещества. Преобразование антрациклинов общей формулы (4), как они охарактеризованы ранее, может быть осуществлено обработкой соединением формулы (8), определенной выше.

Изобретение также обеспечивает создание способа для получения производных формулы 4', причем он включает: а) конденсирование возможно защищенного антрациклина вышеуказанной формулы A-OH при условии, что аминогруппа сахарной части антрациклина A-O-H находится в виде защищенной аминогруппы, с дигидропиранкарбоксильным производным формулы (8), как описано выше; и б) удаление всей или каждой защитной группы из полученного промежуточного соединения.

Предпочтительные условия для осуществления реакции типично защищенных антрациклинов A-O-H с соединением 8 влечет за собой применение сульфокислоты, такой как n-толуолсульфокислота в качестве катализатора, в безводном амолярном растворителе, таком как хлористый метилен, при комнатной температуре в течение времени от нескольких часов до одного дня, с последующей обработкой слабой щелочью для деблокирования защитных групп.

Производные 8 представляют собой смесь анантиомеров. Однако реакция этерификации с гидроксильной группой антрациклинов, проводимая с кислотным катализатором, дает только два диастереоизомера, обозначаемые как x и y, имеющие неопределенную пространственную конфигурацию кольца (R или S) как в положении ацетали C-2", так и в другом положении, несущем группу -(B)_m-C(O)ORx.

Полученное соединение формулы A-O-W-OP x преобразуют в соединение формулы (4), как определено выше, гидролизом и снятием защиты. Некоторые из исходных соединений формулы 8 являются новыми находятся в рамках настоящего изобретения.

Предпочтительные производные формулы 8 включают: 8A) 2-этоксикарбонил-3,4-дигидро-2H-пиран /m=0, R_x = C₂H₅/, 8B) этил 2-(3,4-дигидро-2H-пиран-2-ил)метилоксиацетат /B=CH₂-O-CH₂, m=1, R^x=C₂H₅/; 8C) метил 2-(3,4-дигидро-2H-пиран-2-ил)метилоксиацетат /B=CH₂-O-CH₂, m= 1, R_x=CH₃/; 8D) этил 2-(3,4-дигидро-2H-пиран-2-ил)метилтиоацетат /B=CH₂-NH-CH₂, m=1, R_x=C₂H₅/.

8Е) этил 2-(3,4-дигидро-2Н-пиран-2-ил)метиламиноацетат /В=СН₂-NH-CH₂, m= 1, R_x=C₂H₅/.

Соединения общей формулы 8 могут быть получены несколькими путями. Например, они могут быть получены легко из имеющейся 3,4-дигидро-2H-пиран-2-карбоновой кислоты, соли натрия (CA S 16698-52-5) формулы H или из соответствующего производного метанола (CAS 3749-36-8) формулы M: Более конкретно, соединение 8A получают путем введения в реакцию соединения H с иодистым этилом в безводном полярном растворителе, таком как диметилформамид, как описано в "Macromo-Iecules", т.12, 1, с.5-9, январь-февраль 1979 г. Метилоксиацетат 8B может быть получен путем введения в реакцию спирта M с соляной кислотой в сухом диметилформамиде при 100^oC в присутствии двух эквивалентов гидроокиси натрия или калия, после этого охлаждением смеси и ее обработкой иодистым этилом.

Соединения формулы 8C-E могут быть получены методом конденсации Вюрца йодо-производного M, полученные путем замещения сложного эфира сульфокислоты M иодистым натрием, и этил 3-иодопропионата, этил 4-иодобутаноата или этил 7-иодогептаноата. Метиламиноацетат 8Г получают кипячением с обратным холодильником сложного эфира сульфокислоты спирта M с этилглицином в сухом толуоле в течение 6 ч.

Исходные антрациклины формулы (3) для использования в настоящем изобретении включают те, которые несут свободную гидроксильную группу, в положении C-4' или C-14, также как: даунорубицин (3a: R₁=OCH₃, R₂=R₅=H, R₃=H₂, R₄=OH), 4-деметоксидаунорубицин (3b: R₁=R₂=R₅=H, R₃=NH₂, R₄=OH); 4'-эпидаунорубицин (3c: R₁=OCH₃, R₂=R₄=H, R₃=NH₂, R₅=OH); 4'-дезоксидоксорубицин (3d: R₁=OCH₃, R₂=OH, R₄=R₅H, R₃=NH₂); 4'-дезокси-4'-иододоксорубицин (3e: R₁=OCH₃, R₂=OH, R₅=H, R₄=S, R₃=NH₂), и те, которые как первичные, так и вторичные оксигруппы, также как доксорубицин (3f: R₁=OCH₃, R₂=R₄=OH, R₅=H, R₃=NH₂), 4'-эпидоксорубицин (3g: R₁=OCH₃, R₂=R₅=OH, R₄=H, R₃=NH₂), они при этом описаны в предшествующих патентах, см.: F. Arcamone "DOXORUNICIN", Medicinal Chenistry Vol17, New York. Y., 1981.

Например, антрациклины, первоначально несущие гидроксильную группу, в частности, такие, которые обозначены соединениями 3a-e преобразуют в их N-трифторацетиловые аналоги, которые затем вводят в реакцию с производными сложного эфира дигидропиранкарбоновой кислоты общей формулы (8), как описано ранее, для получения соединений 4(a-e) (A-Z), в которых (a-e) обозначают остаток антрациклинов формулы 3''(a-e) и 3'(d), (A-Z) обозначает остаток общей формулы 2, полученный в результате конденсации соединения формулы (8) с гидроксильной группой в положении C-4' или C-14 антрациклина.

Антрациклины, несущие обе гидроксильные группы в положениях C-4' и C-14, в частности те, которые представлены соединениями 3(f, g), могут быть селективно сконденсированы на гидроксильной группе C-14 с соединениями формулы (8), после временной защиты другой гидроксильной группы в положении C-4', для получения производных общей формулы 4 и 4', обозначенные как 4(f, g)(A-Z) и 4'(f, g)(A-Z), в которых (f, g) обозначает остаток антрациклина формулы 3'(f, g) (пиранилирование в C-14) или 3''(f, g) (пиранилирование в C-4') и (A-Z) имеют то же самое значение, что и указанного выше.

Производные 4 и 4', как изложено выше, в которых остаток -O-W связан в C-14-положении гидроксильной группы, получают путем введения в реакцию соединения формулы (8), а тех же самых условиях, что и описаны ранее, с производными антрациклина, несущим замещенную гидроксильную группу в C-4', общей формулы (9): в которой R₁ имеет вышеуказанное значение, R₄ или R₅ обозначает ацетокси-группу, а другое из R₄ и R₅ обозначает атом водорода.

Например, N-трифторацетиловые производные общей формулы 3 (R₃=NHCOCF₃), такие как 3(f, g), вначале защищают в положениях C-9 и C-14 в виде 9, 14-этилортоформата после реакции с триэтилортоформиат, согласно процедуре, описанной H. Umezawa et al., J. Antib. Vol XXXIII, N 12, 1581 (1980), затем ацилируют на фенольных и C-4'-гидроксильных группах с использованием ангидрида уксусной кислоты и пиридина, после чего разблокируют в положении гидроксильной группы C-14 с помощью водной соляной кислоты для получения производных 6, 11, 4'-три-O-ацетил-N-трифторацетилдоксорубицина формулы (9), которые конденсируют с соединением формулы 8 в тех же самых вышеизложенных условиях, для получения, после разблокирования фенольных групп с помощью морфолина в метаноле и разблокирования гидроксильной группы в положении C-4' с помощью метилата натрия в метаноле, соединения 10, И наконец, обработка соединения 10 водным едким натром 0,1H дает производное 4'. Способ иллюстрируется схемой 1.

R₃=NHCOCF₃; R₄=H и R₅=OH или R₄=OH и R₅=H Реагенты и условия: I: CH(C₂H₅O)₃, pTSA, CH₂Cl₂; II: (CH₃CO)₂O, пиридин; III: 0,1H HCl-THF; IV: 8. pTSA, CH₂Cl₂, V: морфолин, CH₃OH, VI: NaOCH₃, CH₃OH; VII: 0,1HNaOH.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечивается получение морфолино (MO) и производного морфолино (CM) и (MM) общей формулы 4(MO), 4(CM) и 4(MM) от производных общей формулы 4'(R₃=NH₂), замещенных в положениях C-4' или C-14, получаемых согласно вышеизложенному, согласно стандартным процедурам, описанным в предшествующих патентах.

В частности, получение соединений 4-морфолино 4(a-g)(A-Z)(MO) и 3-циано-4-морфолино 4-(a-g)(A-Z)(CM) происходит в соответствии с процедурой, описанной E. M. Acton et al. b J. Med. Chem. 1984, 27, 638: производные 2-метокси-4-морфолино 4(a-g)(A-Z)(MM) получают согласно процедуре, описанной в патенте США N 4672057, от 9 июня 1987 г. Необходимо подчеркнуть, что остаток - W, в соединениях формулы 4'(a-g)(A-Z) не вредит получению вышеупомянутых производных морфолино.

Согласно способу получения производных морфолино (MO), соединения 4'(a-g)(A-Z), растворенные в воде, вначале вводят в реакцию с 2-оксиэтил-диальдегидом (II) а затем с цианборгидридом натрия для получения производного морфолино.

В результате изменения условий реакции при восстановлении цианборгидрида, в частности, путем добавления цианида натрия извлекают производные цианморфолино (CN).

Получение производных 2-метокси-4-морфолино (MM) осуществляют обработкой соединений 4'(a-g)(A-Z), растворенных в воде, с помощью 1-метокси-2'-оксидиацетальдегида (12) а затем с помощью цианбергидрида натрия.

Конъюгаты формулы I настоящего изобретения представляют собой ценные терапевтические вещества, так как они содержат ацеталевую связь, которая выделяет исходное лекарственное вещество A-O-H после гидроний-ион-катализованного гидролиза или после ферментативного расширения in vivo.

Известно, что в злокачественных опухолях имеет место высокая скорость гликолиза по сравнению с нормальной тканью. Это вызывает увеличение производства лактата и таким образом уменьшение pH в опухоли (см.: H.M.Pauen et al, Z.Naturforsch TeiI B, 23 (1968) 1461). Также соединения формулы 4,4', 6 и 7 могут выделять цитотоксичный антрациклин внутри тканей опухоли.

Изобретение представляет двухуровневую специфичность действия соединений, первый из них заключается в предпочтительной локализации конъюгата в опухолевой ткани с помощью распознавания антигена, а второй заключается в предпочтительном высвобождении лекарственного средства в его активной форме в опухолевой ткани с помощью предпочтительного кислотного расщепления.

Конъюгаты, полученные согласно описанным способам, характеризуются различными физико-химическими методиками.

Сохранение первоначального молекулярного веса и отсутствие образования агрегатов оценивается процедурами хроматографической гель-фильтрации (Ju., D. S.. et al., J, Urol. 140, 415, 1988) с одновременным и независимым детектированием антрациклина и антитела при различных длинах волн и с помощью методов гель-электрофореза.

Общее распределение заряда полученных соединений оценивается с помощью хроматографических ионообменных методов.

Концентрация антрациклина оценивается с помощью спектрофотометрического титрования относительно стандартной калибровочной кривой, полученной из исходного антрациклина.

Концентрация белка оценивается с помощью колориметрических анализов, таких как анализ с помощью бицинконовой кислоты (Smith P.K. et al., Anal. Biochim. 150, 76, 1985) или анализ с красителем Брэдфорда (Bradfora, M,M., AnaI. Biochim. 72, 248, 1976).

Сохранение связывающей активности антигена антител после процедур конъюгации оценивается с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (Yu, D. S. et al., S.Urol. 140, 415, 1988) и с помощью цитофлуориметрических методов (Galiego J. et al., Int. j. Cancar 33, 737, 1984).

Оценка сохранения цитотоксичности конъюгатов по сравнению с исходным лекарственным средством оценивается испытанием ингибирования забора ³H-тимидина с помощью мишеневых клеток, после достаточного длительного времени инкубации для объединения максимального цитотоксического эффекта (DiIImann, R.O. et al, Cancer ReS, 48, 6097, 1988).

Оценка селективной цитотоксичности конъюгатов по отношению к антиген-положительной по сравнению с антиген-отрицательной клеточной линии осуществляется с помощью теста на ингибирование поглощения ³H-тимидина антиген-положительными относительно антиген-отрицательных клеточных линий, после краткого времени инкубации (DiIImann, R.O. et al., Cancer ReS. 48, 6096, 1988). Кислотная чувствительность конъюгата оценивается вышеупомянутыми методами хроматографии после инкубации соединений в соответствующих буферированных растворах.

В качестве альтернативы, для оценки стабильности в плазме используют радиоизотопное мечение конъюгатов в частности, относящейся к антителу (¹²⁵I), и/или в части, относящейся к антрациклину (¹⁴C), и аналитические методы ВЭЖХ.

Терапевтический эффект соединений и улучшение их терапевтической эффективности по сравнению с исходным лекарственным средством оцениваются в животных моделях пересаженных опухолей человека. Голые мыши, несущие ксенотрансплантаты опухолей человека, подвергаются обработке соответствующими дозами конъюгатов, чистого лекарственного средства, антитела и физической смеси лекарственного средства и антитела, при эквивалентных дозах, и рост опухоли регистрируют и сравнивают в различных группах лечения.

Конъюгаты иммуноглобулина готовятся в качестве лекарственного средства в виде фармацевтических составов с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Любой соответствующий носитель или разбавитель может быть использован. Пригодные носители и разбавители включают физиологические соляные растворы и растворы декстрозы Рингера.

Конюъгаты согласовано изобретению полезны в качестве противоопухолевых средств. Млекопитающее, например, человек или животное, следовательно, может подвергаться лечению с помощью метода, включающего введение ему фармакологические эффективного количества конъюгата формулы I, как определено выше. Состояние человека или животного может быть улучшено таким образом.

Тонкослойную хроматографию осуществляют с помощью кизель-гелевых планшетов фирмы Мерк F₂₅₄, с использованием следующих элюирующих систем (объем/объем): система A: мектиленхлорид:метанол (98:2), система B: метиленхлорид:метанол:уксусная кислота:вода (80:20:7:3), система C: метиленхлорид:метанол (95:5), система D: метиленхлорид:ацетон (4:1), система E: метиленхлорид:метанол:уксусная кислота (80:20:1), система F: метиленхлорид:ацетон (9:1), система G: метиленхлорид:ацетон (95:5), система H: метиленхлорид:метанол (90:10).

Изобретение дополнительно иллюстрируется прилагаемыми чертежами, на которых: фиг. 1 представляет собой график, на котором показаны результаты твердофазного иммуноферментного анализа, изложенного в примере 30, следующем ниже, для оценки связывания с клеточной линией меланомы человека иммуноконъюгата рецептора антитрансферрина согласно изобретению I³ (линия X-X-X) и антитела ОКТ9 исходного рецептора противочеловечьего трансферрина (линия ). В графике оптическое поглощение на 495 нм (ось y) приведено относительно концентрации антитела в нг/мл.

На фиг. 2 изображен график, показывающий результаты оценки, изложенной в нижеследующем примере 31, селективной цитотоксичности иммуноконюъгата 1³ рецептора антитрасферрина согласно изобретение (линия ) и исходного чистого лекарственного средства антрициклина (линия ). В графике (3H) включение тимидина в виде процентного значения для контроля (ось y) приводится относительно концентрации антрациклина в нМ (ось X).

Фиг. 3 представляет собой график, на котором показаны результаты оценки, приведенной в нижеследующем примере 32, ингибирования цитотоксичности конъюгата 1³ рецептора антитрансферрина. Линия X-X-X = иммуноконъюгату 1³ + антитело ОКТ9, а линия = иммуноконъюгату 1³. Введение (3Н) тимидина в качестве контрольного % (ось y) приводится относительно концентрации антрациклина в нМ.

На фиг. 4 изображено ингибирование в зависимости от дозы цитотоксичности иммуноконъюгата 1³ различными количествами избытка неконъюгированного антитела ОКТ9, как описано в нижеследующем примере. На графике включение (3Н) тимидина в виде процентного значения контроля (ось y) приведено относительно избытка свободного антитела (ось x).

На фиг. 5 показаны результаты оценки, приведенные в нижеследующем примере 34, селективной цитотоксичности конъюгата 1⁷ FGF (линия X-X-), не относящегося к делу контроля иммуноконъюгата 1⁴ (линия ) и свободного антрациклина (линия ). На графике включение (3H) тимидина в виде процентного значения контроля (ось y) приведено относительно концентрации антрациклина в нМ (ось x).

Пример 1. Получение этил 2-(3,4-дигидро-2H-пиран-2-ил) метилоксиацетата (8B) К 2-метанол-3,4-дигидро-2H-пирану (формула M, 4,2 г, 35 ммолей), растворенному в безводном метаноле (100 мл), добавляли едкий натр (1,6 г, 40 ммолей) и слегка нагревали. Затем растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в диметилсульфоксиде (100 мл). К этому раствору, нагретому до 110^oC, добавляли 2-хлор-натрий-ацетат (6 г, 1,5 ммоля) в диметилсульфоксиде (100 мл) в течение 2 ч при энергичном перемешивании. После отстаивания в течение получаса реакционную смесь охлаждали, добавляли триэтиламин (5 мл) и иодистый этил (5 мл) и хранили всю ночь при комнатной температуре. Затем реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали простым этиловым эфиром. После стандартной обработки целевое очищали хроматографическим путем на кремневой кислоте, элюируя со смесью петролейного эфира-простого эфира (80 : 10 объем/объем). Получали 1,68 г соединения 5 в виде масла, выход 26%. Тонкослойная хроматография на плате из Кизельгеля F₂₅₄ (фирма Мерк) с использованием в качестве элюирующей системы смеси петролейного эфира: простого эфира 1 : 1 по объему. R_f = 0,7.

¹H ЯМР (200 МГц, CDCl₃) : 1,26 (t, J = 7,1 Гц, 3H, CH₂CH₃); 1,6 - 2,2 (m, 4H, CH₂-3, CH₂-4); 3,64 (d, J = 5,2 Гц, 2H, CH₂O); 4,00 (m, 1H, H-2); 4,13 (m, 2H, OCH₂C=O); 4,19 (g, J = 7,1 Гц, 2H, CH₂CH₃); 4,65 (m, 1H, H-5); 6,35 (ddd, J = 6,2, 2,0, 2,0 Гц, 1H, H-6).

Пример 2.

Получение 4'-эпи-4'-O-(2-карбокситетрагидропиран-6-ил) даунорубицина: X и y изомеры (2''R, 6''R и 2''S, 6''S). 4'c(A): A¹-O=3''c(R₃ = NH₂); 4'-эпи-N-трифторацетилдаунорубицин (3c : R₃ = NHCOCF₃) (3,1 г, 5 ммолей) растворяли в безводном хлористом метилене (500 мл) и обрабатывали 3,4-дигидро-2H-пиран-2-этоксикарбонилом (8A, 3,4 г, 25 ммолей), полученным согласно описанию в "Macromolecules Vol 12, N 1, с. 5 - 9, янв.-февр. 1979 г., и п-толуолсульфокислотой (100 мг) при комнатной температуре в атмосфере азота. Спустя час хроматографический контроль показал образование двух продуктов, имеющих, соответственно, значение R_f в 0,53 и 0,36 в системе A.

Реакционную смесь промывали водным раствором 5%-ного двууглекислого натрия и воды, затем органическую фазу отделяли, высушивали на безводном сульфате натрия, концентрировали до малого объема при пониженном давлении и хроматографировали на колонке с кремневой кислотой для получения производных 4'-эпи-4'-O-(2-карбоэткоситетрагидропуран-6-ил)-N-трифторацетил даунорубицина от целевого соединения, имеющих соответственно значение R_f в 0,53 (1,5 г, выход 40%) и 0,36 (1,28 г, выход 32%) в системе A.

Соединение R_f = 0,53; FD-MS: м/э 663 (М⁺).

¹H ЯМР (200 МГц, CDCl₃) среди прочего : 1,31 (COOCH₂CH₃, J = 7,1 Гц), 1,33 (5'-CH₃, J = 6,4 Гц), 2,41 (COCH₃), 3,40 (4'-H, J = 9,7 Гц), 4,07 (4-CH₃O), 4,55 (6''-H), 4,96 (2''-H0, 5,30 (7-H), 5.38 (1'-H), 7,92 (NHCOOCF₃).

Соединение R_f = 0,36, FD-MS м/э 663 (М⁺), ¹H ЯМР (200 МГ, CDCl₃), среди прочего, : 1,28 (COOCH₂, CH₃, J = 7,1 Гц), 1,38 (5'-CH₃, J = 6,4 Гц), 2,42 (COCH₃), 3,54 (4'-H, J = 8,7 Гц); 4,07 (4-CH₃O), 4,42 (6''-H), 5,10 (2''-H), 5,29 (7-H) 5,48 (1'-H), 6,62 (NHCOCF₃).

Соединение R_f = 0,53 (1,4 г, 1,79 моля) растворяли водным раствором 0,2 н. гидроокиси натрия в атмосфере азота и хранили при 0^oC в течение 8 ч. Затем водный раствор настраивали до pH с помощью водного 1 н. хлористого водорода и экстрагировали повторно хлористым метиленом. Органическую фазу промывали водой, отделяли, сушили на безводном сульфате натрия и выпаривали при пониженном давлении до получения x, одного из двух изомеров (x и y) целевого соединения 4'c (A), (0,9 г, выход 79%).

P = 0,60 (система B), FDMS: м/э 639 (м+).

Соединение R_f = 0,36 (1,1 г, 1,4 ммоля) гидролизовали согласно вышеописанному для получения, после стандартной обработки, другого изомера у целевого соединения 4'c (A), (0,72 г, выход 80%). R_f = 0,45 (система B). FD-MS: м/э 639 (М+).

Пример 3.

Получение 4'-эпи-4'-O-(2-карбокситетрагидропиран-6-ил)-3'- деамино-3'(4-морфолино)даунорубицин: изомер x (один из двух 2''R, 6''R или 2''S, 6''S).

4c(A)(MO)" A-O = 3''c (R₃ = MO); соединение 4'c(A) (x-изомер)(1,2 г, 1,8 ммоля), полученное согласно изложенному в примере 2, растворяли в воде (200 мл), доводили pH до 7,5 с помощью бикарбоната натрия, к нему добавляли 2-оксиэтил-диальдегид (1,3 г), растворенный в воде (20 мл). Спустя 1 ч раствор цианборгидрида натрия (100 мг) в воде (6 мл) был добавлен при перемешивании при комнатной температуре. Спустя 30 мин реакционную смесь доводили до pH 6 с помощью водного раствора 5%-ной уксусной кислоты и экстрагировали с помощью н-бутилового спирта. Органическую фазу промывали водой и растворитель удаляли при пониженном давлении. Остаток очищали хроматографическим путем на колонке кремневой кислоты с использованием системы метиленхлорид:метанол:уксусная кислота (90: 8: 2) по объему) для получения, после стандартной обработки, целевого соединения 4c(A)(MO) (0,6 г, выход 45%).

R_f = 0,70 (система B). FD-MS : м/э 724 (M+).

¹H ЯМР (200 МГц, CDCl₃), среди прочего : 1,29 (5'-CH₃, J=6,3 Гц), 2,42 (COCH₃), 2,4-2,8 (CH₂-N-CH₂), 2,98 (3'-H), 3,65 (CH₂O-CH₂), 3,40 (4'-H, J= 9,0 Гц), 4,08 (4-CH₃O), 4,30 (6"-H), 5,00 (2"-H), 5,27 (7-H), 5,51 (1'-H).

Пример 4.

П