Способ селекции популяции клеток in vivo

Способ селекции популяции клеток in vivo

Реферат

 

Использование: в биотехнологии. Сущность изобретения: селекцию популяции клеток in vivo проводят путем повторения циклов отбора клеток по критерию степени нестабильности кариотипа, в качестве которого используют показатель частоты клеток с мостами. Отбор клонов с минимальным показателем приводит к получению популяции клеток с пониженной степенью кариотипической нестабильности, а отбор клеток с максимальным показателем приводит к получению популяции клеток с повышенной степенью кариотипической нестабильности. 7 ил.

Изобретение относится к области биотехнологии, а точнее к способам изменения степени стабильности кариотипа клеток.

В литературе описаны способы селекции перевивных клеточных линий in vivo и in vitro на повышение и на понижение степени стабильности кариотипа. В качестве критериев стабильности кариотипа, по которым проводили селекцию, использовались такие показатели, как "частота клеток с микроядрами" [1], "плоидность" [2] "частота сестринских хроматидных обменов" [3], "частота аберрантных метафаз" [4].

Целью изобретения является повышение эффективности способа. В качестве критерия, по которому проводится такая селекция на повышение или понижение степени стабильности кариотипа, используется показатель "частота клеток с мостами" (ЧКМс).

Сущность известного способа [5], взятого в качестве прототипа, заключается в следующем: путем внутривенной инъекции получают легочные экспериментальные метастазы уницеллюлярного происхождения (клоны) рабдомиосаркомы РА-23 крыс; в полученных клонах определяют частоту клеток с микроядрами (ЧКМ), отбирают клоны с минимальными ЧКМ (для отбора на повышение степени стабильности кариотипа) и с максимальными ЧКМ (для отбора на понижение степени стабильности кариотипа), получают из них суспензию для внутривенного введения с целью получения клонов-потомков. Сформировавшиеся клоны-потомки подвергаются выше описанной процедуре, т.е. определению в них ЧКМ, получению из них суспензии для проведения последующих шагов отбора и т.д. Таким образом, отбор идет по признаку "ЧКМ".

Известный способ-прототип применяется с целью получения клеточных популяций, контрастных по степени спонтанной стабильности кариотипа, для изучения механизмов возникновения спонтанных хромосомных и геномных аберраций, а также для изучения степени злокачественности клеток с различной степенью стабильности кариотипа.

В результате применения известного способа селекции по признаку "ЧКМ" в популяциях клеток рабдомиосаркомы крыс удалось установить положительную корреляцию между показателями "ЧКМ" и "частоты патологических митозов", а также отрицательную корреляцию между показателями "ЧКМ" и "метастатический потенциал".

Целью изобретения является повышение эффективности способа. Из литературы неизвестно о проведении селекции на повышение или понижение стабильности кариотипа по частоте клеток с мостами, что свидетельствует о новизне заявляемого способа. Известно, что возникновение дицентрических хромосом в результате структурных хромосомных аберраций, как правило, приводит к образованию мостов, которые могут сохраняться в интерфазе. В последующем, после образования мостов возникают циклы "разрыв-слияние-мост" [6 и 7] и эти циклы приводят к резкому нарастанию всех типов хромосомных и геномных мутаций в популяциях клеток [8].

Авторами экспериментально доказано, что селекция по повышенной частоте клеток с мостами ведет к снижению стабильности кариотипа. Селекция по низкой частоте клеток с мостами ведет к повышению стабильности кариотипа. Это положение указывает на соответствие заявляемого решения критерию "изобретательский уровень".

Поэтому показатель "ЧКМс" является признаком, по которому можно проводить эффективную селекцию, направленную как на понижение, так и на повышение степени стабильности кариотипа.

Сущность заявленного способа заключается в том, что беспородным белым крысам инъецируют внутривенно суспензию клеток рабдомиосаркомы, получают клоны в легких, анализируют их по признаку "ЧКМс" и получают из них суспензию для очередного цикла отбора.

После селекции на снижение частоты возникновения клеток с мостами в результате 5 циклов отбора получают популяцию клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс с показателями кариотипической гетерогенности достоверно меньшим, чем в популяции тех же клеток до отбора. И наоборот, после селекции на повышение частоты возникновения клеток с мостами в результате 5 циклов отбора получают популяцию клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс с показателями кариотипической гетерогенности достоверно большими, чем в популяции тех же клеток до отбора. В качестве показателей кариотипической гетерогенности (нестабильности) были изучены распределения по числу хромосом и содержание ДНК, оцениваемое методом проточной цитометрии.

Отличительными признаками заявленного решения являются следующие признаки.

1. В качестве признака, по которому проводится искусственный отбор, является показатель "частота клеток с мостами" 2. Селекция по признаку "частота клеток с мостами" оказалась эффективнее, чем селекция по признаку "частота клеток с микроядрами".

В результате отбора клонов РА-23 по признаку "частота клеток с микроядрами" (ЧКМ) средняя ЧКМ повысилась с 3,3% до 6,9% (в 2,1 раза при селекции на снижение стабильности кариотипа) и понизилась с 3,3% до 1,6% (в 2,1 раза при селекции на повышение стабильности кариотипа). В результате отбора клонов РА-23 по признаку "ЧКМс" средняя ЧКМс повысилась с 0,6% до 8,1 % (в 13,5 раз) и понизилась с 0,8% до 0,3% (в 2,7 раза).

Предлагаемый способ может применяться в научно-исследовательских целях и на предприятиях биотехнологической и медицинской промышленности (для селекции гибридом и миелом).

Пример 1. Отбора клонов рабдомиосаркомы РА-23 крыс, направленный на понижение частоты клеток с мостами, проводили по следующей схеме. Вычлененные из легких декапитированной крысы 53 клона отдельно помещают в лунки иммунологического планшета (ТУ-62-2-279-79) со средой ТС-199.

Клоны достают из лунки, расчленяют надвое. Из одной половины методом отпечатков делают мазки на предметном стекле, пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюся часть клонов помещают обратно в лунки, планшет закрывают и помещают в холодильник при 4^oC на 8 - 12 ч. Приготовленные мазки фиксируют 96%-ным этиловым спиртом в течение 5 мин, высушивают, окрашивают флуорохромом Хехст-33258. Затем проводят анализ частоты мостов под иммерсией (окуляр 10х, объектив 100х). В каждом мазке анализируют по 500 клеток. Частоту клеток с мостами выражают в процентах. Средняя частота клеток с мостами в исходной выборке из 53 клонов составила 0,8%, размах изменчивости от 0,0% до 3,0% (фиг. 1, а). Из исходной популяции отбирают 1 клон с минимальным показателем частоты мостов, имеющий 0,0% клеток с мостами.

Из него готовят суспензию для в/в инъецирования, для чего помещают в стерильный флакон, гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды TC-199 и пипетируют шприцем в течение 2 мин.

Полученную суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин при 100 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавляют 3 мл среды ТС-199, определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и доводят концентрацию до 60000 клеток/мл. Подготовленную таким способом суспензию клеток рабдомиосаркомы инъецируют внутривенно белым беспородным крысам в объеме 0,2 мл на особь. Через 25 сут появляются признаки опухолевого поражения животного (прогрессирующее удушье, синюшность кожных покровов). Вскрывают полость легких, отпрепаровывают сформировавшиеся опухолевые клоны, помещают их в лунки иммунологического планшета со средой ТС-199, делают мазки, проводят оценку по частоте клеток с мостами, анализируя по 500 клеток каждого из исследуемых в данном цикле клона, определяют ЧКМс. В результате проведения отбора на понижение средняя частота клеток с мостами после 1-го цикла отбора составила 0,6% (фиг. 1, б). Отбирают один клон с минимальным показателем ЧКМс, имеющий 0,0% клеток с мостами, и используют его для очередной внутривенной прививки во 2-й цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются в каждом цикле отбора.

В результате двух циклов отбора средняя частота клеток с мостами понизилась до 0,5% (фиг. 1, в). Один из 47 исследованных клонов с минимальным показателем ЧКМс 0,0% был отобран для очередного 3-го цикла отбора.

В результате 3-го цикла отбора методом, описанным выше, средняя частота клеток с мостами в популяции 43 клонов составила 0,6% (фиг. 2, г). В очередной четвертый цикл отбора был взят клон, имеющий 0,0% клеток с мостами.

В результате 4-го цикла отбора средняя частота клеток с мостами в выборке из 51 клона составила 0,5% (фиг. 3, д). Пятый цикл отбора оказался наиболее эффективным: средняя частота клеток с мостами в выборке из 46 клонов составила 0,3%, при этом более 60 клонов имели частоту мостов, не превышающую 0,2% (фиг. 3, е).

Таким образом, проведены 5 циклов селекции популяции клеток рабдомиосаркомы на снижение частоты клеток с мостами и степени кариотипической изменчивости. Частота встречаемости клеток с мостами в полученных путем заявляемого способа селекции популяциях клеток рабдомиосаркомы снизилась с 0,6% до 0,3%, т. е. в 2,7 раза (при P < 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Манна-Уитни).

Пример 2. Отбор опухолевых клонов, направленный на повышение частоты клеток с мостами, проводили по следующей схеме. Вычлененные из полости легких декапитированной крысы 48 опухолевых клона отдельно помещают в лунки иммунологического планшета (ТУ 64-2-279-79) со средой ТС-199.

Клоны достают из лунки, расчленяют надвое. Из одной половины методом отпечатков делают мазки на предметном стекле, пронумерованном соответственно номеру лунки.

Оставшуюся часть клонов помещают обратно в лунки, планшет закрывают и помещают в холодильник при 4^oC на 8 - 12 ч. Приготовленные мазки фиксируют 96%-ным этиловым спиртом в течение 5 мин, высушивают, окрашивают флуорохромом Хехст-33258. Затем проводят анализ частоты мостов под иммерсией (окуляр 10х, объектив 100х). В каждом мазке анализируют по 500 клеток. Частоту клеток с мостами выражают в процентах. Средняя ЧКМс в исходной выборке из 48 клонов составила 0,6%, а размах изменчивости от 0,0% до 2,2% (фиг. 4, а). В 1-й цикл отбора взяли три клона с ЧКМс от 1,0% до 1,2%. Из них готовят суспензию для в/в инъецирования, для чего их помещают в стерильные флаконы, гомогенизируют с помощью ножниц, заливают 5 мл универсальной среды ТС-199 и пипетируют шприцем в течение 2 мин.

Полученную суспензию фильтруют через 4 слоя стерильной марли в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об/мин. Надосадок сливают. К полученному осадку клеток добавляют 3 мл среды ТС-199, определяют концентрацию клеток с помощью камеры Горяева и доводят концентрацию до 60000 клеток/мл. Подготовленную таким образом суспензию клеток рабдомиосаркомы инъецируют внутривенно белым беспородным крысам в объеме 0,2 мл/особь.

Через 24 - 28 сут появляются признаки ухудшения состояния животного. Вскрывают полость легких, отпрепаровывают сформировавшиеся опухолевые клоны, помещают их в лунки иммунологического планшета со средой ТС-199, делают мазки, проводят оценку по признаку "ЧКМс", анализируя по 500 клеток каждого из 50 исследуемых в этом цикле опухолевых клона, определяют частоту клеток с мостами. В результате проведения 1-го цикла отбора средняя ЧКМс составила 0,8%, а размах изменчивости от 0,0% до 3,0%, (фиг. 4, б). Три клона с ЧКМс 2,0%, 2,6% и 3,0% были взяты во 2-ой цикл отбора. Таким образом, описанные выше манипуляции повторяются при проведении каждого последующего цикла отбора.

Во 2-ом цикле отбора в выборке из 52 клонов средняя ЧКМс составила 1,7%, а размах изменчивости увеличился от 0,0% до 5,8%, (фиг. 4, в). В очередной 3-й цикл отбора были взяты два клона с ЧКМс 4,4% и 5,8%.

В результате 3-го цикла отбора в выборке из 48 клонов средняя ЧКМс составила 1,6%, а размах изменчивости от 0,2% до 5,2% (фиг. 5, г). В четвертый цикл отбора был взят клон, имеющий 5,2% клеток с мостами.

Четвертый цикл отбора при исследовании выборки из 47 клонов показал, что средняя ЧКМс повысилась до 4,3% (фиг. 5, д). Для проведения 5-го цикла отбора были взяты клоны с ЧКМс 9,0% и 14,4%.

Пятый цикл отбора оказался наиболее эффективным: средняя ЧКМс составила 8,1%, из полученных 15 клонов не было встречено ни одного клона, который бы имел частоту мостов менее 3,2% (фиг. 5, е).

Таким образом, отбор на повышение ЧКМс был эффективным. Частота встречаемости клеток с мостами в полученных путем заявляемого способа селекции популяциях клеток рабдомиосаркомы повысилась с 0,8% до 8,1%, т.е. в 13,5 раз (при P < 0,001 по непараметрическому критерию Вилкоксона-Мана-Уитни).

После проведения 5 циклов селекции на снижение встречаемости клеток с мостами (пример 1), было исследовано число хромосом данной линии. Для получения препаратов метафазных хромосом приготовленную из опухолевых клонов клеточную суспензию инкубировали с колхицином в конечной концентрации 0,7 мкг/мл, клетки подвергали гипотонии 0,55% раствором KCL и фиксировали метанол-уксусным фиксатором. Для подсчета хромосом отбирали окрашение по Гимза метафазные пластинки округлой формы, сохранившие ореол цитоплазмы, фотографировали каждую пластинку и по снимкам определяли число хромосом (ок. 10х, об. 100х).

Проведенный анализ показал, что метафазы с 56 хромосомами встречаются наиболее часто и составляют до 40% из всех 127 исследованных метафаз, а метафазы, в которых встретилось более 60 хромосом, составляют менее 5% из всей проанализированной выборки.

Причем во всех 123 исследованных метафазах не было обнаружено дицентрических хромосом (фиг. 6, а).

Важно отметить, что число хромосом в клетках рабдомиосаркомы РА-23 крыс исследовали ранее (Каминская и др. 1989) до проведения отбора по частоте клеток с мостами. Было установлено, что модальный класс находился в области 60-70 хромосом (фиг. 6, б).

В популяции клеток РА-23, селектировавшейся на повышение частоты клеток с мостами, определить число хромосом не удалось, так как эта популяция отличалась высокой плоидностью.

Изучение гетерогенности клеточной популяции опухолевых клонов по содержанию ДНК проводили методом проточной цитометрии. Исследованию были подвергнуты 1 исходный клон с ЧКМс 1,8%, 1 клон, отселектированный на повышенную частоту мостов, с ЧКМс 6,8% и смесь из 5-ти клонов, отселектированных на пониженную частоту мостов со средней ЧКМс 0,3%.

Из опухолевого материала механическим способом приготавливалась одноклеточная суспензия с концентрацией 1 млн клеток в 1 мл раствора Версена (ЭДТА), которая окрашивалась следующим образом: к 1 мл суспензии добавляли 0,1 мл 1%-го водного раствора тритона Х-100 (Flura, Швейцария), 0,02 мл раствора этидиума бромида (Aldrich-Ghemie, США) в концентрации 1 мг/мл, 0,004 мл оливомицина (Объединение "Мосмедпрепараты" им. Л.Я. Карпова, СССР) в той же концентрации и 0,05 мл 0,3 М раствора MgCl (Barlogie, B., 1976, Розанов Ю.М., 1988). Окраску проводили в течение 2 ч при температуре от 0 до 5^oC.

Исследование осуществлялось на проточном цитофлюориметре МД-116 (ГОИ им. С. И. Вавилова, Санкт-Петербург) со 128 канальным анализатором и ртутно-кварцевой лампой ДРШ-250-2 в качестве источника света. Проточный цитофлюориметр оснащен персональным компьютером IBM AT-486 с пакетом прикладных программ для изучения материала.

Проточная цитометрия ДНК показала, что клоны, селектируемые на повышенную и пониженную частоту клеток с мостами, различаются по профилю ДНК как между собой, так и от исходной популяции (фиг. 7). Так, в обеих вновь полученных популяциях присутствовал клон клеток с индексом ДНК 1,7, (т.е. количество ДНК в ядрах клеток этого клона было в 1,7 раза больше, чем в ядрах диплоидных клеток) отсутствовавший в исходной популяции. При этом популяции после 5-ти циклов отбора как на понижение, так и на повышение заметно различались между собой по количеству клеток данного клона (в первом случае присутствовало приблизительно 20% анеуплоидных клеток, а во втором - 7%). Кроме того, присутствовавший в небольшом количестве в исходной популяции клон гексаплоидных клеток (около 4%), не выявлялся на ДНК-цитограмме опухолевого клона, полученного в результате 5-ти циклов отбора на снижение степени кариотипической изменчивости, в отличие от ДНК-цитограммы клона с высокой частотой клеток с мостами, где количество гексаплоидных клеток возрастало до 20%.

Использованная литература 1. Кравцов В. Ю. , Яковлев А.Ф., Федорова Е.В., Вахтин Ю.Б. Отбор на снижение и повышение спонтанной нестабильности кариотипа в клеточных популяциях перевивной миеломы SP 2/0 мышей // ДАН СССР, т. 320, N 4, 1991, с. 1000 - 1003.

1. Савченко В. К., Михайлович Л.С., Кукушкина Л.М. Ассоциативный отбор клонов клеток китайского хомячка по комплексу количественных признаков. // Биополимеры и клетка. т. 2, 1986. с. 200 - 206.

3. Tsuji H., Takahashi E-I., Tsuji S., Tobari I., Shiomi T., Hama-Inaba H. , Sato K. Five different genes participate in the formation of baseline sister-chromatid exchanges and spontaneous chromosomal aberrations // Mutat. Res. 1987. Vol. 178. P. 99-106.

4. Emst T. , Jackson C., Bames D. Karyotypic stability of serum-free mouse embryo cells. // Cytotechlogy. 1991. N 5. P. 211 - 222.

5. Кравцов В.Ю., Федорова Е.В., Каминская Е.В., Гужова И.В., Яковлев А. Ф. , Вахтин Ю.Б. Межклональные и межпопуляционные различия по частоте спонтанных кариотипических изменений в клеточных популяциях перевивной рабдомиосаркомы PA-2 крыс. // Вопросы онкологии. т. 38, N 10, т. 38, 1992. С. 1228 - 1235.

6. Прокофьева-Бельговская А.А. Радиационные поражения хромосом на ранних стадиях развития лосося. // Цитология. т. 3, N 4. с. 437 - 445.

7. McClintock B. The production of homozygous deficient tissues with mutant characteristics be means of the aberrant mitotis behavior of ring-shaped chromosomes. // Genetics. 1938. Vol. 23. N 4. P. 315 - 376.

8. Казанцева И. А. Патология митоза в опухолях человека. Новосибирск, Наука, 1981, с. 144.

Формула изобретения

Способ селекции популяции клеток in vivo, включающий инъекцию клеток рабдомиосаркомы, выделение опухолевых клонов, отбор клеток по критерию степени нестабильности кариотипа, вторичную инъекцию отобранных клеток, повторение циклов отбора, отличающийся тем, что в качестве критерия степени нестабильности кариотипа используют показатель частоты клеток с мостами, при этом при отборе клонов с минимальным показателем получают популяцию клеток с пониженной степенью кариотипической нестабильности, а при отборе клеток с максимальным показателем получают популяцию клеток с повышенной степенью кариотипической нестабильности.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7