Аналог инсулина, обладающий активностью снижения уровня глюкозы в крови

Аналог инсулина, обладающий активностью снижения уровня глюкозы в крови

Реферат

 

Использование: в медицинской практике для снижения уровня глюкозы в крови. Сущность изобретения: аналоги инсулина, модифицированные в положении 29 его цепи и при желании в других положениях, имеют модифицированные физико-химические и фармокинетические свойства. 6 з.п. ф-лы, 5 табл., 31 ил.

Изобретение касается аналогов инсулина, модифицированного в положении 29 аминокислоты B-цепи естественного человеческого инсулина и при желании в других положениях. Эти аналоги инсулина в меньшей степени склонны к димеризации или самопроизвольной ассоциации с более высокомолекулярными формами, в результате чего они более быстро повышают свою активность, сохраняя при этом биологическую активность естественного человеческого инсулина.

Изобретение охватывает аналоги инсулина формулы (I), приведенной на фиг. 1, в которой A21 представляет собой аланин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глутамин, глутаминовую кислоту, глицин, треонин или серин; B1 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту или отсутствует; B2 представляет собой валин или может отсутствовать при отсутствии B1; B3 представляет собой аспарагин или аспарагиновую кислоту; B9 представляет собой серин или аспарагиновую кислоту; B10 представляет собой гистидин или аспарагиновую кислоту; B28 представляет собой любую аминокислоту; B29 представляет собой L-пролин, D-пролин, D-оксипролин, L-оксипролин, L-(N-метиллизин), D-линиз, L-(N-метиларгинин) или D-аргинин; B30 представляет собой аланин, треонин или отсутствует; Z представляет собой -OH, -NH₂, -COH₃ или -CH₂CH₃; X представляет собой Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys, Lys-Arg или отсутствует; Y может присутствовать лишь тогда, когда присутствует X, и если он присутствует, то представляет собой Glu или аминокислотную последовательность, которая содержит всю или часть последовательности -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Ary, который начинается у N-терминального Glu этой последовательности.

Описан и заявлен также способ лечения гипергликемии путем ввода в организм пациента, нуждающегося в таком лечении, эффективного количества аналога инсулина формулы (I). Кроме того, описаны и заявлены фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество аналога формулы (I) в комбинации с одним или несколькими фармацевтически пригодными эксципиентами.

На фиг. 2 изображены ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pKC283; на фиг. 3 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pKC283PX; на фиг. 4 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pKC283-L; на фиг. 5 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pKC283-LB; на фиг. 6 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pKC283-PRS; на фиг. 7 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pL32; на фиг. 8 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pNM789; на фиг. 9 схематически представлено построение плазмиды 120; на фиг. 10 изображены ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pL47; на фиг. 11 - ограничительная точка и функциональная карта плазмида pPR12; на фиг. 12 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pPR12AR1; на фиг. 13 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pL110; на фиг. 14 и 15 схематически представлено построение плазмиды pL110C; на фиг. 16 изображены ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pCZR126S; на фиг. 17 показана нуклеотидная последовательность гена синтезированного человеческого проинсулина; на фиг. 18 изображены ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pPB145; на фиг. 19 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pRB164A; на фиг. 20 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pRB172; на фиг.21 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pRB173; на фиг. 22 - ограничительная точка и функциональная карта плазмиды pRB175.

Формула (I) воспроизводит с помощью сокращенных названий аминокислотную последовательность аналогов инсулина, отвечающих данному изобретению. Сокращенные названия аминокислот могут быть расшифрованы, как указано ниже.

Аббревиатура - Аминокислота Aba - Аминомасляная кислота Ala - Аланин Arg - Аргинин Asn - Аспарагин Asp - Аспарагиновая кислота Cys - Цистеиновая кислота Cys - Цистеины Gln - Глутамин Glu - Глутаминовая кислота Gly - Глицин His - Гистидин Il - Изолейцин Leu - Лейцин Lys - Лизин Met - Метионин Nle - Норлейцин Nva - Норвалин Orn - Орнитин Phe - Фенилаланин Pro - Пролин Ser - Серин Thr - Треонин Trp - Триптофан Tyr - Тирозин Val - Валин B28 может представлять собой любую аминокислоту природного или неприродного происхождения. Эта аминокислота является предпочтительно аспарагиновой кислотой, валином, лейцином, изолейцином, норлейцином, пролином, аргинином, гистидином, цитруллином, орнитином, лизином, фенилаланином, аланином или глицином. Из указанных выше аминокислот особенно предпочтительной подгруппой является аспарагиновая кислота, валин, лейцин, изолейцин, норлейцин, пролин, аргинин, гистадин, орнитин или лизин. Лизин является самой предпочтительной аминокислотой для B28. B29 представляет собой предпочтительно L-пролин, D-пролин, D-оксипролин или L-оксипролин. Особенно предпочтительным аналогом инсулина согласно изобретению является такой, в котором B28 представляет собой лизин и B29 представляет собой пролин, то есть инверсию аминокислотной последовательности естественного человеческого инсулина в положениях 28 и 29 B-цепи.

Согласно следующей особенности изобретения, как указывалось выше, когда B28 представляет собой L-пролин, то положение B29 представляет собой предпочтительно L-(N-метиллизин), L-лизин, L-(N-метиларгинин) или L-аргинин. Предпочтительным аналогом согласно данной особенности является такой, в котором B28 представляет собой L-пролин и B29 представляет собой L-(N-метиллизин) или D-лизин.

Ниже рассматриваются также другие модификации аналогов инсулина согласно изобретению, то есть модификации аналогов инсулина в положениях иных, чем положения B28 и B29. В частности, может быть желаемой замена группы Asn в положении 21 цепи A (то есть карбоксильной концевой группы) группами Ala, Asp, Gln, Glu,Gly, Thr или Ser, и при такой замене предпочтительной замещающей группой является Ala. Аналогично этому может быть желательной замена группы в положении 3 цепи B аспарагиновой кислотой (Asp). Такие возможные замены приводят к увеличению стабильности аналогов при экстремальных значениях pH, поскольку Asn особенно чувствителен к реакциям деамидирования и перегруппировки как при низком, так и при высоком значении pH. Для специалистов в данной области должно быть ясно также, что глутаминовые группы аналогов инсулина могут быть одинаковым образом чувствительны к реакциям деамидирования и перегруппировки. Таким образом, замещение их глутаминовой кислотой также охватывается объемом настоящего изобретения. Возможные другие модификации аналогов инсулина согласно изобретению включают (в любой комбинации) замену гистидиновой группы в положении B10 аспарагиновой аминокислотой, замену фенилаланиновой группы в положении A1 аспарагиновой кислотой, замену треониновой группы в положении B30 аланином, замену сериновой группы в положении B9 аспарагиновой кислотой, делецию аминокислот в положении B1 (des-B1) либо как таковых, либо в комбинации с делецией в положении B2 (des-B2) и делецию треонина из положения B-30 (des-B30).

Аналоги инсулина согласно изобретению могут быть также модифицированы в концевых положениях B30 путем ввода любых из следующих аминокислот или дипептидов: Arg, Arg-Arg, Lys, Lys-Lys, Arg-Lys или Lys-Arg. В случае их присутствия они обозначаются в формуле (I) как X. Предпочтительным из них является Arg-Arg.

Кроме того, в случае наличия этих добавленных звеньев в положении B30 аналог может быть дополнительно модифицирован путем добавления к образуемой B30-удлиненной концевой группе глутаминовой кислоты (Glu) или аминокислотной последовательности, включающей всю или часть последовательности -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala- Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-, которая начинается в ее N-терминальной - Glu. Эта аминокислота или последовательность в случае ее присутствия обозначена в формуле (I) группой Y. Когда эта последовательность представляет лишь часть указанной выше, то она может представлять собой любую их тех частей, которые начинаются у N-конца данной последовательности, то есть у группы глутаминовой кислоты (Glu).

X или комбинация X и Y, которые определены выше, представляет собой полностью или часть соединяющего пептида, обнаруживаемого в человеческом проинсулине, молекуле, которая является биологическим источником образования естественного человеческого инсулина.

Предпочтительными последовательностями для Y являются -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala- Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-; -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala- Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Les-; Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Glu-Pro-Leu-Ala- Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-; -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala- Leu-Glu-; -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-; -Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-.

Кроме того, независимо от того, присутствует или отсутствует X отдельно или присутствуют или отсутствуют X и Y совместно, концевая группа Z может быть любой из числа следующих: -OH -NH₂ -OCH₃ или -OCH₂CH₃. Предпочтительным значением группы Z является -OH.

Как уже упоминалось выше, изобретение охватывает фармацевтически пригодные соли аналогов инсулина. Такими предпочтительными солями являются соли цинка, натрия, калия, магния и кальция.

Аналоги инсулина, отвечающие данному изобретению, могут быть получены одним из известных приемов синтеза пептидов, включая классические способы (в растворе), способы в твердофазных системах, способы полусинтеза и известные с недавнего времени способы рекомбинантной ДНК.

В способах с использованием твердофазных систем аминокислотная последовательность составляется из исходной нерастворимой C-терминальной аминокислоты со смоляным носителем. Эти твердофазные способы описываются T.Stewart и др. Твердофазный синтез пептидов. Freeman and Co., Сан-Франциско, 1969 г.

Обычно при осуществлении твердофазного способа аминокислота, соответствующая C-терминальной аминокислотной группе желаемого пептида, закрепляется на смоляном носителе и далее формируется пептидная цепь, начинающаяся с нанесенной на смолу C-терминальной аминокислоты. Отдельные аминокислоты вводятся последовательно до тех пор, пока не получается желаемая аминокислотная последовательность. Как возможный вариант могут быть получены небольшие пептидные фрагменты, которые могут быть введены в пептидную цепь в желаемом порядке. Пептидная цепь остается скрепленной со смолой в процессе синтеза, и по завершении построения цепи данный пептид отщепляется от смолы.

Пептидная цепь закрепляется с полистирольной смолой посредством сложноэфирной связи, образующейся между карбоксильной группой C-терминального звена и специфической метиленовой группой, присутствующей в смоляной матрице, являющейся точкой такого скрепления.

Аминокислоты связываются сопряженными связями хорошо известными в данной области приемами образования пептидных связей.

Один такой прием заключается к конверсии аминокислоты в производное, которое придает карбоксильной группе более высокую чувствительность к реакции со свободной N-терминальной аминогруппой пептидного фермента. Так, например, аминокислота может быть превращена в смешанный ангидрид путем реакции защищенной аминокислоты с этилхлорформатом, фенилхлорформатом, вторбутилхлорформатом или изобутилхлорформатом. Как возможный вариант аминокислота может быть превращена в активный сложный эфир, такой как 1,4,5-трихлорфениловый сложный эфир, пентахлорфениловый сложный эфир, пара-нитрофениловый сложный эфир, N-оксисукцинимидный сложный эфир или сложный эфир, образуемый из l-оксибензотриазола.

Другой прием сопряжения заключает в себе использование подходящего агента, такого как N,N'-дихлоргексилкарбодиимид (ДСС) или N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIC). Другими подходящими сопрягающими агентами являются соединения, которые уже известны для специалистов в данной области (см. работу Schroder и Lubke "Пептиды", Academic Press, 1965 г. Глава III).

Следует иметь в виду, что -аминогруппа каждой аминокислоты, используемой в синтезе пептидов, должна быть защищена в ходе реакции сопряжения для предотвращения побочных реакций, в которых принимает участие -аминовая функциональная группа. Следует также иметь в виду, что некоторые аминокислоты содержат боковые цепи, являющиеся функциональными группами (например, сульфгидрил, -амино, - и - карбоксил, имидазол, гуанидино и гидрокси), и что такие функциональные группы также должны быть защищены в начальном и в последующих этапах реакции сопряжения. Подходящие защитные группы известны в данной области (см. , например, публикацию "Защитные группы в органической химии". M.McOmie. Ред. Plenum Press, N 4, 1973, и патент США N 4617149).

При выборе типа защитной группы следует соблюдать определенные условия. Защитная для -амино группа должна придавать функциональной - аминогруппе инертность в условиях, имеющих место в реакции сопряжения, должна быть легко удаляемой после реакции сопряжения в таких условиях, в которых не удаляются защитные группы боковой цепи, не должна изменять структуру пептидного фрагмента и должна исключать возможность рацемизации при активации непосредственно перед реакцией сопряжения. Защитная группа боковой цепи должна придавать этой функциональной боковой цепи инертность в условиях, используемых при протекании реакции сопряжения, должна быть устойчивой в условиях, имеющих место при удалении защитной для - амино группы, и должна легко удаляться по завершении построения желаемой аминокислотной последовательности в таких условиях реакции, которые не изменяют структуру пептидной цепи.

Для специалистов в данной области должно быть ясно, что защитные группы, которые уже известны как группы, применяемые для синтеза пептидов, будут по разному активны к агентам, используемым для их удаления. Так, например, некоторые защитные группы, такие как трифенилметил и 2-(пара-бифенил)изопропилоксикарбонил, очень неустойчивы и могут расщепляться в слабо кислотных условиях. Другие защитные группы, такие как трет-бутилоксикарбонил, трет-аминоксикарбонил, адаматнилоксикарбонил и пара-метоксибензилоксикарбонил, менее устойчивы и требуют использования умеренно сильных кислот, таких как трифторуксусная кислота, соляная кислота или трифтор бора в уксусной кислоте, для их удаления. Некоторые защитные группы, такие как бензилоксикарбонил, галоилбензилоксикарбонил, пара-нитробензилоксикарбонил, циклоалкилоксикарбонил и изопропилоксикарбонил, еще менее устойчивы и для их удаления требуется использование еще более сильных кислот, таких как фтористоводородная кислота, бромистоводородная кислота или трифторацетат бора в трифторуксусной кислоте.

По завершении желаемого построения последовательности пептида защищенный пептид должен быть отщиплен от смоляного носителя и все защищающие группы должны быть удалены. Реакция отщепления и удаление защитных групп могут осуществляться одновременно или поэтапно. Когда смоляной носитель представляет собой хлорметилированную полистироловую смолу, то связь, скрепляющая пептид со смолой, является сложноэфирной связью, образуемой между свободной карбоксильной группой C-терминального звена и одной из многих хлорметильных групп, присутствующих в смоляной матрице.

Следует иметь в виду, что указанная скрепляющая связь может быть расщеплена посредством реагентов, которые, как известно, способны разрывать сложноэфирную связь и проникать в смоляную матрицу. Особенно легко осуществимым способом является обработка жидким безводным фтористым водородом. Этот реагент не только отщепляет пептид от смолы, но и удаляет все защитные группы. Следовательно, использование этого реагента может обеспечить получение полностью лишенного защиты пептида. Когда желательно удаление пептида без удаления защитных групп, то защищенный пептид - смола может подвергаться метанолизу, в результате чего получается защищенный пептид, в котором C - терминальная карбоксильная группа подвергнута метилированию. Этот сложный метиловый эфир затем может быть гидролизован в слабо щелочных условиях, и в результате будет получен свободный C-терминальный карбоксил. Защитные группы пептидной цепи могут быть удалены путем обработки сильной кислотой, такой как жидкая фтористоводородная кислота. Особенно интересный способ метанолиза описывается в работе G.Moore и др. Пептиды. Труды 5-го Американского симпозиума по пептидам. M.Goodman и J.Meinhofer, ред. John Wiley, N 9., 1977 г., с. 518-521, где замещенный пептид-смола обрабатывается метанолом и цианидом калия в присутствии простого кроун-эфира.

Следующий способ отщепления защищенного пептида от смолы заключается а аминолизе или обработке гидразином. При желании образуемый C-терминальный амид или гидразид может быть гидролизован до свободного C-терминального карбоксила, и защитные группы могут быть удалены общепринятым образом.

Следует также иметь в виду, что защитные группы, находящиеся у N-терминальной -аминогруппы, удаляются предпочтительно либо до, либо одновременно с отщеплением защищенного пептида от смоляного носителя.

A- и B-цепи аналогов инсулина, отвечающие данному изобретению, также могут быть получены методом рекомбинантной ДНК. При этом получается нуклеотидная последовательность, кодирующая желаемый пептид A- или B- цепи, с использованием общепринятой технологии для такого синтеза. Эти методы обычно заключают в себе получение олигонуклеотидов, кодирующих как фрагменты желаемой кодирующей последовательности, так и их полную последовательность. Олигонуклеотиды обеспечивают перекрытие одного фрагмента кодирующей последовательности двумя фрагментами дополняющей последовательности и наоборот. Эти олигонуклеотиды конъюгируют и связываются с образованием в конечном итоге желаемой генной последовательности.

Эта последовательность вставляется в клонирующий вектор в точке, которая допускает возможность выражения пептидного продукта, который он кодирует. Подходящий клонирующий вектор заключает в себе, по меньшей мере, часть контрольной последовательности выражения гена.

Цепи A и B аналогов инсулина согласно изобретению могут быть также получены посредством исходной молекулы проинсулинового типа с использованием методов рекомбинантной ДНК (см. Frank и др. Пептиды: Синтез - Структура - Функции. Труды 7-го Американского симпозиума по пептидам. Ред. D.Rich и E. Gross (1981 г.).

Однако этап комбинирования отдельных получаемых цепей A и B может осуществляться способом, описанным в работе Chance и др., Пептиды: Синтез, структура и функции. Труды 7-го Американского симпозиума по пептидам, 1981 г.

Для иллюстрации данного изобретения даются нижеследующие примеры, которые, однако, не служат для ограничения объема изобретения.

Пример 1. Человеческий инсулин Pro (B29), Lys (B28).

A. Получение образованной от рекомбинанты A-цепи.

A-цепь человеческого инсулина получается методом рекомбинантной ДНК путем химического синтеза гена, кодирующего A-цепь, и его выражения в E.Coli. Ген для A-цепи синтезируется из различных тринуклеотидов, синтетические фрагменты, составляющие по длине от дека до пентадекануклеотидов, посредством метода получения блок-фосфотриэфира. Этот ген имеет однониточный когезионный конец для ограничительных эндонуклеаз Eco RI и Bam HI. Вставка его в подходящий выраженный вектор, содержащий -галактозный ген (-gae), приводит к химерной плазмиде, содержащей A-цепь, связанную с геном -gae через метиониновый кодон. Для достижения более высоких уровней выражения используется предпочтительно ген триптофан синтетазы (trp LE') в качестве промотора, а не -gae-ген. Химерная плазмида трансформируется в E.Coli, приводящей в результате к выражению исходного белка (белка предшественника), то есть -gae-met A-цепи (или trp LE'-met A-цепи, когда используется система промотора trp LE'). Обработка исходного белка цианогенбромидом приводит к расщеплению метиониновой связи с получением после очистки A-цепи человеческого инсулина. Окислительный сульфитолиз приводит к образованию S-сульфонированной A-цепи, которая используется для комбинации с B-цепью (S-сульфонат), как описано ниже.

Подробное описание химического синтеза генов для A-человеческого инсулина дается в публикации Crea и др. Proc. Natl., Acad. Sci., США, 75, 57655769, 1978. Для получения полных сведений о выражении в E.Coli химически синтезированного гена для A-цепи человеческого инсулина см. публикацию Goeddel и др. Proc. Natl. Acad. Sci., США, 76, 101-110, 1979.

B. Получение аналога B-цепи [Lys (B28), Pro (B29)].

Для получения сырой пептидиловой смолы используется синтезатор пептида Applied Biosystems 430A (включая модификацию A4). Используется 0,5 ммоль исходной твердофазной смолы (t-BOC-Thr (BZl) OCH₂ Pam смолы) (0,76 ммоль/г0,658 г). Все аминокислоты являются защищенными BOC, и, кроме глутаминовой кислоты и гистидина, все аминокислоты используются непосредственно в том виде, как они получены (то есть в упаковках, содержащих примерно от 2 ммоль защищенной аминокислоты, поставляемых фирмой Applied Biosystems Inc). Глутаминовая кислота и гистидин поставляются фирмой Peptides International Corporation, и они заключаются в такие упаковки, что каждая содержит примерно 2 ммоль желаемой защищенной аминокислоты. После сушки сырой пептидиловой смолы (в вакууме при комнатной температуре в течение ночи) определяется ее вес и сопоставляется с начальным весом для гарантии нужного привеса. Небольшая часть образца подвергается аминокислотному анализу для гарантии того, что желаемые аминокислоты вводятся в точно заданных количествах.

Пептид отщепляется от пептидиловой смолы, и защита с боковой цепи удаляется в результате перемешивания примерно в течение 1 ч при 0^oC в растворе 10 частей (об./вес.) HF (содержащего 5% об./об. этилмеркаптана и 5% об./об. метакрезола) с 1 частью пептидиловой смолы. После вакуумной отгонки большей части HF пептид осаждается в простом этиловом эфире. После нескольких промывок простым этиловым эфиром с последующей вакуумной фильтрацией пептид растворяется примерно в 200 мл 7 М деионизированной воды, содержащей 0,1 моль Трис, 0,1 моль Na₂SO₃ и 0,01 моль Na₂S₄O₆. Величина pH раствора доводится до 8,5 посредством 5 н. NaOH, и этот раствор интенсивно перемешивается в течение ночи при температуре 4^oC.

Образующийся S-сульфонированный пептидный раствор вводится в колонку размерами 5 215 см, наполненную Sephadex G-25 (тонкоизмельченным) при комнатной температуре. Образец элюируется 50 мМ бикарбонатом аммония с расходом его 20 мл/мин при комнатной температуре. Выходящий поток анализируется (при 276 нм). Фракции по 20 мл собираются, и получают объем желаемых фракций, который затем очищается дополнительно методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC), как описано ниже.

Слитные желаемые фракции нагнетаются в колонку 2,5 30 см с Iu Pont C-8, 9-12 мкм (колонка HPLC), и осуществляется элюирование с использованием линейного ингредиента с увеличивающейся концентрацией ацетонитрила в 100 мл бикарбоната аммония при комнатной температуре (2,6 мл/мин). Выходящий из колонки поток анализируется (280 нм). Фракции по 25 мл собираются. Выбранные фракции HPLC подвергаются анализу для определения того, какие фракции остаются. Желаемые фракции собираются, лиофилизируются и используются в последующей комбинации с A-цепью, полученной, как описано выше.

C. Получение человеческого инсульта Pro (B 29), Lys (B 28).

Комбинация цепи A и B осуществляется согласно процедуре, описанной в публикации Chance и др., см. выше. 700 мг S-сульфоната A-цепи, образованного от рекомбинантной ДНК, и 140 мг синтетического S-сульфоната B-цепи Lys (B28), Pro (B29) (оба получены, как описано выше) каждый растворяются в 70 мл и 14 мл соответственно 0,1 М буферного раствора глицина и величина pH каждого доводится до 10,5 посредством 4 н. NaOH, затем они охлаждают до 5^oC. Приготавливается 6 мл раствора дитиотреитола (ДТТ) концентрацией 10,5 мг/мл в 0,1 М глициновом буферном растворе при комнатной температуре, величина pH этого раствора доводится до 10,5 посредством 5 н. NaOH, затем этот раствор охлаждается до 5^oC.

Эти растворы A-цепи и B-цепи смешиваются друг с другом, после чего в эту смесь быстро вводится 5,21 мл раствора ДТТ (SH/SSO₃ = 0,90). Этот реакционный раствор перемешивается при температуре 5^oC в открытых склянках 200-миллилитровых пробирках для центрифуги в течение 2,5 ч при 5^oC. Вводится 45 мл ледяной уксусной кислоты, и раствор выстаивается при температуре 5^oC в течение ночи.

Полученная смесь с осадком центрифугируется в течение 20 мин со скоростью 2000 об/мин при температуре 5^oC. Поверхностный слой смешивается с 1 М уксусной кислотой, промывается от твердых частиц, вводится в колонку 5 200 см с Sephadex G-50 (сверхтонкого) в 1 М уксусной кислоте при 5^oC и элюируется при ускорении силы тяжести. Двадцатиминутные фракции элюирования собираются в течение 3 дн. Эти фракции анализируются (при 276 нм), и некоторые образцы анализируются методами аналитической HPLC. Фракции, содержащие последовательность Lys (B 28), Pro (B 29) аналога инсулина, сливаются и лиофилизируются, давая 125-миллиграммовый образец. Этот образец дополнительно очищается методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC) с обратимой фазой (с использованием колонки 2,12 25 см с Iu Pont C-8 при элюировании при комнатной температуре со скоростью 2,6 мл/мин с использованием линейного градиента с увеличивающейся концентрацией ацетонитрила в 0,1 М NaH₂PO₄, pH 2,2). Выходящий поток анализируется (при 276 нм). Выбранные фракции анализируются аналитическим методом HPLC. Желаемые фракции собираются и дополнительно очищаются с использованием pH 7 HPLC, как описано ниже.

Слитный продукт от HPLC низкого pH разбавляется примерно в два раза в ледяной бане 0,1 М (NH₄)₂HPO₄. Величина pH доводится до 7 посредством холодной 3 н. NaOH в ледяной бане. Этот образец вводится в ту же колонку и элюируется из нее в тех же условиях, что и при приготовлении образца с низким pH, с той разницей, что элюирующий буферный раствор в данном случае представляет собой 0,1 М (pH 7) (NH₄)₂HPO₄/ацетонитрил.

Слитный продукт от HPLC с pH 7 быстро охлаждается в ледяной бане и в два раза разбавляется 0,1%-ным водным раствором трифторуксусной кислоты (TFA). Вводится 1 н. HCl (холодная, образец в ледяной бане) для снижения величины pH до 3. Образец вводится в колонку Vydae C4 или, как возможный вариант, в колонку с Iu Pont C-8 HPLV (2,12 25 см), и осуществляется элюирование линейным градиентом с повышающейся концентрацией ацетонитрила в 0,1%-ном водном растворе TFA. Выходящий из колонки продукт анализируется (при 214 или 276 нм). Желаемые фракции сливаются и лиофилизируются, давая образец в количестве 41 мг желаемого аналога со степенью чистоты более 97 %, достигаемой путем HPLC с обратимой фазой.

Пример 2. Человеческий инсулин Pro (B29), Lys (B28).

Второй способ получения человеческого инсулина Pro (B29), Lys (B28) заключается в использовании ферментного полусинтеза (обратимый протеолиз) для комбинирования des- октапептидного инсулина (A_1-21-B_1-22) с синтетическим октапептидом. des-Октапептидный инсулин получается в результате триптического переваривания естественного свиного или человеческого инсулина, как описано в работе Bromer и Chance "Получение и свойства les-октапептид-инсулина", Biochem. Biophys Acta 133, 219-223, (1967 г). Синтетический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Tyr-Lys-Pro-Thr получается методом автоматического твердофазного синтеза так, как описано выше.

les-октапептидный инсулин (435 мг) и синтетический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr (465 мг) смешиваются в 15 мл раствора, содержащего 1 часть диметилсульфоксида, 2 части 1,4-бутандиола и 1 часть 0,25 М буферного раствора Трис-ацетата, pH 7,3. Пептиды полностью растворяются путем нагревания раствора на горячей плите. Затем раствор инкубируется при 37^oC и добавляется 90 мг свиного трипсина. Раствор время от времени перемешивается в течение 90 мин при температуре 37^oC. Реакция прекращается путем смешивания раствора с 135 мл 0,05 н. HCl.

Указанный в названии аналог инсулина очищается путем ввода подкисленного раствора, содержащего этот аналог, в колонну HPLC размерами 2,5 25 см, наполненную C-8 Zorbax, и элюирования линейным градиентом с повышающейся концентрацией ацетонитрила в буферном растворе 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 2,2. Выходящий на колонки продукт анализируется (при 276 нм). Желаемые фракции сливаются, в два раза разбавляются водой и вводится в колонку HPLC размерами 1 25 см с C-8 Ultrasphere. Этот аналог элюируется линейным градиентом с увеличивающейся концентрацией ацетонитрила в 0,5%-ном водном растворе TFA. Выходящий из колонки продукт анализируется (при 276 нм). Желаемые фракции снова сливаются и лиофилизируются, давая 125 мг очищенного аналога. Данная структура подтверждается аминокислотным анализом (табл. 1) и масс-спектроскопией (MS). MS: 5809,2 (теоретически: 5808,7).

Осуществляется анализ методом быстрой атомной бомбардировки - масс-спектроскопии с использованием масс-спектрометра с двойной фокусировкой VG-AB-25E, с разрешением примерно 1500. Аналоги человеческого инсулина растворяются в смеси глицерина и триглицерина с содержанием щавелевой кислоты. Для калибровки измерительного прибора, который осуществляет магнитное сканирование в диапазоне от m/Z 5300 до m/Z 6500, используется иодид цезия. Полученные данные представлены как среднемассовое значение +1.

Пример 3. Человеческий инсулин Pro (B29), Aba (B28).

Свиной des-октапептидный инсулин (384 мг) и синтетический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Aba-Pro-Thr (362 мг) смешиваются в 13 мл раствора, содержащего диметилсульфоксид, 2 части 1,4-бутандиола и 1 часть буферного раствора 0,25 М Трис, pH 7,3, при температуре 37^oC. Вводится свиной трипсин (75 г). Раствор тщательно смешивается и время от времени перемешивается в течение 120 мин при 37^oC.

В этот момент времени реакция прекращается в результате ввода этой смеси в 137 мл 0,05 н. HCl. Весь этот раствора вводится в колонку размерами 21 250 мм с C-8 Zorbax, и продукты элюируются при небольшом ацетонитриловом градиенте в буферном растворе 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 2.

Соответствующие фракции, которые определены методом аналитической HPLC, сливаются, в два раза разбавляются водой и вводятся в колонку 25 300 мм с C-18 Vydae. Желаемый белок элюируется из колонки ацетонитрильным градиентом в 0,05%-ной трифторуксусной кислоте. Фракции, содержащие очищенный аналог инсулина, сливаются и лиофилизируются с получением выхода 59 мг. Указанная структура подтверждается аминокислотным анализом (табл. 1) и масс-спектроскопией (MS). MS: 5765,7 (теоретически: 5765,6).

Пример 4. Человеческий инсулин Pro (B 29), Ala (B28).

Свиной des-октапептидный инсулин (290 мг) и систематический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Ala-Pro-Thr (310 мг) смешиваются в 10 мл раствора, содержащего 1 часть диметилсульфоксида, 2 части 1,4-бутандиола и 1 часть буферного раствора 0,25 М Трис, pH 7,3. Вводится свиной трипсин (60 мг). Раствор тщательно смешивается и время от времени перемешивается в течение 60 мин при 37^oC. В этот момент времени реакция прекращается за счет ввода смеси в 90 мл 0,05 н. HCl. Весь раствор вводится в колонку размерами 21 250 мм с C-8 Zorbax, и продукты элюируются в небольшом ацетонитрильном градиенте в буферном растворе 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 2.

Соответствующие фракции, которые определены методом аналитической HPLC, сливаются, в два раза разбавляются водой и вводятся в колонку размерами 10250 мм с C-8 Ultrasphere. Желаемый белок элюируется из колонки с использованием ацетонитрильного градиента в 0,5%-ной трифторуксусной кислоте. Фракции, содержащие очищенный аналог инсулина, сливаются и лиофилизируются с получением выходы 43 мг. Указанная структура подтверждается аминокислотным анализом (табл. 1) и масс-спектроскопией (MS). MS: 5752,3 (теоретически: 5751,6).

Пример 5. Человеческий инсулин Pro (B29), Arg (B28).

Свиной des-октапептидный инсулин (290 мг) и синтетический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Arg-Pro-Thr (310 нг) смешивают в 10 мл раствора, содержащего 1 часть диметилсульфоксида, 2 части 1,4-бутандиола и 1 часть буферного раствора 0,25 М Трис, pH 7,3, при 37^oC. Вводится свиной инсулин (60 мг). Раствор смешивают и время от времени тщательно перемешивается в течение 60 мин при 37^oC.

В этот момент времени реакция прекращается в результате ввода этой смеси в 90 мл 0,05 н. HCl. Весь раствор вводится в колонку размерами 21250 мм с C-8, и продукты элюируются в небольшом ацетонитрильном градиенте в буферном растворе 0,1 М одноосновного фосфата натрия, pH 2.

Соответствующие фракции, которые определены аналитической HPLC, сливаются, в два раза разбавляются водой и вводятся в колонку 10250 мм с C-8 Ultrasphere. Обессоленный белок элюируется из колонки ацетонитрильным градиентом в 0,5%-ной трифторуксусной кислоте. Фракции, содержащие очищенный аналог инсулина, сливаются и лиофилизируются, и получается 103 мг продукта. Указанная структура подтверждается аминокислотным анализом (табл. 1) и масс-спектрометрическим анализом (MS). MS: 5836,1 (теоретически: 5836,7).

Пример 6. Человеческий инсулин Pro (B29), Asn (B28).

Свиной des-октапептидный инсулин (409 мг) и синтетический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asn-Pro-Thr (398 мг) смешиваются в 14 мл раствора, содержащего 1 часть диметилсульфоксида, 2 части 1,4-бутандиола и 1 часть буферного раствора 0,25 М Трис, pH 7,9, при 37^oC. Вводят свиной трипсин (81 мг). Раствор смешивают и время от времени тщательно перемешивают в течение 120 мин при 37^oC. В этот момент времени реакция прекращается за счет ввода смеси в 136 мл 0,5 н. HCl. Весь раствор вливается в колонку 21250 мм с C-8 Zorbax, и продукты элюируются в небольшом ацетонитрильном градиенте в буферном растворе 0,2 М одноосновного фосфата натрия, pH 2.

Соответствующие фракции, которые определены посредством аналитической HPLC, сливаются, в два раза разбавляются водой и вводятся в колонку размерами 25300 мкм с C-18 Vydae. Желаемый белок элюируется из колонки ацетонитрильным градиентом в 0,5%-ной трифторуксусной кислоте. Фракции, содержащие очищенный аналог инсулина, сливаются и лиофилизируются, в результате получается 56 мг продукта. Указанная структура подтверждается аминокислотным аналогом (табл. 1) и масс-спектроскопией (MS). MS: 5794,7 (теоретически: 5794,6).

Пример 7. Человеческий инсулин Pro (B29), Asp (B28).

Свиной des-октапептидный инсулин (400 мг) и синтетический октапептид Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-Pro-Thr (388 мг) смешиваются в 13 мл раствора, содержащего 1 часть диметилсульфоксида, 2 части 1,4-бутандиола и 1 часть буферного раствора 0,25 М Трис, pH 7,3 при 37^oC. Вводится свиной трипсин (78 мг). Раствор тщательно смешивается и время от времени перемешивается в течение 120 мин. при 37^oC.

Реакция прекращается в данный момент времени путем ввода этой смеси в 137 мл 0,05 н. HCl. Весь раствор вводится в колонку 21250 мм с C-8 Zorbax, и продукты элюируются небольшим ацетонитрильным градиентом в буферном растворе 0,1 М одноосновного фосфата натрия pH 2.

Соответствующие фракции, которые определены аналитической HPLC, сливаются, разбавляются в четыре раза водой и вводятся в колонку размерами 25300 мм с C-8 Vydae. Желаемый белок элюируется из колонки ацетонитрильным градиентом в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Фракции, содержащие очищенный аналог инсулина, сливают и лиофилизируются, в результате получается 85 мг продукта. Указанная структура подт