Производные метотрексата, способы их получения и фармацевтическая композиция

Производные метотрексата, способы их получения и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Предлагается соединение формулы представленной в описании, где R¹ является CH₂, CH₂CH₂, Ch₂o, ch₂s, ch₂so; R² является атомом водорода, низшей алкильной группой, содержащей от 1 до 4 атомом углерода, или бензильной группой; n является целым числом от 1 до 4; R³ является COOR⁴, NHCOR⁵, CONR⁶R⁷, PO₃H₂, SO₃H. Это соединение обладает потенциальной противоревматической функцией, пригодно для лечения псориаза и обладает канцеростатическими свойствами, а также имеет низкую токсичность, что деляет пригодным его использование в качестве медикамента. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 15 ил.

Изобретение относится к производным метотрексата, более конкретно, к новым производным метотрексата, пригодным в качестве антиревматического агента, агента, излечивающего псориаз, и концеростатического агента.

Метотрексат описан как препарат, тормозящий рост лимфоцитов, злокачественных новообразований, псориатических клеток, рост активно пролиферирующих тканей, подавляющий клеточный митоз (Агаджанян Р.Н., Терапевтический архив, М.: Медицина, 1987, N1, с.118-121).

Метотрексат был известен как агент для лечения лейкемии и Gubner et.al. сообщал о его эффективности при лечении ревматоидных артритов (RA) или псориаза в 1951 г. и с тех пор он использовался как лечебный агент для (RA) в Европе и США. Относительно недавно подробные исследования способа применения и доз привели к выводу, что терапия метотрексата в малых дозах дает великолепную эффективность при относительно органических побочных эффектах. Однако такие побочные эффекты, как гепатопатия или фиброма легкого, вызванные приемом метотрексаты, нельзя игнорировать, так что было бы желательно получить лекарство, обладающее меньшими побочными эффектами и повышенной эффективностью.

В качестве производных метотрексата, в которых алкильная группа, отличающаяся от метильной, вводится по N¹⁰, были известны, например, следующие формулы: , (J. Med. Chem., 22, р. 862/1979/) или формулы: , (J. Med. Chem. 25, р. 877 /1982/) и тому подобное, однако они не обязательно обладают достаточной активностью.

Краткое содержание изображения Настоящее изобретение обеспечивает получение нового производного метотрексата, представленного следующей формулой (I): , где R¹ является группой, выбранной из группы, состоящей из CH₂, CH₂CH₂, CH₂O, CH₂S и CH₂SO; R² является атомом водорода, низшей алкильной группы, содержащей от 1 до 4 атомов водорода, или бензильной группой; n является целым числом от 1 до 4; R³ является группой, представленной формулой: COOR⁴ (где R⁴ является атомом водорода или низшей алкильной группой, содержащей от 1 до 4 атомов углерода), NHCOR⁵ (где R⁵ является фенильной группой, у которой могут быть заместители), CONR⁶R⁷ (где R⁶ является атомом водорода или низшей алкильной группой, содержащей от 1 до 4 атомов углерода; R⁷ является группой низшего алкила, содержащей от 1 до 4 атомов углерода, фенильной группой или карбоксиалкильной группой, каждая из которых может быть замещенной или низшей алкилсульфонильной группой), PO₃H₂ или SO₃H, Соединение настоящего изобретения обладает отличным противоревматическим действием, пригодно для лечения псориаза и обладает канцеростатическим действием, а также характеризуется тем, что имеет низкую токсичность по сравнению с обычным метотрексатом.

На фиг. 1-3 представлены количества (отношения) 3H-UdR, подлежащие поглощению при соответствующих концентрациях лекарств, подлежащих тестированию; на фиг. 4 - функция ингибирования роста кератиноцитов у крыс; на фиг. 5 - функция ингибирования роста кератиноцитов у человека. Поглощение при соответствующих концентрациях, подлежащих тестированию лекарств, представлено на основании того, что поглощение в отсутствии лекарства составляет 100%; на фиг. 6 - функция ингибирования роста клеток Р388; на фиг. 7 - функция ингибирования роста колонии 26. Поглощение при соответствующих концентрациях лекарств, подлежащих тестированию, представлено в расчете на то, что поглощении в отсутствии лекарства составляет 100%; га фиг. 8 - изменение веса у крыс при введении метотрексата или соединения настоящего изобретения; на фиг. 9 - изменение числа белых кровяных телец (WBC) и красных кровяных телец (RBC); на фиг. 10 - изменения в функции печени и содержании в печени TG.

Описание предпочтительных вариантов Соединения настоящего изобретения каждое являются новыми и до сих пор не были описаны в каких-либо ссылках, могут быть получены, например, следующим образом (способ А см. фиг. 11-15), где R¹, R², R³ и n имеют те же значения, что и указанные ранее, R' представляет атом водорода или низшую алкильную группу, содержащую от 1 до 4 атомов углерода, A¹ и A² каждый представляют защитную группу, а X представляет атом галоида.

В способе A реакцию получения соединения формулы (2) из соединения формулы (I) проводят суспендируя соединение формулы (I) в кислотном галоидирующем агенте, таком как тионилхлорид, оксалилхлорид и т.д., и перемешивая смесь при комнатной температуре в одновременном присутствии каталитического количества диметилформамида и т. д. В этой формуле в качестве защитной группы, представленной A¹, можно указать карбобензоксигруппу, группу тозила, группу ацетила и т.д.

Реакцию получения соединения формулы (4) из соединения формулы (2) и соединения формулы (3) проводят, добавляя раствор соединения формулы (2), растворенный в таком растворителе, как дихлорметан, к водному раствору соединения формулы (3) при охлаждении льдом или водой, а затем перемешивая смесь при комнатной температуре при одновременном присутствии такого органического основания, как карбонат калия, гидроксид натрия, бикарбонат натрия и т.д.

Реакцию получения соединения формулы (5) из соединения формулы (4) ведут, добавляя соединение формулы (4) к раствору анизола или фенола и т.д., растворенного в растворе гидробромидуксусной кислоты, и перемешивая полученную смесь при температуре 10-60^oC, предпочтительно при комнатной температуре. Кроме того, реакцию получения соединения формулы (5) из соединения формулы (4) можно вести растворяя соединение формулы (4) в таком растворителе, как метанол, этанол, уксусная кислота, а затем перемешивая полученную смесь после добавления на угле в атмосфере водорода при комнатной температуре.

Реакцию получения соединения формулы (7) из соединения формулы (6) и соединения формулы (5) ведут при взаимодействии соединения формулы (6) и соединения формулы (6) и соединения формулы (5) в таком растворителе, как диметилформамид, диметилацетамид и т.д., при температуре 0-100^oC, предпочтительно 50-60^oC, при перемешивании. В частности, если R² является атомом водорода, 1н. водный раствор гидроксида натрия добавляют к такому растворителю, как метанол, этанол и т.д., и перемешивают полученную смесь при температуре 0-60^oC, предпочтительно при 35^oC, до получения целевого соединения. В этой формуле в качестве атома галоида, представленного X, можно указать атом брома, атом хлора и т.д.

В способе B реакцию получения соединения формулы (9) из соединения формулы (6) и соединения формулы (8) осуществляют, проводя реакцию соединения формулы (6) и соединения формулы (8) в таком растворителе, как диметилацетамид, диметилформамид и т. д. при температуре 0-100^oC, предпочтительно, 55^oC, при перемешивании.

Реакцию получения соединения формулы (7) из соединения формулы (9) и соединения формулы (3) ведут, перемешивая соединение формулы (9) при одновременном присутствии цианида диэтилфосфорной кислоты или дициклогексилкарбодиимида и 1-гидроксибензотриазола, в таком растворителе, как диметилформамид, диметилацетамид, N-метилпирролидинон и т.д. а затем добавляя соединение формулы (3) и перемешивая смесь при температуре от 0 до 200^oC, предпочтительно от 10 до 80^oC, при перемешивании. В частности, если R² является атомом водорода, IN-водный раствор гидрохлорида натрия добавляют к смеси, и перемешивают смесь при температуре 0-60^oC, предпочтительно при комнатной температуре до получения целевого соединения.

В способе C реакцию получения соединения формулы (12) из соединения формулы (10) и соединения формулы (11) ведут, растворяя соединение формулы (10) в таком апротонном растворителе, как хлороформ, дихлорметан, тетрагидрофуран, диоксан и т.д., добавляя соединения формулы (11), воду и, например, карбонат калия, триэтиламин, бикарбонат натрия, пиридин и т.д., к смеси и перемешивали смесь при комнатной температуре. В этой формуле в качестве защитной группы, представленной A², можно указать карбобензоксигруппу, группу тозила, группу ацетила и т.д.

Реакцию получения соединения формулы (13) из соединения формулы (12) ведут в таком растворителе, как метанол и т.п., перемешивая при температуре -60 до -20^oC, предпочтительно при -30^oC, и затем добавляя тионилхлорид, осуществляя кипячение с обратным холодильником полученной смеси.

Реакцию получения соединения формулы (14) из соединения формулы (13) ведут, растворяя соединение формулы (13) в этаноле, метаноле, тетрагидрофуране, диоксане и т.д. и перемешивая полученную смесь в присутствии одновременно палладия на угле в атмосфере водорода при комнатной температуре. Реакцию получения соединения формулы (15) из соединения формулы 14 и соединения формулы (2) ведут, растворяя соединение формулы (2) в дихлорметане и т. д., добавляя соединение формулы (14) и карбонат калия или триэтиламин и воду и перемешивая полученную смесь при комнатной температуре, но амидирование можно вести, используя смешанный ангидрид кислоты, активный сложный эфир или активный амид.

Реакцию получения соединения формулы (16) из соединения формулы (15) ведут, добавляя гидробромидуксусную кислоту в которой ранее был растворен анизол или фенол, к соединению формулы (15) и перемешивая смесь при комнатной температуре.

Реакцию получения соединения формулы (17) из соединения формулы (6) и соединения формулы (16) осуществляют после перемешивания в апротонном растворителе, таком как диметилформамид и диметилацетамид, при температуре 25-100^oC, предпочтительно, от 50 до 65^oC, перемешивая смесь в воде, содержащей, например, триэтиламин, карбонат калия или бикарбонат натрия и т.д.

Реакцию получения соединения (1) из соединения формулы (17) ведут в растворителе, таком как этанол, добавляя водный раствор гидроксида натрия и перемешивая полученную смесь при комнатной температуре.

Соединение, представленное формулой (I), полученное по способу настоящего изобретения, обладает противоревматической эффективностью, лечит псориаз и обладает канцеростатической активностью. Кроме того, по сравнению с метотрексатом, оно обладает меньшей токсичностью. Эти свойства подтверждены в испытаниях в следующих экспериментах.

1. Функция ингибирования роста лимфоцитов, полученных из периферической крови человека (противоревматическая функция).

2. Эксперимент по ингибированию роста кератиноцитов у крыс и человека (функция лечения псориаза).

3. Эксперимент по ингибированию роста раковых клеток у мышей (канцеростатическая функция).

4. Сравнение токсичности метотрексата (МТХ) и соединения настоящего изобретения при внутрибрюшинном непрерывном введении крысам.

Экспериментальный пример 1. Функция ингибирования роста лимфоцитов, полученных из периферической крови человека (противоревматическая функция) (способ) Лимфоциты выделяют из периферической крови человека, используя Ficoll-Paque^R, и лекарство подходящим образом разбавляют и 105 лимфоциты культивируют с PHA(0,3 мкг/мл) в культурных пластинах с 96 ячейками в течение 2 дней. За 5 ч до завершения культивирования добавляют ³H-UdR (по 1кCi/ячейку) и захват ³H-UdR лимфоцитами измеряют сцинтилляционным счетчиком)(здесь PHA обозначает фитогемагглутинин, а UdR - деоксиуридин). Использованные лекарства приведены ниже.

На фиг.1-3 изображены отношения в расчете на захват ³H-UdR PHA стимулус лимфоцитами, причем за 100% принято для отсутствия лекарства. Как хорошо видно на фиг.1-3, было подтверждено, что соединения настоящего изобретения прекрасно ингибируют рост лимфоцитов (противоревматическая функция) по сравнению с контрольными соединениями.

Экспериментальный пример 2. Эксперимент по ингибированию роста кератиноцитов у крыс и человека (лечение псориаза).

(1) Эксперимент по ингибированию роста кератиноцитов у крыс.

1) Вначале культивировали кератиноциты крыс, используя ЗТЗ клетки штамма Swiss в качестве фидерного слоя, который засевали концентрацией 4 10⁴ клеток/мл/ячейку на пластине с 24 ячейками, обработанными коллагеном типа IV, используя МСДВ 153 /ДМЕ/10% FCS среду, содержащую факторы роста (инсулин, гидрокортизон, EGF, токсин холеры), и культивируют под 5% CO₂ и 95% воздуха при 37^oC.

2) Спустя 24 ч все это дважды промывают средой МСДВ 153, не содержащей ни тимидина, ни аденина, а среду меняют на среду МСДВ 153 (1,8 мМ Ca), содержащую фактор роста (инсулин, гидрокортизон, EGF, токсин холеры) и не содержащую ни тимидина, ни аденина, и после добавления к ней лекарства культивирование ведут под 5% CO₂ и 95% воздуха при 37^oC в течение 4 дней.

3) 0,5% МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид] добавляют по 100 мкл/ячейку, и оставляют выстаиваться при 37^oC в течение 4 ч, а затем среду отсасывают. Краситель (формазан), образуемый живыми клетками, растворяют, добавляя ДМСО (диметисульфокид) по 200 мкл на ячейку. Измеряют поглощение (A 540) красителя, растворенного, и среднее из 6 ячеек рассчитывают как относительное значение числа клеток.

(2) Эксперимент по ингибированию роста кератиноцитов человека.

1) Кератиноциты человека, полученные от Kurabou K.K., засевают при концентрации 2 10⁴ клеток/мл/ячейку в пластину с 24 ячейками, обработанную коллагеном типа IV, используя МСДВ 153 среду (0,15 мМ Ca), содержащую фактор роста (инсулин, гидрокортизон, rhEGF, этаноламин, фосфоэтаноламин) и не содержащую ни тимидина, ни аденина, и культивируют при 5% CO₂ и 95% воздуха при 37^oC.

2) Спустя 24 часа к этому добавляют образец, и полученную смесь культивируют при 5% CO₂ и 95% воздуха при 37^oC в течение 4 дней.

3) 0,5% МТТ [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид] добавляют в количестве 100 мкл/ячейку и оставляют выстаиваться при 37^oC в течение 4 часов, полученную среду отсасывают. Краситель (формазан), образовавшийся за счет живых клеток, растворяют, добавляя ДМСА (диметилсульфоксид) по 200 мкл/ячейку. Поглощение (A 550) растворенного красителя измеряют и среднее из 6 ячеек рассчитывают как относительное значение числа клеток.

Использованные лекарства изображены ниже.

На фиг. 4 представлены результаты эксперимента по ингибированию роста кератиноцитов у крыс, на фиг. 5 - результаты эксперимента по ингибированию роста кератиноцитов у человека. Каждый из результатов представлен в виде отношения в расчете на поглощение, равное 100%; когда вообще не добавляли никакого лекарства.

Как хорошо видно на фиг.4 и 5, было подтверждено, что соединения настоящего изобретения обладают отличной способностью ингибировать рост кератиноцитов (функция лечения псориаза) по сравнению с контрольными соединениями.

Экспериментальный пример 3. Эксперимент по ингибированию роста раковых клеток у мышей (канцеростатическая функция).

Клетки P388 лимфоидной неоплазмы у мышей суспендированные в среде RPM 11640 (добавляют так, чтобы было 5% сыворотки плода теленка, и 10^-6M 2-меркаптоэтанола), или клетки карциномы колонии 26 мышей помещают в каждую ячейку плоскодонной микропластины (доступной от Corning Co. # 25870) с 5 10³, и раствор лекарства, приготовленный в той же среде, помещают таким образом, чтобы получить 0,2 мл лекарства в каждой ячейки. Все это культивируют в устройстве для культивирования с углекислым газом (5% углекислого газа, 95% воздуха, влажность 100%) в течение 3 дней, а затем раствор МГТ/3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромида растворяют в фосфатном буфере физиологического раствора (pH 7,4; 4,10 мМ) с количеством 5 мг/мл), добавляют в каждую ячейку в количестве 10 мкл, культивируют еще в течение 4 часов. Культивированную надосадочную жидкость удаляют по 150 мкл, образовавшийся краситель (формазан) растворяют в ДМСО (диметилсульфоксиде; 150 мкл/ячейку) и поглощение (540 нм) измеряют на спектрофотометре для микропластины.

Использованные лекарства изображены далее.

На фиг. 6 изображен пример с использованием клеток P388, на фиг. 7 - пример использования колонии 26. Данные представлены в % по отношению к ячейке, в которой клеточный рост проходил без добавления лекарства, то есть ее поглощение принято за 100%, и определялась степень ингибирования роста за счет добавления лекарств.

Как ясно видно на фиг. 6 и 7, они подтверждают, что соединения настоящего изобретения обладают гораздо более высокой эффективностью по ингибированию роста раковых клеток (канцеростатическая функция), нежели эффективность контрольного лекарства.

Экспериментальный пример 4. Cравнение токсичности метотрексата (МТХ) и соединения настоящего изобретения при внутрибрюшинном непрерывном введении крысам.

Восьминедельным самцам крыс штамма SD внутрибрюшинно вводят МТХ или соединение настоящего изобретения раз в день с частотой 5 дней в неделю в течение 5 недель непрерывно. Вводимые дозы двух видов: 0,25 и 0,5 мг/кг каждого из МТХ и соединения настоящего изобретения. Для контрольной группы аналогичным образом вводят растворитель (фосфатный буфер, pH 7,4). В каждой группе было по пять крыс.

Наблюдения вели по следующим пунктам: 1) Жизнь или гибель и симптомы: наблюдали каждый день.

2) Изменение веса тел: измеряли раз в неделю.

3) Исследования крови: в последнюю неделю введения лекарства определяли количество белых кровяных телец (WBC) и красных кровяных телец (RBC).

4) Вес печени и содержание триглицеридов (TG) в печени: после окончания введения лекарств проводили вскрытие и определяли вес и содержание TG в печени.

Использование лекарства приведены далее: Результаты.

1) Жизнь или гибель, симптомы.

Среди групп животных, которым вводили МТХ, в группе, которой вводили дозу 0,25 мг/кг, не погибла ни одна крыса и ненормальные симптомы не наблюдались. Однако в группе, которой вводили дозу 0,5 мг/кг, наблюдали анемию, плохое питание, снижение количества дефекаций, отеки вокруг рта и т.д., и одна из пяти крыс погибла.

С другой стороны, в группе, которой вводили соединение настоящего изобретения, мыши не гибли ни в группе, которой вводили 0,25 мг/кг, ни в группе, которой вводили 0,5 мг/кг, и никаких ненормальных симптомов не наблюдали.

2) Изменения в весе тела.

На фиг. 8 представлены изменения в весе. Изменения в инкременте веса тела были меньше для соединений настоящего изобретения нежели для МТХ.

3) Исследования крови.

На фиг. 9 представлены результаты исследований крови. Снижение количества WBC и RBC были значительно меньше у соединений настоящего изобретения, нежели для МТХ.

4) Вес печени и содержание TG в печени.

На фиг. 10 представлены вес печени и содержание TG в печени. Инкремент веса печени и содержание TG в печени оба были ниже для соединений настоящего изобретения нежели для МТХ.

Обсуждение.

Токсичности МТХ и соединений настоящего изобретения сравнивали, используя крыс, которым непрерывно вводили внутрибрюшинно препараты. В результате все указания по количеству погибших, по симптомам, по изменению веса тел, по исследованию крови, веса печени и содержанию в печени TG, свидетельствует о том, что токсичность соединений настоящего изобретения ниже, нежели токсичность МТХ.

Сравнительный пример 1. Получение 1-карбобензокси-5-карбоксииндолина.

К смеси воды (20 мл) и диэтилового эфира (20 мл) добавляют 2,0 г 5-карбоксииндолин и гидроксид натрия (0,6 г), а затем, при охлаждении льдом, к смеси поочередно добавляют карбобензоксихлорид (2,59) и воду (10 мл), содержащую гидроксид натрия (2,1 г). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь подкисляют 2н, соляной кислотой и выпавшие в осадок кристаллы собирают фильтрованием. Осадки промывают эфиром и сушат воздухом до получения указанного в заглавии соединения (2,8 г).

¹H ЯМР (DMCO-d₆) 3,10 (2H, т, J = 8 Гц), 4,03 (2H, т, J = 8 Гц), 5,23 (2H, с), 7,2 - 8,0 (8H, м).

Т. плавления 194 - 196^oC.

Сравнительный пример 2. Получение диэтил-N-(1-карбоксибензоксииндолин-5-карбонил) -L-глютамата.

После суспендирования соединения (2,5 г) ссылочного примера 1 в тионилхлориде (10 мл) к полученной смеси добавляют каталитическое количество диметилформамида и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем избыток тионилхлорида удаляют при пониженном давлении, а остаток тщательно растирают в н-гексане. полученные кристаллы фильтруют и растворяют в дихлорметане (20 мл), и полученный дихлорметановый раствор прикапывают к водной (50 мл) суспензии, содержащей гидрохлорид диэтилглютамата (3,0 г) и триэтиламина (2,8 г) при охлаждении льдом. После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение 2,5 ч растворитель удаляют при пониженном давлении и к остатку добавляют смешанный раствор этилацетата (200 мл) и разбавленной соляной кислоты (200 мл) при охлаждении льдом. После перемешивания смеси в течение 5 мин органический слой получают разделением. Органический слой промывают 5% водным бикарбонатом натрия, а затем сушат над сульфатом магния. Затем удаляют этилацетат при пониженном давлении, и остаток обрабатывают на хроматографической колонке, используя смесь растворителей хлороформ - метанол = 30:1 в качестве элюента, до получения указанного в заглавии соединения (3,1 г).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ) : 1,19 (3H, т, J = 7 Гц), 1,25 (3H, т, J = 7 Гц); 2,1 - 2,6 (4H, м), 3,06 (2H, т, J = 8 Гц), 3,8 - 4,3 (6H, м), 4,75 (1H, м), 5,20 (2H, с), 6,79 (1H, д, J = 7 Гц), 7,2 - 7,7 (8H, м).

Т.плавления 120 - 121^oC.

Сравнительный пример 3. Получение диэтил-N-(индолин-5-карбонил)-L-глютамата.

Соединение (1,8 г) сравнительного примера 2 растворяют в 80 мл тетрагидрофурана и после добавления 10% палладия на угле (0,4 г) полученную смесь перемешивают в атмосфере водорода в течение 5 часов. Палладий на угле удаляют фильтрованием, используя целит до получения указанного в заглавии соединения (1,2г).

¹H ЯМР (CDCl₃, : 1,21 (3H, т, J = 7 Гц), 1,29 (3H, т, J = 7 Гц), 2,0 - 2,6 (4H, м), 3,00 (2H, т, J = 8 Гц), 3,59 (2H, т, J = 8 Гц), 4,07 (2H, кв. J = 7 Гц), 4,19 (2H, кв. J = 7 Гц), 4,75 (1H, м), 6,47 (1H, д, J = 9 Гц), 6,68 (1H, д, J = 7 Гц), 7,45 (1H, д, J = 9 Гц), 7,49 (1H, с).

Т.плавления 96 - 97^oC.

Пример 1. Получение диэтил-N-[1-(2,4-диамино-6-птеридинил)-метил-индолин-5-карбонил]-L-глютамата.

В диметилацетамиде ( 3 мл) суспендируют соединение (214 мг) сравнительного примера 3 и аддукт 6-бромметил-2,4-диамино-птеридингидробромида изопропанола (250 мг), и полученную смесь перемешивают при 50 - 55^oC в течение 4 ч. После охлаждения к реакционной смеси добавляют воду (15 мл), содержащую 124 мг триэтиламина, а затем полученную смесь экстрагируют хлороформом (350 мл), разделяя на четыре раза. После этого органический слой сушат над сульфатом магния, растворитель удаляют при пониженном давлении, а остаток обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, используя смешанный растворитель хлороформ-метанол = 10:1 в качестве элюента, до получения указанного в заглавии соединения (200 мг).

¹H ЯМР (DMCO-d₆, ) : 1,22 (3H, т, J = 7 Гц), 1,30 (3H, т, J = 7 Гц), 2,0 - 2,5 (4H, м), 3,07 (2H, т, J = 8 Гц), 3,57 (2H, т, 8 Гц), 4,10 (2H, кв. J = г Гц), 4,23 (2H, кв. J = 7 Гц), 4,79 (1H, м), 5,24 (2H, с), 6,51 (1H, д, J = 9 Гц), 6,76 (1H, д, J = 7 Гц), 7,57 (1H, с), 7,59 (1H, д, J = 9 Гц), 8,82 (1H, с). T. плавления 168-170^oC.

Пример 2. Получение N-[1-((2,4-диамино-6-птеридинил)метил) индолин-5-карбонил]-L-глютаминовой кислоты (соединение I).

Соединение (170 мг) примера 1 растворяют в 33 мл этанола и к этому раствору добавляют 1 н. водный раствор гидроксида натрия (0,84 мл) при 35^oC, и полученную смесь перемешивают при этой же температуре в течение 4,5 часов. После непрерывного перемешивания при 25^oC еще в течение 20 часов реакционной смеси добавляют воду (2 мл). Реакционную смесь выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде (15 мл), pH полученного раствора устанавливают 3,7 1н. соляной кислотой при охлаждении льдом и оставляют выстаиваться в холодном месте в течение ночи. Полученный осадок собирают фильтрованием до получения указанного в заглавии соединения (130 мг).

¹H-ЯМР (DMCO-d₆, ): (2H, м), 2,32 (2H, m), 2,98 (2H, т. J=8 Гц), 3,56 (2H, т, J=8 Гц), 4,29 (IH, м), 4,53 (2H, с), 6,71 (IH, д, J=9 Гц), 7,57 (IH, с), 7,59 (IH, д, J=9 Гц), 8,72 (IH, с). T. плавления 201-204^oC (с разложением).

Сравнительный пример 4. Получение диметил-N-(1-карбобензоксииндолин -5-карбонил)-L--аминоадипата.

После суспендирования 1-карбобензоксииндолин-5-карбоновой кислоты (3,1 г) в 10 мл тионилхлорида к этой суспензии добавляют каталитическое количество диметилформамида и полученную смеси перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем избыток тионилхлорида удаляют при пониженном давлении, а остаток тщательно растирают в н-гексане. Полученные кристаллы фильтруют и растворяют в 30 мл дихлорметана, полученный раствор дихлорметана прикапывают к водному раствору (30 мл), содержащему диметил-L--аминоадипатгидрохлорида (2,7 г) при охлаждение ледяной водой. Далее к реакционному раствору добавляют карбонат калия (5,6 г). После перемешивания смеси при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь выливают в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия и экстрагируют хлороформом. Хлороформовый слой промывают 1 н. соляной кислотой и сушат над безводным сульфатом натрия, а затем растворитель удаляют при пониженном давлении. Затем полученный остаток обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, используя смешанный растворитель хлороформ-метанол = 100:1 в качестве элюента, до получения указанного в заглавии соединения (3,1 г).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6-2,1 (4H, м), 2,36 (2H, т, J=6,8 Гц), 3,13 (2H, м), 3,66 (3H, с), 4,09 (2H, м), 4,78 (IH, д, J=7,8 Гц), 7,2-7,5 (6H, м), 7,63 (2H, м).

Сравнительный пример 5. Получение диметил-N-(индолин-5-карбонил)-L-L--аминоадипата.

К 30% раствору бромистого водорода в уксусной кислоте (15 мл), содержащему 1,5 г анизола, добавляют соединение (1,5 г) сравнительного примера 4, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 часов. Затем, когда к реакционной смеси добавляют большие количества эфира, в осадок выпадает красновато-коричневый маслянистый продукт. Почти весь эфирный слой удаляют, а маслянистый суспендируют в хлороформе. Полученную суспензию промывают затем насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, а слой хлороформа собирают разделением. Слой хлороформа сушат над сульфатом натрия, а растворитель удаляют при пониженном давлении до получения указанного в заглавии соединения (960 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6 - 2,1 (4H, м), 2,36 (2Y, т, J=6,8 Гц), 3,07 (2H, м), 3,66 (3H, с), 3,66 (2H , м), 3,77 (2H, c), 4,78 (IH, м), 6,62 (2H, м), 7,54 (2H. м).

Пример 3. Получение диметил-N-[-((2,4-диамино-6-птеридинал) метил)-индолин-5-карбонил]-L- -аминоадипата.

В 20 мл диметилацетамида суспендируют соединение (960 мг) сравнительного примера 5, аддукт 6-бромметил-2,4- диаминотеридингидробромида изопропанола (1140 мг), полученную суспензию перемешивают при 50-60^oC в течение 6 ч. После охлаждения полученную смесь выливают в насыщенный водный раствор бикарбоната натрия, целевой продукт экстрагируют хлороформом, разделенным на три порции. Органический слой сушат над сульфатом натрия, растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный остаток помещают в колонку с силикагелем, используя в качествен элюента смешанный растворитель хлороформ-метанол = 100:10, до получения указанного в заглавии соединения (520 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6 - 2,1 (4H, м), 2,38 (2H, т, J=6,8 Гц), 3,07 (2 H, м), 3,57 (2H, м), 3,67 (3H, с), 3,78 (3H, с), 4,53 (2H, с), 4,74 (IH, м), 6,52 (IH, д, J=8,33 Гц), 7,01 (IH, д, J=7,8 Гц), 7,57 (2H, м), 8,77 (IH, с).

Пример 4. Получения N-[-((2,4-диамино-6-птеридинил) метил)индолин-5-карбонил]-L- -аминоадипиновой кислоты.

Соединение (400 мг) 3 растворяют в этаноле (22 мл) 1н. водный раствор гидроксида натрия (3,1 мл) добавляют к раствору при 35^oC, и полученную смесь перемешивают при той же температуре в течение 4 ч. После продолжения перемешивания при 25^oC в течение дальнейших 20 ч к реакционной смеси добавляют 3 мл воды, а реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении досуха. Во время процесса сушки внешнюю температуру контролируют, чтобы она не превышала 30^oC. Желтоватый твердый материал, полученный при этом, растворяют в воде (10 мл), и полученный раствор доводят до pH 3,7 1н. соляной кислотой и оставляют выстаиваться в холодильнике в течение 2 ч. Образовавшийся осадок собирают фильтрованием до получения указанного в заглавии соединения (320 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,4 - 1,9 (4H, м), 2,23 (2H, т, J=6,8 Гц), 3,01 (2H, м), 3,58 (2H, м), 4,32 (IH, м), 4,55 (2H, с), 6,69 (IH, д, J=8,3 Гц), 7,63 (2H, м), 8,10 (IH, д, О=8,3 Гц), 8,72 (IH, с).

Сравнительный пример 6. Получение N -(1-карбобензоксииндолин- 5-карбонил) N - бензоил-L-орнитинового метилового сложного эфира.

К тионилхлориду (1,5 мл) добавляют 1-карбобензоксииндолин-5- карбоновую кислоту (180 мг) до получения суспензий, к ней добавляют каталитическое количество диметилформамида. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем полученную смесь выпаривают досуха. Полученный твердый материал растворяют в дихлорметане (4 мл), и к этому раствору добавляют N -бензоил-L-орнитиновый метиловый эфир ( 150 мг) и 750 мг карбоната калия, 4 мл воды, и полученную смесь интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Затем реакционную смесь выливают в воду, экстрагируют хлороформом, и слой хлороформа промывают раствором 1н. соляной кислоты и сушат над сульфатом натрия. Растворитель удаляют при пониженном давлении, а полученный остаток наносят на силикагель и хроматографируют, используя в качестве элюента смесь хлороформ-метанол = 100:3, до получения указанного в заглавии соединения (140 кг).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6 - 2,2 (4H, м), 3,15 (2H, т, J=8,8 ГЦ), 3,56 (2 H, м), 3,78 (3H, с), 4,10 (2H, т, J=8,8 Гц), 4,82 (IH, м), 5,27 (2H, с), 6,70 (IH, м), 6,89 (IH, м), 6,89 (IH, д, J-8,8 Гц), 7, (8H, м), 7,80 (2H. м).

Сравнительный пример 7. Получение N -(индолин-5-карбонил)- N -бензоил-L-орнитинового метилового эфира.

Соединение (140 мг) сравнительного примера 6 добавляют к 30% раствору бромистого водорода - уксусной кислоты (2 мл), содержащему фенол (150 мг), и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Затем, когда большое количество эфира добавляют к реакционному раствору, в осадок выпадает красновато-коричневый продукт. Почти весь эфирный слой удаляют, а маслянистый продукт суспендируют в хлороформе. Полученную суспензию промывают насыщенным водным раствором бикарбонатом натрия, и экстрагируют хлороформом. Слой хлороформа сушат над сульфатом натрия, и растворитель удаляют при пониженном давлении до получения указанного в заглавии соединения (50 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6 - 2,1 (4H, м), 3,02 (2H, т, H=8,8Гц) 3,56 (2H, м), 3,62 (2H, т, H=8,8 Гц), 3,75 (3H, с), 4,79 (IH, м), 6,55 (IH, д, J=7,8 Гц), 6,86 (2H, м), (2H, м), 6,99 (IH, м), 7,1 - 7,6 (5H, м), 7,82 (1H, м).

Пример 5. Получение N -[-((2,4-диамино-6-птеридилин)метил] индолин-5-карбонил]- N -бензоил-L-орнитинового метилового эфира.

В 1 мл диетилацетамида суспендируют соединение (50 кг) сравнительного примера 7, аддукт 6-бромметил-2,4-диаминоптеридингидробромида изопропанола (44 мг), и полученную смесь перемешивают при температуре 50-55^oC в течение 4 ч. После охлаждения к реакционной смеси добавляют 3 мл воды, содержащей триэтиламин (22 мг), и полученную смесь экстрагируют хлороформом. После того как хлороформовый слой сушат над сульфатом натрия, растворитель удаляют при пониженном давлении, а остаток обрабатывают хроматографически на силикагеле, используя в качестве элюента смешанный растворитель хлороформ-метанол = 10: 1. до получения указанного соединения (34 мг).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6 - 2,2 (4H, м), 3,07 (2H, т, J=8,8 Гц), 3,50 (2H. м), 3,56 (2H, т, J=8,8 Гц), 3,79 (3H, с), 4,53 (2H, с), 4,76 (IH, с), 6,52 (IH, д, J=8,3 Гц), 7,19 (IH, д, J=7,6 Гц), 7,45 (3H, м), 7,62 (2H, м), 7,80 (2H, м), 8,76 (IH, с).

Пример 6. Получение N -[1-[(2,4-диамино-6-птеридинил)метил) индолин-5-карбонил]- N -бензоил-L-орнитидина.

В 5 мл этанола растворяют соединение (34 мг) примера 5, к этому раствору добавляют 1н. водный раствор гидроксида натрия (0,1 мл), и полученную смесь перемешивают при 35^oC в течение 4,5 ч. После перемешивания в течение 20 ч при 25^oC к реакционной смеси добавляют 1 мл воды, и реакционную смесь выпаривают досуха при пониженном давлении. Во время этой процедуры внешнюю температуру регулируют таким образом, чтобы она не превышала 30^oС. Получают желтоватый твердый продукт и его растворяют в 5 мл воды, а pH раствора доводят до 3,7, добавляя 1н. соляную кислоту и оставляя выстаиваться в холодильнике в течение 2 ч. Выпавший осадок собирают фильтрованием до получения указанного в заглавии соединения (26 мг).

¹H-ЯМР (DMCO-d₆, ): 1,64 (2H, м), 1,83 (2H, м), 2,98 (2H, т, J = 8,3 Гц), 3,57 (2H, т, J = 8,3 Гц), 4,36 (2H, м), 4,53 (2H, с), 6,64 (2H, м), 7,45 (3H, м), 7,59 (2H, м), 7,82 (2H, м), 8,12 (1H, д, J = 8,6 Гц), 8,43 (1H, м), 8,69 (1H, с).

T.плавления 179-183^oC (с разложением) Сравнительный пример 8. Получение N -фталоил- N -карбобензоксиорнитинового метилового эфира.

2,45 г фталевого ангидрида добавляют к 70 мл дихлорметановому раствору N -карбобензокси-L-орнитина (2,0 г), а затем к этой смеси добавляют 70 мл воды и 1,12 г карбоната калия, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 часов. Полученную смесь конденсируют до 60 мл при пониженном давлении и pH устанавливают 3 с помощью 1н. соляной кислоты. Выпавшие осадки собирают фильтрованием и сушат в вакууме. Полученные белые кристаллы растворяют в метаноле с малым содержанием воды (80 мл), и полученный раствор охлаждают до -30^oC и перемешивают в течение 10 минут. Затем медленно прикапывают 2 мл тионилхлорида при той же температуре. Реакционной смеси дают медленно нагреться до комнатной температуры и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Растворитель удаляют при пониженном давлении, а полученный остаток обрабатывают хроматографически на силикагеле, используя в качестве элюента смесь хлороформ-метанол = 100:1, до получения указанного в заглавии соединения (2,16 г).

¹H-ЯМР (CDCl₃, ): 1,6 - 2,0 (4H, м), 3,69 (5H, м), 4,20 (1H, м), 5,096 (2H, с), 5,70 (1H, м), 7,29 (5H, м), 7,66 (2H, м), 7,81 (2H, м).

Сравнительный пример 9. Получение N -фталоилорнитинового метилового эфира.

После добавления 500 мг 10% палладия на угле к метанольному раствору (100 мл) соединения (2,16 г) сравнительного примера 8 полученную смесь перемешивают в атмосфере водорода при комнатной температуре в течение 20 ч. Палладий на угле удаляют фильтрованием, используя целит, и полученный растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывают на хроматографической колонке с силикагелем, используя в качестве элюента смесь хлороформ-метанол = 100: 3