Рекомбинантный полипептид, способ ингибирования агрегации тромбоцитов, рекомбинантная плазмидная днк (варианты), рекомбинантный штамм e.coli (варианты), способ получения полипептида

Рекомбинантный полипептид, способ ингибирования агрегации тромбоцитов, рекомбинантная плазмидная днк (варианты), рекомбинантный штамм e.coli (варианты), способ получения полипептида

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и позволяет получить рекомбинантный полипептид, ингибирующий слипание и агрегацию тромбоцитов при воздействии таких условий, при которых проявляются церебровескулярные расстройства и сердечно-сосудистые расстройства. Рекомбинантный полипептид содержит область связывания GPIb фактора фон Виллебранда человека и имеет определенную аминокислотную последовательность. Способ ингибирования агрегации тромбоцитов осуществляют путем контактирования тромбоцитов с эффективным количеством рекомбинантного полипептида. Для экспрессии рекомбинантного полипептида используют рекомбинантную плазмидную ДНК pvWF-VC3 или pvWF-VCL. Каждая из ДНК содержит область связывания гликопротеина Ib фактора фон Виллебранда человека. Эта область включает фрагмент ДНК, кодирующий аминокислотную последовательность полипептида, и содержит промоторную систему deo P₁P₂ или промотор P_l фага ламбда, deo - сайт связывания рибосом, T₁T₂-терминатор транскрипции и ген устойчивости к ампициллину Amp² в качестве генетического маркера. Продуцентами полипептида являются рекомбинантный штамм E coli/pvWF-VC3 или IpvWF-VCL. При получении полипептида трансформируют штамм E coli рекомбинантной плазмидной ДНК, проводят отбор и культивирование трансформантов в условиях, обеспечивающих накопление полипептида. При выделении биологически активного пептида разрушают бактериальные клетки с выделением лизата. Из лизата выделяют тельца включения с помощью денатурирующего агента или гуанидингидрохлорида, или мочевины с последующей очисткой раствора полипептида катионнообменной хроматографией. Растворенный полипептид обрабатывают дисульфидом или глутатионом, или тиоредоксином, или бета-меркаптоэтанолом, или цистеином. Полученный полипептид обрабатывают диализом, а диализат -катионно-обменной хроматографией. 7 с.п.ф-лы, 4 табл., 27 ил.

Настоящая заявка частично является продолжением американской заявки с серийным номером 487767, поданной 2 марта 1990 г., содержимое которой естественно вошло со ссылкой в настоящее описание.

На протяжении этой заявки в круглых скобках приводятся ссылки на различные публикации. Данные этих публикаций во всей полноте вошли тем самым со ссылкой в настоящую заявку, чем достигается большая полнота описания состояния техники, к которой относится это изобретение.

Изобретение касается клонирования и продуцирования человеческих аналогов фактора фон Виллебранда и способов использования таких аналогов.

Структурные признаки фактора фон Виллебранда.

Фактор фон Виллебранда (vWF) представляет собой большой белок плазмы, который синтезируется в эндотелиальных клетках, которые образуют внутреннюю поверхностную выстелку стенки кровеносных сосудов и через мегакариоциты предшественника тромбоцитов. Большие количества vWF-фактора находят в тромбоцитных -гранулах, содержимое которых высвобождается в кровь при тромбоцитной активации. Вновь синтезированный в эндотелиальных клетках vWF-фактор может поступать в кровь двумя возможными способами. Часть его конститутивно секретируется в кровь в основном в виде связанных через дисульфидную группу димеров или небольших мультимеров массой в 250000 дальтоновых субъединиц. Или же честь его поступает в секреторные органеллы, названные телами Вейбеля-Палада (Weibel-Palade). Фактор vWF, находящийся в телах Вейбеля-Палада, является сильно мультимерным, изменяясь по размеру от димера до мультимеров в 50 или более субъединиц, и может быть высвобожден из клеток при воздействии секретатогов, таких как тромбин. Сильно мультимерный vWF-фактор является наиболее эффективным в отношении стимуляции слипания тромбоцитов.

Был выделен ген, кодирующий vWF-фактор, и было показано, что его длина превышает 150000 оснований. Он включает в себя более 20 эксонов. Информационная РНК (мРНК) vWF-фактора по длине примерно составляет 9000 оснований и кодирует пре-про vWF-фактор, состоящий из 2813 аминокислот. Остатки 1 - 22 образуют обработанную главную последовательность, которая предположительно расщепляется при вхождении белка в гранулярный эндоплазматический ретикулюм. N-Концевая часть про-vWF-фактора (741 аминокислота) представляет собой про-пептид, который не присутствует в зрелом vWF-факторе. Этот пептид присутствует в крови, и было показано, что он является идентичным белку крови, известному ранее как антиген 11 фон Виллебранда (vWF Agll). Про-пептид является существенным для протекания мультимеризации vWF-фактора. Клетки, в которые введена кДНК фактора vWF-, содержащие только зрелые vWF-последовательности, дают только димеры. Ничего не известно о функциональной роли образования про-пептид/vW Agll.

Из анализа ДНК-последовательности следует, что про-vWF-предшественник состоит из интервально повторяющихся субъединиц. Были идентифицированы четыре разные области. Зрелый vWF-фактор состоит из трех областей типа A, трех областей типа B и двух областей типа C. Имеются также две полные и одна частичная области типа D. Про-пептид состоит из двух областей типа D, из чего делается предположение, что он может обладать связанными с ними функциями.

Зрелый vWF-фактор представляет собой многовалентную молекулу, которая характеризуется наличием связующих сайтов, пригодных для нескольких белков. Один из связующих сайтов распознает тромбоцитный гликопротеид Ib/GPI/. Использованием протеолитических веществ было установлено, что у зрелого vWF-фактора этот сайт приходится на область, расположенную между аминокислотными остатками 449 и 728. Кроме того, vWF-фактор характеризуется наличием по крайней мере двух коллагеновых связующих сайтов, по крайней мере двух гепариновых связующих сайтов, сайта, связывающего фактор VIII, и RGD-сайта, посредством которого происходит присоединение к тромбоцитному GP IIb /IIIa-рецептору.

Участие vWF-фактора в тромбоцитном сцеплении с субъэндотелием.

Вывод о том, что vWF-фактор, в частности связывание vWF-фактора с тромбоцитным GPIB-рецептором, играет существенную роль в обычной тромбоцитной адгезии, основывается как на клинических наблюдениях, так и на данных исследований, проведенных in vitro. Пациенты с нарушением кровотечения в виде заболевания фон Виллебранда (болезнь Виллебранда-Юргенса/vWD) обладают пониженными уровнями фактора vWF или характеризуются полным отсутствием vWF-фактора. Или же они могут обладать дефектным vWF-фактором. Еще одно заболевание - синдром Бернарда-Соулира (Bernard-Soulier Syndrome) BSS//-характеризуется наличием тромбоцитов с отсутствующими GPIB-рецепторами.

В исследованиях in vitro система, которая наиболее близко аппроксимирует условия, существующие в поврежденном кровеносном сосуде, состоит из перфузионной камеры, в которой вывернутый участок кровеносного сосуда (кроличья аорта, человеческая посмертная почечная артерия или человеческая умбиликальная артерия) подвергается воздействию протекающей крови. После отделения слоя эндотелиальных клеток от сосуда крови позволяют протекать через камеру. Степень протекания тромбоцитной адгезии оценивают непосредственно методом морфометрии или косвенно, используя тромбоциты с радиоактивной меткой. Кровь, взятая у пациентов, страдающих болезнью Виллебранда-Юргенса или синдромом Бернарда-Соулира, не способствует тромбоцитной адгезии в этой системе, тогда как нормальная кровь способствует, указывая на необходимость наличия vWF-фактора или тромбоцитного гликопротеида Ib (GPIb). Более того, добавление моноклональных антител к GPIb также препятствует протеканию тромбоцитной адгезии. Зависимость тромбоцитной адгезии от vWF-фактора является более выраженной в условиях существования высоких касательных скоростей, типа существующих в артериальном потоке. В условиях существования низких касательных скоростей тромбоцитная адгезия может быть усилена воздействием других адгезионных белков, таких как фибронектин. Адгезионные силы, возникающие под воздействием этих других белков, не являются, видимо, достаточными для обеспечения адгезии при воздействии больших касательных сил; и становится очевидной зависимость от vWF-фактора. Кроме того, мультимерная природа vWF-фактора может оказаться способствующей обеспечению более прочной связи за счет связывания большего числа сайтов, имеющихся на тробмоците.

Примерно 20% пациентов, у которых был удален сгусток проведением пластической операции на сосудах или введением тканевого плазминогенного активатора (tPA), страдают от реокклюзии. Сказанное связано, видимо, с повреждением эндотелия, возникающим при проведении лечения, результатом чего является адгезия тромбоцитов на подвергнутой воздействию области внутренней поверхности сосуда. Сказанное сопровождается агрегацией многих слоев тромбоцитов и фибрина на ранее прилипших тромбоцитах, образующих тромб.

До настоящего времени отсутствуют указания на то, что какое-либо из препятствующих агрегации тромбоцитов веществ, описанных в литературе, могло бы противодействовать адгезии тромбоцитов на подвергнутом воздействию субъэндотелии, что тем самым исключало бы последующее образование сгустка.

Предметом изобретения являются негликозилированные биологически активные полипептиды, которые включают в себя связующую область GPIb фактора vWF (фактора фон Виллебранда). Эти полипептиды могут быть, между прочим, использованы для устранения адгезии и агрегации тромбоцитов при лечении субъектов с нарушениями, такими как цереброваскулярные расстройства и сердечно-сосудистые расстройства. Это изобретение также касается плазмид экспрессии, кодирующих эти полипептиды, и к тому же способов продуцирования посредством трансформации бактериальной клетки и выделения таких полипептидов. Кроме того, предметом изобретения являются способы лечения и предотвращения цереброваскулярных, сердечно-сосудистых и других расстройств посредством использования этих полипептидов для ингибирования агрегации тромбоцитов.

Изобретение касается негликозилированного биологически активного полипептида, обладающего следующей аминокислотной последовательностью: X-A-[Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys]-B-COOH где X - группа NH₂-метионин- или NH₂-; A - последовательность, состоящая из по крайней мере из одной аминокислоты, но при этом содержащая менее 35 аминокислот, которая присутствует в vWF-факторе естественного происхождения и у которой карбоксиконцевая аминокислота представляет собой тирозин с N 508; B - последовательность, состоящая по крайней мере из одной аминокислоты, но при этом содержащая менее 211 аминокислот, которая присутствует в vWF-факторе естественного происхождения и у которой концевая аминогруппа аминокислоты представляет собой аспарагиновую кислоту с N 696, и два цистеина, содержащиеся в последовательности, заключенной в скобки, соединены через дисульфидную связь.

Предметом изобретения является способ продуцирования какого-либо из описанных выше полипептидов, который включает в себя трансформацию бактериальной клетки с получением плазмиды экспрессии, кодирующей полипептид, выращивание результирующей бактериальной клетки с продуцированием полипептида, закодированного плазмидой, и выделение полипептида, продуцированного указанным способом.

Предметом изобретения является фармацевтический состав, включающий в себя некоторое количество какого-либо из описанных выше полипептидов, являющихся эффективными в отношении торможения процесса агрегации тромбоцитов, и фармацевтически приемлемый носитель. Предметом изобретения является также способ торможения процесса агрегации тромбоцитов, который включает в себя контактирование тромбоцитов с некоторым количеством какого-либо из описанных выше полипептидов, являющихся эффективными в отношении торможения процесса агрегации тромбоцитов.

Предметом изобретения являются способы лечения, устраняющие или подавляющие расстройства, такие как цереброваскулярные или сердечно-сосудистые расстройства или тромбоз, включающие в себя введение субъекту некоторого количества какого-либо из описанных выше полипептидов, эффективных в плане лечения или устранения таких расстройств.

Предметом изобретения является также способ выделения очищенного биологически активного описанного выше полипептида, который включает в себя: а) продуцирование в бактериальной клетке первого полипептида, обладающего аминокислотной последовательностью полипептида, но не содержащего дисульфидную связь; б) разрушение бактериальной клетки с продуцированием лизата, содержащего первый полипептид; в) обработку лизата до получения телец включений, содержащих первый полипептид; г) контактирование телец включений, полученных на стадии в), с получением первого полипептида в растворимой форме; д) обработку результирующего первого полипептида с образованием биологически активного полипептида; е) извлечение образовавшегося биологически активного полипептида; ж) очистку извлеченного биологически активного полипептида.

На фиг. 1 показана конструкция плазмиды pvWIP. Отделяли ряд кДНК-клонов фактора vWF в gtII (выделенных из кДНК-совокупности эндотелиальной человеческой клетки). Один кДНК-клон, охватывающий всю связующую область GPIb, субклонировали в EcoRI-сайт плазмиды (фиг. 9). Результирующая плазмида pvWIP содержит кДНК-вставку из 2500 оснований.

На фиг. 2 показана конструкция плазмиды pvWF-VAI. Синтетический олигомер, содержащий ATG-инициирующий кодон, расположенный перед аминокислотой gIu-437 (т. е. перед 437-й аминокислотой в белке фактора vWF) (фиг. 12-19), присоединяли к плазмиде pvWIP, подвергнутой расщеплению при воздействии NdeI и Bsu 361. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VAI и внесена в штамм S 930 культуры E. coli под инвентарным номером 68530 (Американская коллекция типовых культур микроорганизмов).

На фиг. 3 показана конструкция плазмиды pvWF-VBI. Синтетический олигомер, содержащий ATG-инициирующий кодон, расположенный перед аминокислотой phe-443 (фиг. 12 - 19), присоединяли к плазмиде pvWIp, подвергнутой расщеплению при воздействии NdeI и Bsu361. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VBI.

На фиг. 4 показана конструкция плазмиды pvWF-VA2. Синтетический олигомер, содержащий TAA-завершающий кодон, расположенный после аминокислоты Iys-728 (фиг. 12 - 19), присоединяли к плазмиде pvWF-VA1, подвергнутой расщеплению при воздействии Hind 111 и Xmal. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VA2.

На фиг. 5 показана конструкция плазмиды pvWF-VB2. Синтетический олигомер, содержащий TAA-завершающий кодон, был присоединен к плазмиде pvWF-VB1, подвергнутой расщеплению при воздействии Hind 111 и Xmal. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VB2.

На фиг. 6 показана конструкция плазмиды pvWF-VA3. Из плазмиды pvWF-VA2 выделяли фрагмент NdeI-EcoRV и присоединяли к плазмиде pMF-945, подвергнутой расщеплению при воздействии NdeI и Rvu 11. Полученную плазмиду обозначали как pvWF-VA3. Плазмида экспрессировала образование VA, полипептид связующей области GPIb фактора vWF, который включает в себя аминокислоты от 437 до 728 (фиг. 12 - 19), что находится под управлением промотора deo P₁P₂.

На фиг. 7 показана конструкция плазмиды pvWF-VB3. Из плазмиды pvWF-VB2 выделяли фрагмент NdeI-EcoRV и присоединяли к плазмиде pWF-945, подвергнутой расщеплению при воздействии NdeI и Pvu 11. Полученную плазмиду обозначали как pvWF-VB3. Плазмида экспрессировала VB, полипептид связующей области GPIb фактора vWF, который включает в себя аминокислоты от 443 до 728, что находится под управлением промотора deo P₁P₂.

На фиг. 8 показана конструкция плазмиды pvWF-VC3. Синтетическую сцепку присоединяли к плазмиде pvWF-VA3, подвергнутой расщеплению при воздействии NdeI и TthIIII. Полученную плазмиду обозначали как pvWF-VC3, и она была внесена в Американскую коллекцию типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68241 (Американская коллекция типовых культур микроорганизмов). Плазмида экспрессировала VC (это образование фигурирует также как VCL или VC3), полипептид связующей области GPIb фактора vWF, который включает в себя аминокислоты от 504 до 728 (фиг. 12 - 19), что находится под управлением промотора deo P₁P₂.

На фиг. 9 показана конструкция плазмиды pvWF-VD3. Синтетическую сцепку присоединяли к плазмиде pvWF-VA3, подвергнутой расщеплению при воздействии NdeI и TthIIII. Полученную плазмиду обозначали как pvWF-VD3. Плазмида экспрессировала образование VD, полипептид связующей области GPIb фактора vWF, который включает в себя аминокислоты от 513 до 728 (фиг. 12 - 19), что находится под управлением промотора deo P₁P₂.

На фиг. 10 показано относительное положение плазмид, экспрессирующих полипептиды связующей области vWF-GPIb. Кроме того, показанные верхние две линии характеризуют кДНК фактора vWF и положение связующей области GPIb, кодирующей область в пределах кДНК.

На фиг. 11 показана конструкция плазмиды pMF-945. Плазмиду pEFF-920 (у штамма S 930 культуры Escherichia coli, инвентарный номер 67706 у Американской коллекции типовых культур микроорганизмов) подвергали расщеплению при воздействии BgIII и NdeI и выделяли большой фрагмент. Этот фрагмент присоединяли к небольшому фрагменту из 540 пар оснований, полученному расщеплением плазмиды pMF-5534 (инвентарный номер 67703 у Американской коллекции типовых культур микроорганизмов) при воздействии BgIII и NdeI. В результате этого продуцировали плазмиду pMF-945, которая содержала PAR-последовательность и в порядке расположения 5' и 3' промоторные последовательности deo P₁P₂, модифицированный deo-рибосомальный связующий сайт с усилительной последовательностью, аналоговую кодирующую последовательность pGH и транскрипционные концевые последовательности T₁T₂. Плазмида pMF-945 представляет собой образование, которое на высоком уровне экспрессирует аналоговый белок pGH.

На фиг. 12 - 19 показана транслированная кДНК-последовательность зрелого человеческого фактора фон Виллебранда. Эта последовательность была составлена с использованием данных, которые привели Веруидж и др. (Verweij, C. L., et al., EMBO journal 5: 1839-1847 / 1986// и Садлер и др. /Sadler, J. E., et al. , Proc. NatI. Acad. Sci. 82: 6394 - 6398 /1985/). Эта нуклеотидная последовательность начинается с нуклеотида с номером 2519 (где нуклеотид 1 приходится на начало кодирующей последовательности для сигнального пептида) и завершается нуклеотидом 8668 при общем числе нуклеотидов 6150, кодирующих зрелый vWF-фактор, состоящий из 2050 аминокислот. Транслированная аминокислотная последовательность начинается с аминокислоты с номером 1 и завершается аминокислотными обозначениями, используемыми во всей этой заявке.

На фиг. 20 показана транслированная последовательность у полипептида связующей области GPIb-фактора фон Виллебранда, выраженного плазмидами pvWF-VC3 (инвентарный номер 68241 в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов) и pvWF-VCl (инвентарный номер 68242 в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов).

Первый кодон ATG, кодирующий трансляционный метионин кодона инициирования, был добавлен к нуклеотидной последовательности, соответствующей нуклеотидам от 4028 до 4702 последовательности, показанной на фиг. 12-19. Эта последовательность кодирует полипептид, содержащий 225 аминокислот (плюс метионин инициирования), которые соответствуют аминокислотам, начиная от аминокислоты Leu/лейцин/ с номером 504 и кончая аминокислотой Lys/лизин/ с номером 728 (фиг. 12-19), т.е. всего оказывается 226 аминокислот.

На фиг. 21 показана конструкция плазмиды pvWF-VCL. Плазмида pvWF-VC3 была подвергнута расщеплению при воздействии Hind 111 и Sty 1 и был выделен фрагмент с числом пар оснований 860. Этот фрагмент был соединен с большим фрагментом, выделенным из продукта расщепления плазмиды pMLK-100 при воздействии Hind 111 и Sty 1. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VCL и внесена в штамм 4300 /F^-/ культуры E. coli Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68242 (Американская коллекция типовых культур микроорганизмов). Эта плазмида экспрессирует образование VCL, отвечающее тому же полипептиду связующей области GPIb фактора vWF, что и в случае плазмиды pvWF-VC3 (метионин плюс аминокислоты 504-728); однако происходит это под управлением P_l - промотора и deo-рибосомального связующего сайта.

На фиг. 22 показана конструкция плазмиды pvWF-VE2. Плазмида pvWF-VA2 была подвергнута расщеплению при использовании Nde1 и Pst1 и был выделен большой фрагмент. Синтетические олигомеры N 2 и N 3 (фиг. 23) были обработаны полинуклеотидной киназой T4. Большой фрагмент плазмиды pvWF-VA2 был затем соединен с синтетическими олигомерами N 1 и N 4 (фиг. 23) и с подвергнутыми воздействию киназы олигомерами N 2 и N 3. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VE2.

На фиг. 23 показаны четыре синтетические связки (с номерами 1-4), использованные при конструкции плазмиды pvWF-VE2.

На фиг. 24 показана конструкция плазмиды pvWF-VE3. Плазмида pvWF-VE2 была подвергнута расщеплению при использовании Ndel и HindIII; был выделен небольшой фрагмент с числом пар оснований 770, и он был присоединен к большому фрагменту, выделенному из продукта расщепления плазмиды pMLK-7891 при воздействии Ndel и HindIII. Результирующая плазмида была обозначена как pvWF-VE3.

На фиг. 25 показана конструкция плазмиды pvWF-VEL. Плазмида pvWF-VE3 была подвергнута расщеплению при использовании X_mnI, обработана бактериальной щелочной фосфатазой (BAP) и затем подвергнута расщеплению при воздействии Ndel и HindIII. Плазмида pMLK-100 была подвергнута расщеплению при использовании NDeI и HindIII и обработана бактериальной щелочной фосфатазой. Два продукта расщепления были смешаны и сшиты с образованием плазмиды pvWF-VEL, которая экспрессировала ДНК-последовательность, соответствующую аминокислотам 469-728 vWF-фактора, что находилось под управлением P_L-промотора и рибосомального связующего сайта cII.

На фиг. 26 показано влияние образования VCL на BJV-индуцированную агрегацию в человеческой плазме, богатой тромбоцитами. На этой фигуре показаны результаты, полученные при проведении стандартизованного теста по оценке vWF-зависимой агрегации (зависимой от фактора фон Виллебранда), который был проведен с использованием человеческой плазмы, богатой тромбоцитами.

На фиг. 27 показано влияние образования VCL на BJV-индуцированную агрегацию в крысиной плазме, богатой тромбоцитами. На этой фигуре показаны результаты, полученные при проведении стандартизованного теста по оценке vWF-зависимой агрегации (зависимой от фактора фон Виллебранда), который был проведен с использованием крысиной плазмы, богатой тромбоцитами.

Плазмиды pvWF-VC3, pvWF-VCL и pvWF-VAI были внесены в культуру Escherichia coli согласно и в соответствии с требованиями Будапештского договора по международному признанию вклада микроорганизмов для целей патентной практики, который был заключен с организацией в лице Американской коллекции типовых культур микроорганизмов (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852), под инвентарными номерами в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов соответственно 68241, 68242 и 68530.

Это изобретение касается негликозилированного биологически активного полипептида со следующей аминокислотной последовательностью: X-A-[Cys Ser Arg Ley Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Gly Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Glu Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Glu Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Ley Cys]-B-COOH где X - группа NH₂-метионин- или NH₂-; A - последовательность, состоящая по крайней мере из одной аминокислоты, но при этом содержащая менее 35 аминокислот, которая присутствует в vWF-факторе естественного происхождения и у которой карбоксиконцевая аминокислота представляет собой тирозин с N 508, показанный на фиг. 12-19; B - последовательность, состоящая по крайней мере из одной аминокислоты, но при этом содержащая менее 211 аминокислот, которая присутствует в vWF-факторе естественного происхождения и у которой концевая аминогруппа аминокислоты представляет собой аспарагиновую кислоту с N 696, показанную на фиг. 12-19, и два цистеина, содержащиеся в последовательности, заключенной в скобки, соединены через дисульфидную связь. Заключенная в скобки последовательность включает в себя аминокислоты с номерами 509-695, как это показано на фиг. 12-19.

В одном из вариантов этот полипептид обладает следующей аминокислотной последовательностью: X-[Leu His Asp Phe Tyr Cys Ser Arg Leu Leu Asp Leu Val Phe Leu Leu Asp Giy Ser Ser Arg Leu Ser Glu Ala Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala Phe Val Val Asp Met Met Glu Arg Leu Arg Ile Ser Gln Lys Trp Val Arg Val Ala Val Val Glu Tyr His Asp Gly Ser His Ala Tyr Ile Gly Leu Lys Asp Arg Lys Arg Pro Ser Glu Leu Arg Arg Ile Ala Ser Gln Val Lys Tyr Ala Gly Ser Gln Val Ala Ser Thr Ser Glu Val Leu Lys Tyr Thr Leu Phe Gln Ile Phe Ser Lys Ile Asp Arg Pro Gly Ala Ser Arg Ile Ala Leu Leu Leu Met Ala Ser Gln Glu Pro Gln Arg Met Ser Arg Asn Phe Val Arg Tyr Val Gln Gly Leu Lys Lys Lys Lys Val Ile Val Ile Pro Val Gly Ile Gly Pro His Ala Asn Leu Lys Gln Ile Arg Leu Ile Glu Lys Gln Ala Pro Glu Asn Lys Ala Phe Val Leu Ser Ser Val Asp Glu Leu Glu Gln Gln Arg Asp Glu Ile Val Ser Tyr Leu Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Pro Pro Pro Thr Leu Pro Pro Asp Met Ala Gln Val Thr Val Gly Pro Gly Leu Leu Gly Val Ser Thr Leu Gly Pro Lys]-COOH где X - группа NH₂ - или NH₂ - метионин-; желательно, чтобы это была группа NH₂-метионин-.

В заключенную в скобки последовательность входят аминокислоты с номерами 504-728, показанные на фиг. 12-19.

Специалисты, работающие в этой области техники, к которым относится предмет изобретения, могут легко воссоздать такие полипептиды, используя методики с применением ракомбинантной или нерекомбинантной ДНК.

Полипептиды могут быть сконструированы по способу с использованием рекомбинантной ДНК. Сказанное означает, что для получения полипептидов необходимо экспрессировать нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептиды, что делается в подходящем хозяине, таком как бактериальная, дрожжевая клетка или клетка млекопитающего, при использовании способов, хорошо известных в этой области техники, с выделением полипептида, экспрессированного в таком хозяине.

Примерами векторов, которые могут быть использованы для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, являются вирусы, такие как бектериофаги (такие как фаг лямбда), космиды, плазмиды и другие рекомбинантные векторы. Молекулы нуклеиновой кислоты вставляют в векторные геномы, используя способы, хорошо известные в этой области техники. Например, используя обычные выделенные ферментами сайты, вставку и векторную ДНК- и то и другое - подвергают воздействию фермента ограничения с целью образования комплементарных концов у обеих молекул, которые образуют пару оснований друг с другом и которые затем сшиваются при использовании лигазы. Или же сцепки могут быть сшиты с ДНК-вставкой, которая соответствует сайту ограничения у векторной ДНК; она затем подвергается расщеплению под воздействием фермента ограничения, который режет молекулу по такому сайту. Известны также и другие способы.

Векторы, составляющие кислоту, кодирующую полипептиды, могут быть адаптированы для экспрессии в бактериальной клетке, дрожжевой клетке или в клетке млекопитающего, которая дополнительно включает в себя регуляторные элементы, необходимые для обеспечения экспрессии нуклеиновой кислоты в бактериальной клетке, дрожжевой клетке или в клетке млекопитающего, причем они занимают такое положение относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, при котором обеспечивается экспрессия такового. Регуляторные элементы, требуемые для обеспечения экспрессии, включают в себя промоторные последовательности, необходимые для связывания РНК-полимеразы, и последовательности инициирования транскрипции, необходимые для обеспечения рибосомного связывания. Например, бактериальный экспрессионный вектор может включать в себя промотор, такой как P_L-промотор или deo-промотор, и для обеспечения инициирования транскрипции содержать C₁₁- или deo-рибосомальные связующие сайты. Такие векторы могут быть приобретены у других изготовителей или скомпонованы из последовательностей описанными способами, хорошо известными в этой области техники, например, способами, описанными выше применительно к конструированию векторов вообще.

Кроме того, для получения описанных выше полипептидов могут быть использованы нерекомбинантные способы, такие как способы с применением химического синтеза, синтетической ДНК или кДНК. Один из способов выделения полипептида сводится к прощупыванию человеческих геномных материалов, образующих библиотеку данных, при использовании природной или искусственно сконструированной ДНК-пробы, что проводится способами, хорошо известными в этой области техники. Молекулы ДНК и кДНК, которые кодируют полипептиды, могут быть использованы для получения комплементарной геномной ДНК, кДНК или РНК из источников человеческого, млекопитающего или иного животного происхождения или для выделения родственной кДНК или геномных клонов посредством проверки кДНК или библиотечных геномных материалов.

Предметом изобретения является далее фармацевтический состав, включающий в себя некоторое количество какого-либо из описанных выше полипептидов, эффективно противодействующих агрегации тромбоцитов, и фармацевтически приемлемый носитель.

Как это используется в заявке, термин "фармацевтически приемлемый носитель" распространяется на любые стандартные фармацевтические носители. Такие носители являются хорошо известными в этой области техники, и к ним могут быть отнесены, но, разумеется, не только они, любые стандартные фармацевтические носители, такие как солевые растворы с фосфатным буфером, вода, эмульсии, такие как водомасляная эмульсия, и различные типы смачивающих веществ. К другим носителям могут быть также отнесены стерильные растворы, таблетки, таблетки с покрытием и капсулы.

В типичном случае такие носители содержат наполнители, такие как крахмал, молоко, сахар, некоторые типы глины, желатин, стеариновую кислоту или соли таковых, стеараты магния или кальция, тальк, растительные жиры или масла, камеди, гликоли или другие известные наполнители. Такие носители могут также содержать душистые и окрашивающие добавки или другие ингредиенты. Составы с такими носителями образуют хорошо известными общепринятыми способами.

Состав берется в таком количестве, чтобы его было достаточно для образования концентрации в крови величиной от 0,06 до 58 мкМ, желательно в области примерно от 0,06 до 29 мкМ, например, в области от 0,23 до 23 мкМ. В ином выражении количество должно составлять от 0,1 до 100 мг на 1 кг массы тела, желательно от 0,1 до 50 мг на 1 кг массы тела, например, от 0,4 до 40 мг на 1 кг массы тела.

Введение состава может быть осуществлено любым из хорошо известных способов, включая, но не ограничиваясь ими, внутривенный, внутримышечный, подкожный и оральный способы.

Изобретение касается также способа торможения агрегации тромбоцитов, который включает в себя контактирование тромбоцитов с некоторым количеством какого-либо из описанных выше полипептидов, эффективных в отношении торможения агрегации тромбоцитов, чем обеспечивается торможение агрегации тромбоцитов.

Изобретение касается также экспрессии плазмид, кодирующих описанные выше полипептиды. В одном из вариантов реализации изобретения плазмида экспрессии, кодирующая полипептид в виде заключенной в скобки последовательности, т. е. с аминокислотами под номерами 504-728 на фиг. 12-19 обозначена как плазмида pvWF-VC3, и она внесена в Американскую коллекцию типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68241. В еще одном варианте реализации изобретения плазмида экспрессии, кодирующая полипептид в виде заключенной в скобки последовательности, т.е. с аминокислотами под номерами 504-728 на фиг. 12-19, обозначена как плазмида pvWF-VCL, и она внесена в Американскую коллекцию типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68242.

Плазмиды экспрессии, отвечающие изобретению, содержат далее регуляторные элементы, расположенные в пределах плазмиды и имеющие отношение к ДНК, кодирующей полипептид, чем обеспечивается экспрессия полипептида в надлежащей клетке хозяина, которые являются такими, как промотор и операторы, например deo P₁P₂ и P_LO_L, рибосомальные связующие сайты, например, сайты deo и C₁₁, и репрессоры. К другим приемлемым регуляторным элементам относятся, например, 1ас-, trp-, tac- и 1pp-промоторы (Европейский патент, номер заявочной публикации 0303972, публикация произведена 22 февраля 1989 г.).

Подходящие регуляторные элементы располагаются в пределах плазмиды, имеющей отношение к ДНК, кодирующей полипептид, чем обеспечивается экспрессия полипептида в подходящей клетке хозяина. В предпочтительных вариантах реализации изобретения регуляторные элементы располагаются вблизи и у верхней части ДНК, кодирующей полипептид.

Плазмиды экспрессии, отвечающие изобретению, могут быть введены в подходящие клетки хозяина, желательно в бактериальные клетки хозяина. Предпочтительными бактериальными клетками хозяина являются клетки культуры Escherichia coli. Примерами подходящих клеток культуры Escherichia coli являются штаммы S 930 или 4300, но для плазмид в качестве клеток хозяина могут быть также использованы и иные штаммы культуры Escherichia coli и другие бактерии. К таким бактериям относятся Pseudomonas aeruginosa и Bacillus subtilis.

Бактерии, используемые в качестве хозяина, могут представлять собой любой штамм, включая ауксотрофный (такой как А1645), прототрофный (такой как А4255) и литический штаммы, штаммы F⁺ и F^-, штаммы с cl⁸⁵⁷ - респрессорной последовательностью - профага (такие как А1645 и А4255) и штаммы с дилецией в отношении deo - репрессоров и deo - гена (см. публикацию Европейской патентной заявки N 0303972, опубликованную 22 февраля 1989 г.). Штамм А4255 /F⁺/ культуры Escherichia coli был внесен в Американскую коллекцию типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 53468; и штамм А1 645 культуры Escherichia coli - под инвентарным номером 67829.

Изобретение касается бактериальной клетки, которая включает в себя эти плазмиды экспрессии. В случае одного из вариантов бактериальная клетка представляет собой клетку культуры Escherichia coli. В предпочтительных вариантах реализации изобретение касается клетки культуры Escherichia coli, содержащей плазмиду, обозначенную как pvWF-VAL и внесенную в штамм S 930 культуры E. coli Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68530, плазмиду с обозначением pvWF-VA3, плазмиду с обозначением pvWF-VB3, плазмиду с обозначением pvWF-VC3, внесенную в штамм S 930 культуры E. coli Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68241, плазмиду с обозначением pvWF-VCL, внесенную в штамм 4300 /F^-/ культуры E. coli Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под инвентарным номером 68242.

Все штаммы хозяина культуры E. coli, описанные выше, могут быть "заготовлены" из плазмид, их составляющих, способами, хорошо известными в этой области техники, например, по способу с бромидом этидия, который описал Новик (R.P. Novick) в журнале Bacteriol. Review 33, 210 (1969).

Кроме того, предметом изобретения является способ продуцирования любого из описанных выше полипептидов, который включает в себя трансформацию бактериальной клетки с плазмидой экспрессии, кодирующей полипептид, культивирование результирующей бактериальной клетки с продуцированием полипептида, закодированного плазмидой, и извлечение полипептида, продуцированного таким способом.

К тому же, изобретение касается способа лечения субъекта с цереброваскулярным расстройством, который включает в себя введение субъекту некоторого количества какого-либо из полипептидов, отвечающих изобретению и эффективных в отношении торможения процесса агрегации тромбоцитов.

Кроме того, дается способ лечения субъекта с с