Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин

Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин

Реферат

 

Визуализирующий агент может быть использован для обнаружения содержащего фибрин материала, а именно тромба или атеросклеротической бляшки. Агент представляет собой меченный визуализирующим маркером рекомбинантный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную области связывания природного человеческого фибронектина с фибрином. Маркером является радиоактивный изотоп, элемент, непрозрачный для рентгеновских лучей, или парамагнитный ион. Визуализирующий агент применим для раннего обнаружения внутрисосудистых атеросклеротических изменений и тромбов. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 29 ил., 5 табл.

Изобретение относится к диагностике и лечению таких заболеваний, как атеросклероз и тромбоз.

Большинство существующих процедур для диагностики и лечения атеросклероза и тромбоза являются инвазивными, дорогостоящими и имеют ограниченную эффективность у существенной доли пациентов.

Известны методы, в основе которых лежит принцип "усиления" бляшек при помощи красителей, который был предложен Spears, J. и др. (J. Clin. Invest. т. 71, с. 395-399, 1983). Такие красители метят поверхность бляшек флуоресцентным соединением. Abela, G. и др. (Am.J.Cardiol., 50, с. 1199-1205, 1982) предложили разрушение бляшек фотоактивацией производных гематопорфирина, осуществляемой с помощью внутрипросветного передающего излучения лазера, оптического волокна. Кроме того, было также предложено использование тетрациклиновых красителей (Murphy-Chutorian, D. и др., Am. J. Cardiol., т. 55, с. 1293-1297, 1985).

Указанные выше красители выбирают по их способности связываться с компонентами атеросклеротической бляшки. Далее краситель абсорбирует лазерный свет, концентрируя его на окрашенной поверхности. Однако имеет место некоторое окрашивание и здоровой ткани, что приводит к идентификации окружающей ткани как поврежденной.

Предложены несколько экспериментальных подходов для неинвазивного обнаружения тромбов при помощи использования радиофармацевтических агентов, но ни один не получил широкого клинического признания ввиду специфических недостатков, характерных для каждого агента.

Основные характеристики радиофармацевтических агентов для раннего обнаружения внутрисосудистых атеросклеротических изменений и тромбов состоят в следующем: высокое сродство к компонентам тромба; относительно высокая фармакокинетическая скорость очищения крови; безопасность: нетоксичность и неимуногенность; простота получения и использования.

В литературе описаны различные визуализирующие агенты этой категории. Недостатки их состоят в следующем: а) аутогенные тромбоциты, меченные ¹¹¹1п: эта процедура очень трудоемкая, продолжительная по времени, а время очищения крови относительно большое, а именно 2 дня [2]; б) ¹³¹1-фибриноген: анализ основан на сродстве инъектируемого радиомеченного фибриногена относительно тромба, но он не пригоден для испытаний на быструю визуализацию из-за большого времени пребывания в крови, не пригоден для старых тромбов и не может использоваться в присутствии гепарина [3, 36]; в) фрагмент Е1 человеческого фибрина: представляется наиболее подходящим для фибриногена, но его трудно получать в достаточных количествах для широкого клинического применения [4]; г) мышиные антифибриновые моноклональные антитела: являются специфическими и имеют высокое сродство относительно тромба, но характеризуются относительно продолжительным временем очищения крови и потенциально являются иммуногенными для человеческого организма [5, 33, 34]; д) мышиные моноклональные антитела, специфические относительно активированных тромбоцитов [6, 7]: те же недостатки, что в случае г); е) меченый фибронектин [1] (прототип): фибронектин имеет сродство сразу к нескольким материалам, содержащимся в тромбе, но отличается довольно продолжительным временем очищения крови и небольшим содержанием радиоактивности в тромбе. Таким образом, в этой области техники ощущается необходимость в специфических относительно тромбов радиофармацевтических агентах для быстрой визуализации тромба.

В патенте США N 4343734 (Lian и др.) предложены специфические антитела к гамма-карбоксиглютаминовой кислоте (ГЛК), которые могут быть помечены флюоресцирующим агентом для иммунофлюоресцентного окрашивания ткани с целью установления присутствия в ней ГЛК. Специфические ГЛК-антитела связываются с ГЛК, которая содержится в развивающейся атеросклеротической бляшке, имеющей отложения кальция. Lian и др. утверждают, что ГЛК не обнаруживается в некальцинированных бляшках и что ГЛК не обнаруживается в сердечных клапанах и аорте, а также в таких циркулирующих протеинах, как протромбин, факторы свертывающей системы крови VII, IX и X, протеин C и протеин S. Кроме того, антитела, связывающие ГЛК, не обеспечивают селективного связывания с атеросклеротическими бляшками.

Фибронектин является гликопротеином, состоящим из двух идентичных субблоков, каждый из которых имеет мол. м. приблизительно 220000. Человеческими клетками в культуре и in vivo продуцируются и секретируются две основные формы фибронектина [8]. Фибронектин, ассоциированный с клеткой, слабо растворим и принимает участие в адгезии клеток, заживлении ран, дифференцировке клеток и фагоцитозе. Фибронектин плазмы, продуцируемый в основном в печени, является растворимым протеином сыворотки с биологическими свойствами, аналогичными биологическим свойствам клеточного фибронектина.

Фибронектин представляет собой многофункциональный модулятор, так как ограниченное протеолитическое расщепление продуцирует полипептиды с различными активностями. Были получены основные функциональные области молекулы фибронектина при помощи частичного протеолитического переваривания, они включают домены, связывающие гепарин, ДНК, фибрин, коллаген или желатин и клетки [8-13].

Baralle, F. E. в европейской патентной публикации N 207751, опубликованной 7 января 1989 г., описал полную кДНК-последовательность фибронектина. Он также описывает экспрессию слитых белков, содержащих часть связывающей коллаген области фибронектина, и -галактозидазу Escherichia coli. Аналогичные слитые протеины предложены Owens и Baralle [14]. Obara и др. (1987) описана экспрессия части связывающей клетки области человеческого фибронектина, слитой с -галоктозидазой Escherichia coli. Obara и др. также (1988) описывают экспрессию частей связывающей клетки области, слитых с -галактозидазой после предварительного сайт-специфического мутагенеза [16]. Карбокси-конец связывающей фибрин области человеческого фибронектина экспрессировали в L-клетках мыши как протеин слияния с сигнальной последовательностью ингибитора человеческого протеина C [17].

Ни в одной из вышеупомянутых ссылок, однако, не описывается экспрессия N-терминальной части связывающей фибрин области фибронектина; кроме того, все рекомбинантные протеины, которые описаны ранее, являются слитыми протеинами.

В соответствии с изобретением предлагаются визуализирующие агенты на основе полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая по существу соответствует N-терминальной части связывающей фибрин области фибронектина. Эти полипептиды имеют приблизительные мол. м. 31, 20, 18,5 и 12 кД, определенные при помощи маркеров сравнения на SDS-гелях в восстанавливающих условиях. Они обладают следующими характеристиками, которые делают их перспективными фармацевтическими агентами: содержат аминокислотную последовательность, которая содержится в человеческом протеине и, таким образом, является неимуногенной; обладают специфичностью относительно фибрина, которая базируется на их способности к ковалентному перекрестному связыванию в катализируемой транс-глютаминазой реакции с образующимся, а также с образованным ранее тромбом (сгустком); связываются с внеклеточной матрицей, что дает возможность обнаружить атеросклеротические бляшки; обладают относительно коротким периодом очищения крови; включаются в сгустки в присутствии гепарина; продуцируются при помощи рекомбинантных приемов и могут быть, таким образом, получены в больших количествах. Указанные полипептиды для получения визуализирующих агентов метят визуализируемым маркером.

В соответствии с изобретением предлагается недорогой, точный способ визуализации содержащих фибрин материалов, т.е. тромбов и атеросклеротических бляшек как in vitro, так и in vivo. Он включает контактирование содержащего фибрин материала, подлежащего визуализации, с визуализирующим агентом, описанным выше, при таких условиях, что агент связывается с содержащим фибрин материалом, и визуализацию связанного агента, обеспечивающую одновременное обнаружение содержащего фибрин материала.

На фиг. 1-29 описана конструкция плазмид, экспрессирующих полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, по существу соответствующую амино-терминальной части, связывающей фибрин области (FBD) фибронектина. FBD начинается с аминокислоты под номером 1 зрелого фибронектина, которой является глютамин, и соответствует четвертой аминокислоте (Q), представленной на фиг. 2. Таким образом, N-окончанием FBD-последовательности является Q-A-Q-Q-(глютамин-аланин-глютамин-глютамин); соответствующий первый нуклеотид в кДНК-последовательности на фиг. 2 имеет, следовательно, номер 14, указанный стрелкой. Все рекомбинантные FBD-полипептиды, приведенные на фиг. и в тексте описания, нумеруются от этого первого глютамина, а все соответствующие кДНК-последовательности пронумерованы, как это показано на фиг. 2-9.

Определение полипептидов, экспрессируемых в форме 31, 20, 18,5, 12 кД, является оперативным определением, основанным на их приблизительной молекулярной массе, определяемой на SDS-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях путем сравнения с маркерами с известной молекулярной массой.

На фиг. 1 приведено изображение различных областей фибронектина и конструируемых рекомбинантных полипептидов; на фиг. 2-9 - нуклеотидная последовательность кДНК человеческого фибронектина.

На фиг. 10 и 11 получают семь пар химически синтезированных олигомеров. Синтетические олигомеры кодируют первые 153 N-терминальные аминокислоты человеческого фибронектина (FN), на фиг. 10 и 11 приведена последовательность этих 7 пар синтетических олигомеров.

На фиг. 12 представлен ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислоты с 1 по 153 N-терминальной области человеческого FN, составленный из 7 пар химически синтезированных олигомеров, представленных на фиг. 10 и 11. Синтез может быть описан следующим образом.

а) Олигомеры 3/4, 5/6, 7/8 и 9/10 (каждая пара в отдельной пробирке) подвергают отжигу, а затем фосфорированию на 5'-конце, используя фермент Т4-полинуклеотидкиназу.

б) На второй стадии пары 3/4 и 5/6 подвергают лигированию друг с другом, используя ДНК-лигазу Т4. Аналогичным образом реакционные пары 7/8 и 9/10 подвергают лигированию друг с другом. После каждого шага лигирования порцию смеси лигирования анализируют на геле, чтобы определить размер вновь образованных фрагментов и эффективность связывания.

в) На третьей стадии две вышеупомянутые смеси лигирования смешивают вместе, и в смесь добавляют пару 6, олигомеры 11/12, которые предварительно отожгли и фосфорилировали в отдельной пробирке. ДНК-фрагмент из 326 пар оснований, полученный из вышеупомянутой смеси, изолируют из агарозного геля и подвергают очистке.

Очищенный синтетический 326-фрагмент добавляли к двум дополнительным парам синтетических линкеров: пара 1, олигомеры 1/2, и пара 7, олигомеры 13/14. В паре 1 только олигомер 2 фосфорилирован в 5'-конце, а в паре 7 только олигомер 13 фосфорилирован в 5'-конце.

После лигирования ДНК-лигазой Т4 смесь без какой-либо дополнительной изоляции добавляли в ДНК вектора pBR322, переваренную эндонуклеазами EcoRI и BamHI.

Полученная плазмида, обозначенная pFN 932-18, содержала полный синтетический фрагмент EcoRI (5'-конец)-BamHI (3'-конец), кодирующий N-терминальные 153 аминокислоты человеческого FN, в векторе pBR322.

На фиг. 13 представлена экспрессия N-терминальной последовательности из 153 аминокислоты FN.

Плазмиду pFN 932-18 переваривали эндонуклеазами NdeI и BamHI. ДНК-фрагмент NdeI-BamHI, кодирующий FN (первые 153 аминокислоты + дополнительный N-терминальный метионин), изолировали и подвергали лигированию с большим фрагментом, полученным при помощи переваривания плазмиды pTУ301 эндонуклеазами NdeI и BgII. (Плазмида pTУ301 экспрессирует человеческий гормон роста (hGH) при регулировании промотором P_L и RBS CII).

Полученную плазмиду обозначали как pFN 949-2.

На фиг. 14 представлена вставка терминирующего кодона TAA в 3'-конец N-терминальной области FN (в положении, соответствующем аминокислоте 262).

Синтетический олигонуклеотид, содержащий терминирующий кодон TAA и сайт Bgl II, имеющий следующую последовательность: лигировали с 3'-концом (сайт PvuII) EcoRI-PvuII, NF-фрагмента, выделенного из КДНК-плазмиды p931-5, переваренной ферментами EcoRI и PvuII. Лигирование осуществляли в присутствии плазмиды PBR322, переваренной ферментами EcoRI и BamHI (большой фрагмент). Полученную плазмиду обозначали как PFN935-12.

На фиг. 15 представлены рекомбинатные полипептиды областей фибронектина в сравнении с фибронектином полной длины.

Фиг. 15 показывает соотношение кДНК-клонов, кодирующих рекомбинантные полипептиды друг с другом, а также с последовательностью полной длины кДНК-фибронектина и общей схемой доменов, содержащихся внутри молекулы человеческого фибронектина.

На фиг. 16 представлена конструкция плазмиды pFN 196-2, которая экспрессирует полипептид FBD r12 кД.

Большой фрагмент BspMI-HindIII, полученный при помощи переваривания плазмиды PFN 975-25 с использованием BspMI и HindIII, подвергали лигированию с использованием ДНК-лигазы T4 с синтетической парой линкеров A (фиг. 18). Полученную плазмиду PFN 196-2 трансформировали в штамм Escherichia coli A1645, а затем переносили в штамм Escherichia coli A4255. Плазмида PFN 196-2 содержит 5'-терминальную последовательность кДНК-фибронектина от нуклеотида 14 до нуклеотида 340, т.е. она кодирует первые 109 аминокислот FBD-фибронектина, заканчивающиеся аргининовым остатком. В конечном полипептиде содержится дополнительный N-терминальный метионин. Плазмида pFN 196-2 дает хорошую экспрессию FBD-полипептида r12 кД под контролем -промотора и сайта связывания рибосом -лактамазы: она сдана на хранение в ATCC под шифром хранения N 68328.

На фиг. 17 представлена конструкция плазмиды pFN 197-10, которая экспрессирует модифицированный FBD-полипептид 12 кД (12 кД').

Плазмиду pFN 975-25 обрабатывали, как это представлено на фиг. 16, за тем исключением, что использовали другую пару линкеров B (фиг. 18). Лигирование давало плазмиду pFN 197-10, которая кодирует N-терминальную последовательность FBD FN; однако модификация после нуклеотида 340 с целью получения сайта NdeI (CATATG) перед стоп-кодоном приводит к кодированию полипептида, содержащего 111 аминокислот, где первые 109 аминокислот соответствуют аминокислотам полипептида r12 кД, а два дополнительных аминокислотных остатка представлены гистидином и метионином. В конечном полипептиде также содержится дополнительный N-терминальный метиониновый остаток. Плазмиду pFN 197-10 трансформировали в штамм Escherichia coli A1645, а затем в штамм Escherichia coli A4255 и получали хорошую экспрессию модифицированного FBD-полипептида r12 кД (12 кД') под контролем -промотора и связывания рибосом -лактамазы.

На фиг. 18 представлены олигонуклеотидные линкеры, используемые в конструкции плазмид.

Получали две пары химически синтезированных олигомеров (A, B) и использовали их при конструировании плазмид, как это показано на фиг. 16 и 17 соответственно.

На фиг. 19 представлено сравнение меченых FBD-полипептидов r12 кД, r20 кД и r31 кД в модели венозного тромба у крыс.

Столбцы и вертикальные консоли представляют среднее значение средняя стандартная ошибка (N = 5) удельной радиоактивности, ассоциированной с изолированными тромбами (T) или кровью (B) через 24 ч после применения ¹²⁵I-меченых рекомбинантных полипептидов, как это указано.

На фиг. 20 представлено связывание полипептидов области связывания фибрина с фибрином сгустков.

Этот эксперимент осуществляли по существу, как это описано для двухстадийной реакции 11 (пример 6). 0,15 М ¹²⁵I одного из полипептидов области, связывающей фибрин, как это указано выше, инкубировали при 37^oC с предварительно образованными фибриновыми сгустками, полученными из 20 л обработанной цитратом цельной крови. Связывание измеряли в присутствии 5 мМ CaCl₂ и 0,02 единиц/мл транс-глютаминазы. Реакцию прекращали спустя 45 мин инкубирования центрифугированием; осадок промывали три раза с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS), а радиоактивность измеряли в гамма-счетчике.

1. Плазматическая FBD 31 кД (p 31 кД) 2. r12 кД 3. r20 кД 4. r21 кД (Порция A) 5. r31 кД (Порция B) 6. r31 кД (Порция C) На фиг. 21 представлены скручивание и очистка полипептида r20 кД, наблюдаемые при помощи профилей элюирования из колонки типа Superose 12 [соединенной с ЖХВД (жидкостная хроматография высокого давления)].

Порции в 200 л полипептида r20 кД на различных стадиях процедур скручивания и очистки инъецировали в верхнюю часть колонки Superose 12 (соединенной с ЖХВЖ). Колонку уравновешивали и элюировали раствором 150 мМ NaCl (20 мМ Трис HCl, pH 7,8) с объемной скоростью потока 0,8 мл/мин. A. Осадок полипептида r20 кД солюбилизировали в 6 М гуанидин-HCl и восстанавливали 50 мм -меркаптоэтанолом. B. Ренатурировали и окисляли воздухом полипептид r20 кД. C. Полипептиды, отделенные от очищенного r20 кД, связывали с Q-сефарозой. D. Поток через колонку из Q-сефарозы. E. Поток через колонку гепарин-сефарозы материала, отделенного от очищенного r20 кД. F. Очищали полипептид в 20 кД (время удерживания 18,16 мин), элюировали из колонки гепарин-сефарозы при помощи 0,5 М NaCl. Пик со временем удержания 18,16 мин отсутствовал в профиле A, где материал находится в восстановленной форме, а также и в профилях C и E, которые содержат неправильно образованные формы полипептиды в 20 кД.

На фиг. 22 представлены ренатурация и очистка полипептида r12 кД по данным профилей элюирования с колонки Superose 12 (соединенной с системой ЖХВД Уотерз).

Порции в 25 - 100 л полипептида r12 кД на различных стадиях процессов ренатурации и очистки инъецировали в верхнюю часть колонки Superose 12, соединенной с системой ЖХВД Уотерз. Колонку уравновешивали и элюировали раствором 150 мМ NaCl/20 мМ Трис HCl, pH 7,8, с объемной скоростью потока 0,8 мл/мин. A. Осадок полипептида r12 кД солюбилизировали в 6 М гуанидин-HCl и восстанавливали 50 мМ -меркаптоэтанолом. B. Полипептид r12 кД ренатурировали и окисляли воздухом. C. Полипептиды связывали с Q-сефарозой (материалы, которые отделяли от r12 кД). D. Пропускали поток через колонку Q- и гепарин-сефарозы (в этом случае колонки соединяли последовательно и поток через сефарозу автоматически загружался на колонку гепарин-сефарозы). E. Очищали полипептид r12 кД (время удерживания 18,83 мин), элюировали с колонки гепарин-сефарозы 0,5 М раствором NaCl. Пик со временем удерживания 18,83 мин отсутствовал в профиле A, где материал находится в восстановленной форме, а также и в профилях C и D, которые содержат неправильно сформированные формы полипептида r12 кД.

На фиг. 23 представлена конструкция плазмиды pFN 208-13.

Две порции плазмиды pFN 975-25 (ATCC N 67832) отдельно переваривали ферментами Xmn I и XbaI-StyI соответственно. Большие фрагменты выделяли из каждой переваренной смеси и смешивали вместе с синтетическим олигомером, приведенным на фиг. 16. Затем эту смесь кипятили в течение 2,5 мин, постепенно охлаждали 60 мин до 30^oC, затем 60 мин до 40^oC и, наконец, 30 мин до 0^oC. ДНК, подвергнутую повторному отжигу, достраивали фрагментом Кленова и подвергали лигированию с использованием ДНК-лигазы T4. Эту ДНК трансформировали в E. coli A1645, а трансформированные клетки проверяли на наличие клонов, положительных относительно содержания олигомера. Плазмиду из положительного клона обозначали pFN 208-13 (она сдана на хранение в ATCC в хозяине E.coli A4255 под шифром хранения N 68456). Эта плазмида экспрессирует полипептид N-конца FBD размером в 18,5 кД под управлением P_L-промотора и сайта связывания рибосом -лактамазы.

На фиг. 24 представлен синтетический линкер, используемый в конструкции плазмиды pFN 208-13.

На этой фигуре представлен синтетический олигомер, используемый в конструкции плазмиды pFN 208-13 (фиг. 23).

На фиг. 25 представлена конструкция плазмиды pFN 201-3.

Большой фрагмент изолировали из HindIII - StyI-перевара плазмиды pFN 949-2 (ATCC, шифр хранения N 67831) и подвергали лигированию с малым фрагментом, изолированным из HindIII - StyI-перевара плазмиды pFN 196-2 (ATCC, шифр хранения N 68328). Полученная в результате плазмида, обозначенная pFN 201-3, экспрессирует полипептид FBD 12 кД под контролем P_L-промотора и сайта связывания рибосом СII.

На фиг. 26 представлена конструкция плазмиды pFN203-2.

Большой фрагмент изолировали из смеси Ndel - HindIII-перевара плазмиды pMLK-100 (сданной на хранение в E.coli 4300 в ATCC под шифром хранения N 68605) и подвергали лигированию с малым фрагментом, изолированным из смеси Ndel - HindIII-перевара плазмиды pFN 201-3. В результате получали плазмиду, обозначенную pFN 203-2, которая экспрессирует полипептид FBD 12 кД под контролем P_L-промотора , сайта связывания рибосом CII и содержит последовательность окончания транскрипции trp ("ter"). Названная плазмида сдана на хранение в ATCC в E.coli A4255 под шифром хранения ATCC N 68606. Плазмида pFN 203-2 известна также как pFN 203-2-3.

На фиг. 27 представлено связывание фрагментов различных полипептидов с предварительно полученными фибриновыми сгустками.

На этой фигуре представлена специфичность различных полипептидов FBD к предварительно образованному фибриновому сгустку, как это описано в примере 8. Испытывали полипептиды FBD: 31 кД, 20 кД, 18,5 кД и 12 кД. Кроме того, испытывали слитый полипептид 45 кД, состоящий из фрагмента FBD 12 кД и CBD 33 кД. В качестве контроля использовали полипептид CBD 33 кД (описанный в PCT-публикации N WO/90/07577, с. 62-64, тах же заявителей). Все испытываемые полипептиды FBD, включая слитый полипептид 45 кД, связывались с предварительно образованным сгустком в аналогичных пропорциях (25-38% связывание).

На фиг. 28 представлено введение метки в тромбы in vivo с использованием фрагментов полипептидов FBD 12 кД и 18,5 кД (примере 10). На фиг. 28 представлены данные удельной радиоактивности тромба (заштрихованные столбцы) и крови (незаштрихованные столбцы) у крыс с индуктором из нержавеющей стали спустя 24 ч после внутривенного применения ^IIIIп-меченных рекомбинантных протеинов FBD. Прямоугольники и вертикальные отрезки представляют средние значения и средние значения стандартного отклонения числа отсчетов в 1 мин/г влажной массы соответственно. Отношения тромб/кровь приведены на фиг. 29.

На фиг. 29 представлены отношения удельной радиоактивности "тромб/кровь" спустя 24 ч после применения ^IIIIп-меченных 12 кД, 18,5 кД- и 31 кД- FBD в модели, снабженной индуктором крысы, показанной на фиг. 28.

Плазмиды pFN 975-25, pFN 949-2, pFN 137-2 и pFN 196-2 сданы на хранение в соответствии с условиями и требованиями Будапештского договора в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) под шифрами хранения NN 67832, 67831, 67910 и 68328 соответственно. Аналогичным образом сданы на хранение другие ATCC-депозиты, на которые имеется ссылка в настоящей патентной заявке.

Основная последовательность человеческого фибронектина, как было показано, организована из трех типов гомологичных повторов (типов I, II и III). Область, связывающая фибрин (FBD), состоящая из 259 аминокислот со средней мол. м. 31 кД, составлена из пяти повторов типа I ("пальцев"), каждый из которых состоит примерно из 45 аминокислот и включает две дисульфидные связи.

Общее схематическое представление структуры областей фибронектина и рекомбинантных молекул, конструируемых в соответствии с настоящим изобретением, дано на фиг. 1.

Рекомбинантные полипептиды, входящие в состав визуализирующего агента, предлагаемого в соответствии с изобретением, по аминокислотной последовательности по существу идентичны соответствующим фрагментам области связывания.

Во всех полученных полипептидах содержится дополнительный Met на N-конце.

Полипептид r31 кД содержит пять гомологичных петель типа I или "пальцев", упомянутых выше (т.е. 10 дисульфидных связей), полипептид r20 кД и полипептид r18,5 кД, которые содержат три петли (т.е. 6 дисульфидных связей) и полипептид r12 кД имеет две петли (т.е. 4 дисульфидные связи). Присутствие этих дисульфидных связей определяет необходимость, а также трудность процедуры восстановления конформации полипептида соответствующей нативности. Правильно ренатурированные FBD-полипептиды являются биологически активными, т.е. могут связываться с фибрином.

Исходно рекомбинантные FBD-полипептиды продуцируются в виде тел включения, образующих после разрушения клеток нерастворимый осадок.

В соответствии с изобретением предлагается продуцирование рекомбинантных полипептидных фрагментов области связывания фибрина (FBD) для использования при визуализации тромбов и предотвращения их образования. Эти полипептидны могут быть также связаны с тромболитическим агентом для доставки агента к тромбу.

Рекомбинантными клетками, которые продуцируют полипептидные фрагменты FBD, могут быть любые клетки, в которые при помощи приемов рекомбинантной ДНК была введена ДНК-последовательность, кодирующая фрагмент полипептида FBD, которые способны ее экспрессировать. Это может быть клетка млекопитающего, дрожжевая клетка или бактериальная клетка.

Бактериальная клетка может принадлежать любому штамму, включая ауксотрофные, прототрофные и литические штаммы, F⁺- и F^--штаммы; штаммы, несущие последовательность репрессора c1857 -профага; штаммы с удаленными репрессорами или геном deo.

Примерами используемых штаммов Escherichia coli дикого типа являются прототроф ATCC N 12435 и ауксотроф MC1061 (шифр хранения N 67361).

Примерами штаммов Escherichia coli, которые несут последовательность репрессора c1857, являются ауксотроф A1645, несущий плазмиду pTYR 279-8 (ATCC N 53216), A1637, несущий плазмиду pTY 104/2 (ATCC N 39384) и A2097: несущий плазмиду pSOD 2 (ATCC N 39786), прототроф A4255, несущий плазмиду pFN 975-25 (ATCC N 67832) и независимый от биотина A4346, несущий плазмиду pHG 44 (ATCC N 53218).

Примером пригодного литического штамма Escherichia coli является A4048, который несет плазмиду pHG 44 (ATCC N 53217).

Примерами F^--штаммов является Escherichia coli S 930 (F^-), несущий плазмиду pMF 5534, сданный на хранение под шифром ATCC N 67703, и Escherichia coli W31100 (F^-), несущий плазмиду pMFS 929, сданный на хранение под шифром ATCC N 67705.

Примерами штаммов Escherichia coli с удаленным геном deo или репрессором deo являются S 732, несущий плазмиду pMF 2005 (ATCC N 67362), S 540, несущий плазмиду pJBF 5401 (ATCC N 67359), и S 930, несущий плазмиду pEFF 920 (ATCC N 67706) (см. публикацию европейской патентной заявки N 0303972, опубликованную 22 февраля 1989 г.).

В качестве клетки-хозяина для плазмид можно также использовать и другие штаммы Escherichia coli, а также другие бактерии. К таким бактериям относятся Pseudomonas aeruginosa и Bacillus subtilis.

Плазмиды, используемые для продуцирования FBD-полипептидов, могут нести самые разнообразные промоторы, такие, как промотор для промотора deo.

Среди плазмид, которые можно использовать для продуцирования FBD-полипептидов, можно указать следующие: a) плазмида pFN 975-25, которая экспрессирует FBD r31 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 67832; b) плазмида pFN 949-2, которая экспрессирует FBD r20 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 67831; c) плазмида pFN 196-2, которая экспрессирует FBD r12 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 68328; d) плазмида pFN 197-10, которая экспрессирует модифицированный полипептид FBD 12 кД и которая показана на фиг. 17; e) плазмида pFN 201-3, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 12 кД под контролем P_L и CIIrbs сайта связывания рибосом и которая показана на фиг. 25; f) плазмида pFN 203-2, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 12 кД под контролем P_L и CIIrbs и дополнительно содержит терминатор транскрипции, обозначаемый "ter", и которая показана на фиг. 26 (сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli под шифром хранения N 68606); h) плазмида pFN 208-13, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 18,5 кД и которая показана на фиг. 23 (сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli в ATCC под шифром хранения N 68456); В соответствии с изобретением предлагается визуализирующий агент, который содержит полипептид, меченный визуализируемой меткой/маркером.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения используются полипептиды 20 кД, 18,5 кД и 12 кД.

Визуализируемый маркер, используемый в соответствии с изобретением, может быть выбран по обстоятельствам, однако в предпочтительном варианте таким маркером является радиоактивный изотоп, элемент, который является непрозрачным для X-лучей, или парамагнитный ион.

Среди радиоактивных изотопов предпочтительными маркерами являются индий-111, технеций-99М, иод-123, иод-125, иод-131, криптон-81М, ксенон-133, гелий-67 или их смеси. В наиболее предпочтительном варианте маркером является технеций-99М или индий-111.

Примерами парамагнитных ионов являются ионы следующих металлов: хрома (III), марганца (II), железа (III), железа (II), кобальта (II), никеля (II), меди (II), празеодима (III), неодима (III), самария (III), гадолиния (III), тербия (III), диспрозия (III), гольмия (III), эрбия (III), иттербия (III) или их смеси.

Полипептид 20 кД соответствует аминокислотной последовательности фрагмента области связывания фибрина человеческого фибронектина, охватывающей аминокислотные остатки 1-153, как это показано на фиг. 2-9, и имеет примерно 20 дополнительных аминокислот; полипептид 18,5 кД соответствует аминокислотной последовательности фрагмента области связывания фибрина человеческого фибронектина от 1 до 154 аминокислотного остатка, как это показано на фиг. 2-9; полипептид 12 кД соответствует аминокислотной последовательности фрагмента области связывания фибрина человеческого фибронектина от 1 до 109 аминокислотного остатка, как это показано на фиг. 2-9. При помощи частичного анализа аминокислотной последовательности заявитель показал, что полипептиды 12 кД и 20 кД, а также полноразмерный полипептид 31 кД содержат дополнительный N-терминальный метионин.

Однако область притязаний изобретения включает также полипептиды без дополнительного N-терминального метионина.

В соответствии с изобретением предлагается также способ визуализации содержащих фибрин материалов, а именно тромбов или атеросклеротических бляшек, который предполагает контактирование содержащего фибрин материала, подлежащего визуализации, с агентом, описанным выше, в подходящих для их связывания условиях и визуализацию связанного агента с соответствующей визуализацией содержащего фибрин материала.

Визуализация может быть осуществлена любым известным приемом, которые знакомы любому специалисту в этой области техники. Эти приемы включают (но ими не исчерпывается полный список) рентгеновский анализ, CAT-сканирование (компьютерная аксиальная томография), PET-сканирование, NMRI, флюороскопия. В предпочтительном варианте визуализацию фибринсодержащего материала при помощи вышеупомянутых приемов осуществляют с использованием гамма-камеры.

Все ссылки на позиции нуклеотидов соответствуют позициям в нуклеотидной последовательности кДНК человеческого фибронектина, приведенной на фиг. 2-9 (см. также фиг. 10 и 11 у Баралла Ф.Е., Публикация европейского патента N 207751, опубликованного 7 января 1987 г.).

Настоящая патентная заявка направлена на визуализирующие агенты, содержащие полипептиды, соответствующие N-концевой области домена связывания фибрина (FBD). Экспериментальные результаты с полипептидом 31 кД представлены с целью сравнения с более короткими фрагментами.

Пример 1. Получение кДНК-библиотеки фибронектина.

КДНК-библиотеку получали в gtII из поля A + мРНК, изолированной из человеческой печени в соответствии с опубликованными процедурами (13, 14). КДНК-фрагменты клонировали с использованием EcoRI-линкеров и отбирали положительные относительно FBD-плазмиды, применяя следующие синтетические ДНК-зонды: (3') GGGGGTCGGAGGGATACCGGTGACACAGTCTTAA (817-850) (3') CGACGGGTGCTCCTTTAGACGTGTTGGTTACTTCCCCAGTAC (1310-1340) Положительные кДНК-клоны субклонировали в сайте EcoRI в pB R322.

Пример 2. Экспрессия и очистка полипептидов области связывания фибрина (FBD).

A. Экспрессия частичного полипептида FBD в 20 кД.

Клоны кДНК, полученные, как это описано в примере 1 и изображено на фиг. 15, не включают ДНК, кодирующую аминокислоты 1 - 190 молекулы FN. Эти аминокислоты являются частью FBD. ДНК, соответствующую нуклеотидам с 14 по 472 и кодирующую аминокислоты 1-153 (фиг. 2), конструировали при помощи лигирования 7 пар химически синтезированных нуклеотидов (фиг. 10 и 11). Синтетический ДНК-фрагмент сконструировали так, что он содержал кодон инициирования ATG на 5'-конце, а также удобные сайты рестрикции для введения в различные векторы экспрессии. Чтобы иметь возможность дальнейшего манипулирования с ДНК-последовательностью, кодирующей FBD, нуклеотид номер 19, тимидин (T), заменили на аденин (A), исключая при этом сайт рестрикции DdeI и не изменяя аминокислотную последовательность (сайт изменения нуклеотида обозначается звездочкой в линкере # 1, показанном на фиг. 10). Различные стадии клонирования вышеупомянутого синтетического ДНК-фрагмента в векторе плазмиды pBR 322, переваренной ферментами EcoRI и BamHI, описаны на фиг. 11. Полученную плазмиду обозначали pFN 932-18. ДНК-фрагмент, кодирующий первые 153 N-терминальные аминокислоты фибронектина из плазмиды pFN 932-18, вставляли в pTY 301, вектор экспрессии P_L, между сайтами NdeI и BglII, заменяя ДНК-последовательность, кодирующую человеческий гормон роста (hGH) в плазмиде pTY 301 (фиг. 12).

Полученную в результате плазмиду, pFN 949-2, сдали на хранение в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) под шифром хранения N 67831. Плазмиду pFN 949-2 использовали для трансформации прототрофа Escherichia coli A4255. Эти трансформированные клетки Escherichia coli, как было установлено, экспрессируют частичный FBD-полипептид в количествах, составляющих примерно 5% от общего клеточного протеина. Этот полипептид имеет подвижность, соответствующую примерно 20 кД, на SDS-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях. Он содержит первые 153 аминокислоты фибронектина с последующими 4 аминокислотами, кодирующими синтетический линкер, и несколькими аминокислотами, полученными в результате считывания в векторе pBR322, т.е. всего 153 аминокислоты плюс менее 20 дополнительных аминокислот и дополнительный N-терминальный метионин. На протяжении патентного описания полипептид именуется r20 кД или FBD r20 кД.

B. Экспрессия "полного" полипептида.

Для того, чтобы получить экспрессию полного FBD-полипептида, содержащего аминокислоты 1-262, конструировали следующие плазмиды.

1. Вставка терминирующего кодона TAA на 3'-конце.

Синтетический олигонуклеотид, содержащий терминирующий кодон TAA и BglII, имеющий следующую последовательность: подвергали лигированию с 3'-концом фрагмента EcoRI - PvuII, выделенного из p931-5 кДНК-клона FN, и с вектором pBR322, переваренным EcoRI и MamHI, как это описано на фиг. 14. Полученную плазмиду обозначали pFN 935-12.

2. Субклонирование карбокси-терминальной области FBD в векторе экспрессии P_L.

ДНК-фрагмент EcoRI-HincII, кодирующий карбокси-терминальную область FBD, изолировали из плазмиды pFN 935-12 и подвергали лигированию с плазмидой pTY 194-80, переваренной ферментами EcoRI и SmaI, как это описано в публикации PCT N WO90/07577 настоящего заявителя (рисунок 46). Полученную плазмиду обозначали pFN 946-12.

3. Синтез и клонирование ДНК, соответствующ