Фрагмент днк, кодирующий ген трнк цис (ааа) и способ его получения

Фрагмент днк, кодирующий ген трнк цис (ааа) и способ его получения

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии. Фрагмент ДНК, кодирующий ген тРНК Цис (ААА) с установленной нуклеотидной последовательностью, получают способом, при котором осуществляют получение олигомеров 5'-3' и 3'-5' Hind III/Pst и олигомеров 5'-3' и 3'-5' PstI/Bam H1. Олигомеры ренатурируют и формируют смесь для лигирования ренатурированных олигомеров и плазмиды pUC 18, расщепленной Hind III/Bam H1. Смесь инкубируют и трансформируют ей штамм Escherichia coli. Штамм культивируют на среде с ампицилином и X-гал. Отбирают трансформированные штаммы с плазмидами, содержащими фрагмент ДНК, и определяют последовательность его оснований. Изобретение обеспечивает синтез растущих пептидов на рибосомах Esherichia coli с использованием полученной синтетической тРНК. 2 с.п. ф-лы, 9 ил., 4 табл.

Изобретение относится, в общем, к синтезу пептидов in vitro, а более конкретно к синтезу растущих пептидов на рибосомах Escherichia cali с использованием разновидностей синтетической тРНК.

В течение длительного времени исследователи пытаются разработать методологию, которая сделает возможной эффективную модификацию и образование пептидов вне пределов живых клеток. Одним из технических компонентов такой попытки является модификация тРНК с измененным аникодоном или сайтами распознавания для энзиматического аминоацилирования. Модифицированные тРНК делают относительно простым замещение различных аминокислот в участке-мишени белка посредством образования единственного нового кодона, который моет прочитываться каждой из серий модифицированных тРНК-т.

Используя серии модифицированных тРНК по одной на каждую из различных аминокислот, специфическую аминокислоту можно включить в белок в том участке(ах) мишени, который представляет интерес. Поскольку в любой системе в большинстве случаев синтезируется только один белок, действие аминокислотного замещения на активность полипептида можно измерить напрямую без образования клона для каждого аминокислотного замещения и без проблем, часто связанных с экспрессией и последующей проверкой белка, который образуется в интактных клетках.

В конечном счете в связи с усовершенствованием способности предсказывать третичную структуру белка по его аминокислотной последовательности будет возможно производить полностью спланированные белки, используя мРНК, которая содержит только 20 кодонов, по одному на каждую из 20-и естественно существующих аминокислот, для которых имеется кодон в универсальном генетическом коде. Аминокислоты также могут быть включены в один или более специфических участков в белке путем использования модифицированных тРНК, содержащих антикодоны для некоторых из 41 неиспользованного кодона. Далее посредством использования предпочтительнее химического, чем энзиматического аминоацилирования модифицированных тРНК будет возможно включать в эти искусственные белки аминокислоты, которые не имеют естественно существующего партнера. Это сделает возможным проектирование, проверку и производство искусственных ферментов, которые используют каталитические механизмы и субстраты, которые не существуют в живых организмах.

Ацилирование тРНК специфической аминокислотой может быть выполнено путем либо химической, либо энзиматической реакции, в последнем случае используя аминоацил-тРНК синтетазы (АС). Методы химического аминоацилирования тРНК известны (Робертсон С.А. и др., 1989, Nucl. Acid Res., 17: 9649 - 9660; Хаген М. и др., 1988, J. Org. Chem., 53: 5040 - 5045).

В живых системах АС должна с высокой специфичностью распознавать как аминокислоту, так и тРНК, которую нужно аминоацилировать. Распознавание АС-зами разновидностей тРНК зависит от специфических структурных особенностей тРНК. Не существует одного единственного набора структурных особенностей у различных тРНК, который определяет их распознавание родственной АС./Ц, де Дюв, 1988, Nature, 333: 117 - 118. Очевидно, что многие из структурных особенностей для идентификации тРНК не являются строго консервативными у определенных разновидностей тРНК в различных организмах. Было обнаружено значительное разнообразие в специфичности аминоацилирования синтетических тРНК АС-зами из E.coli, дрожжей и ретикулоцитов кроликов, а также в условиях, при которых осуществляется аминоацилирование (температура, концентрация соли и опермина или опермидина). Выяснены некоторые принципы распознавания тРНК родственной АС. По-видимому, некоторые АС имеют жесткие требования ко всему антикодону, в то время как другие распознают только часть антикодона. Очевидно, Мет-тРНК АС является в высокой степени зависимой от антикодона ЦАУ (Гош Г. и др, 1990, Biochem, 29 : 2220 - 2225); АС для других тРНК могут требовать второго или третьего нуклеотида антикодона.

Ас-азы для других аминокислот, по-видимому, распознают особенности тРНК, которые являются независимыми от антикодона, но отвечают за участки положительного, а в некоторых случаях - отрицательного распознавания где-либо в другом месте структуры тРНК. Результат Шимелла и Хоу демонстрирует, что пара оснований ГЭ-Ц70 в аминокислотной шпильке тРНК Ала является первичным участком распознавания для Ала-тРНК АС (Хоу Ю.М. и др., 1988, Nature, 333: 140 - 145).

Теперь имеется потенциальная возможность спроектировать и получить in vitro синтетические тРНК, которые аминоацилируются энзиматически и могут быть использованы в бесклеточных трансляционных системах. Эти синтетические тРНК могут иметь большое значение для выяснения функции рибосомы, в особенности, в отношении движения растущего пептида внутри рибосомы и его свертывании в активную конформацию. Точное положение и конформация растущего пептида в процессе его формирования в рибосоме остаются неизвестными.

Целью изобретения, следовательно, является предоставление синтетических тРНК.

Другой целью изобретения является предоставление методов получения синтетических тРНК-т.

Следующей целью изобретения является предоставление полипептидов, образующихся in vitro с использованием синтетических тРНК.

В соответствии с настоящим изобретением тРНК^Цис, тРНК^Сер, тРНК^А₃^лаи тРНК^А_i^ла кодируются последовательностями ДНК, показанными на фиг. 1-4.

На фиг. 1-9 представлены последовательности для пЦИС, пСЕР, пАЛА и нФМЕТ. Последовательности для тРНК^Цис (ГЦА) и тРНК^Сер (ГГА) взяты из работы (Спринзл М. и др. 1984, Nucl. Acid Res. 12: г1 - г131). Указано расположение участков рестрикции и промотора РНК-полимеразы Т7 из 17 оснований. Буквы, показанные сверху каждой последовательности, представляют нуклеодиты в последовательности дикого типа, которые были замещены. В каждой тРНК подчеркнут антикодон ААА. 1А: ген тРНК^Цис (ААА) (пЦИС или последовательность 1Д, N 1) был сконструирован из четырех синтетических олигомеров, которые ренатурировали (отжиг) и лигировали с pUC18, расщепленной Hind 111/Bam H1. Эти четыре олигомера показаны сплошными линиями сверху и снизу последовательности пЦИС. Звездочкой над последовательностью пЦИС указано место, где было вставлено основание. 1В: ген тРНК^Сер (ААА) (пСЕР или последовательность 1Д, N 2) был сконструирован посредством копирования гена тРНК^Сер (ГГА) из генома E. coli при помощи ПЦР с использованием двух специфических затравок. Эти затравки показаны сплошными линиями сверху и снизу последовательности пСЕР. Для увеличения аминоацилирования в пСЕР произведена замена Т на А. 1С: ген тРНК^А_э^ла (ААА) (пАЛА или последовательность 1Д, N 3) был сконструирован посредством копирования гена тРНК^Ала (ГГЦ) из генома E.coli при помощи ПЦР. 1Д: ген тРНК^А_и^ла (ААА) (п. ФМЕТ или последовательность 1Д, N 4) был сконструирован посредством копирования гена тРНК^М_ф^ет (ЦАТ) из генома E.coli при помощи ГЦР. Звездочка над последовательностью пФМЕТ указывает место, где было вставлено основание. На чертежах показана анизотропия флуоресценции проб на аминоконце растущих пептидов в течение поли (У)-направляемой элонгации. Полипептидный синтез начинали либо с СРМ-фен-тРНК (фиг. 6), либо с СРМ-Сер-тРНК (фиг. 7); анизотропию контролировали в течение времени. На фиг. 7 и 8 синтез полифенилаланина показан незаштрифхованными треугольниками и точечной линией (.......), синтез полицистеина показан незаштрихованными кружками и пунктирной линией (- - -), а синтез полисерина показан заштрихованными кружками и сплошной линией (_______). Анизотропию измеряли в течение 60-м минутного периода при 20^oC с возбуждением флуоресценции при длине волны 385 нм и эмиссией при длине волны 475 нм. На чертежах показан поли(У)-направляемый синтез полиаланина с участием тРНК^А_э^ла (ААА). Ацфен-тРНК (0,5 мкМ) предварительно связывали с поли(У)программируемыми рибосомами (0,5 мкМ) для облегчения полиаланинового синтеза, используя либо 0,3 А₂₆₀ тРНК^А_и^ла (ААА) (незаштрихованные символы), либо 0,1 А₂₆₀ тРНК^А_э^ла (ААА) (заштрихованные символы) в качестве источника элонгаторной тРНК в конечном объеме 0,1 мл. Включение [14С] -аланина измеряли после инкубации при 37^oC в течение указанных отрезков времени посредством деацилирования всей аминоацилированной тРНК при помощи 0,5 М NaOH с последующим осаждением полиаланина с помощью 5 мл охлажденной на льду 10%-ной трихлоруксусной кислоты и определением радиоактивности осадка. Также был измерен синтез полиаланина в присутствии 4 мкМ эритромицина - в сравнительных целях ( - - -). Показаны спектры эмиссии свободных и связанных с рибосомой элонгаторной и инициаторной СРМ-Аал-тРНК^Ала (ААА).А. Измерения проводили в конечном объеме 600 мкл для свободных (-------) и связанных с рибосомой (- - -) тРНК. Концентрация рибосом составляла 0,5 мкМ. После добавления рибосом реакционные смеси инкубировали в течение 15 мин при 37^oC. Измерения флуоресценции проводили при 20^oC с возбуждением при длине волны 385 нм. После окончания измерений добавляли эритромицин в конечной концентрации 4 мкМ и следили за влиянием связывания эритромицина на спектр каждой тРНК-ы, связанной с рибосомой B. В другом эксперименте спектр эмиссии каждой тРНК изменяли после ее связывания с рибосомой. Позже добавляли спарзомицин (конечная концентрация составляла 5 мкМ). Измеряли спектр эмиссии. Затем добавляли пуромицин для получения его концентрации в 0,5 мкМ. Снова измерили спектр эмиссии (-..-..-). После измерения спектра эмиссии в присутствии пуромицина измерили флуоресцентную анизотропию каждого образца для того, чтобы убедиться, что не происходит никакого падения анизотропии, которое указывало бы на реакционную способность пуромицина.

Конформация растущего пептида при его вытягивании за пределы рибосомы, вероятно, является решающей в определении того, как свертывается окончательный пептидный продукт. Приведено неопровержимое доказательство того, что некоторые, а возможно и все растущие пептиды, образующиеся на естественных мРНК-х, выходят из рибосомы на внешней поверхности большой рибосомной субъединицы в точке, отдаленной от пептидил-трансферазного центра (Бернау Ц. и др. 1980, Proc. Natl. Acod. Sci. США 79 : 3111 - 3115). Участок растущих пептидов, содержащий 30 - 40 аминокислот, защищен от протеолиза рибосомой (Макин Л.И. и др., 1976, J/ Mоl. Biol., 26 : 329 - 346). Это может отражать длину пептида, требующего для покрытия расстояния между пептидил-трансферазным центром и областью выхода.

Конформация естественных растущих пептидов в момент оставления ими пептидил-трансферазного центра неизвестна. (Пикинг У.Д. и др. 1990, J. Biol. Chem. , 266 : 1534 - 1542) продемонстрировали, что в процессе элонгации растущие полифенилаланин и полилизин ведут себя соответственно по-разному при их формировании из поли(Y) и поли(A) соответственно. При попытке разобраться в этих результатах были созданы разновидности синтетической тРНК, которые способствуют поли(Y)-направленному синтезу полипептидов.

Материалы и химикаты. В предлагаемой заявке используются следующие сокращения, определяемые здесь как: ЭДТА, этилендиаминтетрауксусная кислота, двунатриевая соль: ХЕПЕС, N-(2-гидроксил)пиперазин-N'-2-этансульфокислота; ТРИС, трис-(гидроксиметил)аминометан; поли(Y), полиуридиловая кислота; поли(A), полиадениловая кислота; ацфен-тРНК, Фен-тРНК, которая была ацилирована по своей -аминогруппе; СРМ-Фен-тРНК, Фен-тРНК, которая была меркаптоацетилирована по своей -аминогруппе, а затем реагировала с СРМ; СРМ-Сер-тРНК, Сер-т-РНК^Сер (AAA), которая была меркаптоацетилирована по своей -аминогруппе, а затем реагировала с СРМ; СРМ, 3-(4-малеимидофенил)-7-диэтиламино- 4-метилкумарин; тРНК^Цис (AAA), синтетическая тРНК^Цис, которая содержит антикодон AAA; тРНК^Сер (AAA), синтетическая тРНК^Сер, которая содержит антикодон AAA; тРНК^А_э^ла (AAA), синтетическая элонгаторная тРНК, которая содержит антикодон AAA; тРНК^А_и^ла (AAA), синтетическая инициаторная тРНК, которая содержит антикодон AAA: ЛБ, среда ЛБ. Lennox X-гал, 5-бром-4-хлор-3-индолил- -D-галактопиранозид; ПЦР, полимеразная цепная реакция.

Плазмида pU C18 была приобретена у фирмы Bethesda Research Laboratories (Гэйтхерсбург, Мэрилэнд). Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы на синтезаторе 381А фирмы Applied Biosystems (Фостер Сити, Калифорния) и очищены на колонке OPC фирмы Applied Biosystems в соответствии с рекомендациями производителя. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы, ДНК-лигаза Т4, рНазин и рестрикционные эндонуклеазы были получены от фирмы Promega Biotec (Мэдисон, Висконсин), рестрикционные эндонуклеазы BstNI и BstBI были приобретены у фирмы New England Biolabs (Беверли, Миннесота). Реагенты ПЦР были получены от фирмы Perkin. Elmer Cetus (Норуолк, Коннектикут). Двухтяжевое секвенирование выполняли с использованием набора Секвеназа П фирмы United States Bioshemicals (Кливлэнд, Огайо). [ -35 S] дАТФ, [35 S] цистеин, [14C]фенилаланин и [14C]серин были приобретены у фирмы New England Nuclear (Бостон, Миннесота). Дезокси-, рибонуклеотиды и гуанозин монофосфат были получены от фирмы Pharmacia (Пискатауэй, Нью Джерси). CPM был получен от фирмы Molecular Probes (Джанкшн Сити, Орегон). Дрожжевая тРНК^Фен была получена от фирмы Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури). Очищенный фактор инициации 2 (ИФ-2) E. coli был щедрым подарком д-ра Ц.Гуалерци (Институт Молекулярной Генетики Макса Планка, Берлин). Агароза ГТГ Nusieve была получена от фирмы FMC (Роклэнд, Мэн). Спектра-гель А202 был приобретен у фирмы Fisher Scientific (Хьюстон, Техас). РНК-полимераза T7 была выделена из E.coli BL 21, содержащего плазмиду pAR1219, и очищена в соответствии с методом Н.Даванлу и др., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., США, 949 : 71 - 78. E. coli K12, штамм А19 исходно был предоставлен нам д-рами К.Нейрхаузом и Х.Г.Уитманном, Берлин. Рост и хранение этих организмов, а также выделение рибосомных субъединиц описано О.Одомсом и др., 1980. Biochemistry, 19 : 5947 - 5954.

Конструкция пЦИС. Синтетическая тРНК, которая ацилируется цистеином, была выбрана из-за легкости и специфичности, с которыми цистеин-сульфгидрильные группы могут реагировать с малеимидными или галоидилкильными производными флуорофоров. Предварительные исследования показали, что Цис-тРНК синтетаза распознает пару оснований 3:70 акцепторной шпильки тРНК, а не композицию оснований антикодона (Ю.М.Хоу и др., 1988, Nature, 33 : 140 - 145). Таким образом можно сформировать Цис-тРНК, которая будет распознавать поли(Y) в бесклеточной трансляционной системе.

Ген тРНК^Цис (AAA) (пЦис или последовательность IД, N 1), содержащий участок Hind 111, промотор РНК-полимеразы T7, мутантный ген E.coli, участок BstNI и участок BamHI, синтезировали, как показано на фиг. 1. Для того, чтобы сохранить, по возможности, наибольшее сходство с тРНК^Цис дикого типа, были изменены только три участка в последовательности ее оснований. Первый участок - антикодон был изменен с ACA^x на AAA. Затем для того, чтобы иметь возможность производить отбор трансформантов и дальнейшие генетические манипуляции, были созданы два внутренних участка рестрикции. В ножке Д был создан участок PstI путем замены оснований A21 и T24 на C21 и C24 соответственно. Для того, чтобы сохранить спаривание оснований в ножке, A10 было заменено на Г10. Участок SpeI был создан во внешней лопасти путем добавления основания А между основаниями У42 и С43.

В отдельных реакциях Hind 111/Pst1 олигомеры 5'-3' и 3'-5' и Pst1/BamH1 олигомеры 5'-3' и 3'-5' были ренатурированы нагреванием до 65^oC и медленным охлаждением до 25^oC. Полученные два двутяжелых олигомера лигировали и вставляли в pUC18, расщепленную Hind111/BamH1, путем инкубирования этих трех фрагментов в течение ночи при 16^oC с ДНК-лигазой Т4. Лигированной смесью трансформировали штамм E.coli XLIB и рассевали его на чашки с агаризованной средой ЛБ, содержащей ампициллин и X-гал. Из трансформантов с плазмидами, содержащими вставку, отбирали те, в которых присутствовал полный ген тРНК^Цис/(ААА); отбор проводили с использованием Spe1 - рестрикционного анализа плазмидной ДНК минилизатов. Затем определяли последовательность оснований обоих тяжей вставки.

Конструкция пСЕР. Как и в случае с Цис-тРНК-синтетазой, Сер-тРНК синтетаза распознает участки тРНК, отличающиеся от антикодона (Норманли Дж. и Абельсон Дж., 1989, Am. Rev. Biochem 58 : 1029 - 1049). Таким образом, синтетическую Сер-тРНК можно получать для использования в поли (Y)-направляемой трансляционной системе. Более легко по сравнению с химическим синтезом полной последовательности гена тРНК^Сер (ААА) (пСЕР или последовательность 1Д, N 2) были синтезированы два олигомера и использованы в качестве затравок в ПЦР для копирования гена из хромосомы E. coli (фиг. 2), 5'-затравка содержала четыре дополнительных нуклеотида на 5'-конце, 5' -3' Hind 111 последовательность, промотор РНК-полимеразы T7 и 43 основания тРНК, включая антикодон ААА, 3'-затравка включала четыре дополнительных нуклеотида, 3' -5' Bam H1 - и BstN1-последовательности и 12 оснований тРНК. В отличие от РНК^Цис дикого типа рестрикционный BstB1 находится в пределах петли T тРНК^Сер, что делает ненужным новый участок рестрикции для целей отбора.

0,1 мл Реакционной смеси ПЦР, содержащий 100 пмоль каждой затравки, 20 нг хромосомной ДНК E. coli и 10 единиц ДНК-полимеразы Tag 1, покрывали минеральным маслом и подвергали одному циклу в 5 мин при 94^oC, 29-и циклам в 1 мин при 94^oC, 2-х мин при 55^oC, 3-х мин при 72^oC и одному циклу в 1 мин при 94^oC, 2 мин при 55^oC, 10 мин при 72^oC. После окончания циклов реакционную смесь экстрагировали хлороформом, продукты разделяли электрофорезом в 4%-ном агарозном геле (ГТГ, Nusieve) с использованием 40 мМ трис-ацетат (pH 7,8) и 2 мМ ЭДТА. Основным продуктом был ожидаемый фрагмент из 124 п.о. После удаления агарозы фенольной экстракцией концы фрагмента из 124 п.о. были превращены в тупые с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы, а затем провели расщепление Hind 111 и Bam H1. После этого фрагмент лигировали с pUC18, расщепленной Hind 111/Bam H1 путем инкубации в течение ночи при 16^oC с ДНК-лигазой T4. Из трансформантов, содержащих плазмиду с вставкой, отбирали те, в которых присутствовал полный ген тРНК^Сер/(ААА); отбор проводили с использованием BstBI-рестрикционного анализа плазмидной ДНК минилизатов. Затем определяли последовательность оснований обоих тяжей вставки.

Расщепление пЦИС и пСЕР рестриктазой BstN1 приводило к линейной транскрипционной матрице, имеющей единственный выступающий 5'-тимидин, который является комплементарным 3'-концевому аденозину тРНК. Таким образом можно ожидать, что осуществление транскрипции на пЦИС и пСЕР, расщепленных BstN1, создаст РНК либо из 75, либо из 88 нуклеотидов соответственно, которые оканчиваются 3' АССА-последовательностью акцепторной ножки тРНК. Используя конечную концентрацию РНК-полимеразы T7 0,1 мг/мл, было получено 7 - 8 мкг тРНК на мкг матричной ДНК. Хотя Миллиган и Ахленбек (1989, Meth. Enzymel. 180 : 51 : 62) сообщили, что при трансскрибировании малых тРНК-т образуются незавершенные транскрипты, электрофорез в 20%-ных денатурирующих гелях показал только один основной РНК-продукт, остающийся после гель-фильтрационной хроматографии (данные не показаны).

Конструкция пАДА и пФМЕТ. Были получены две другие новые тРНК. Эти тРНК энзиматически аминоацилировались аланином и обладали антикодоном ААА, что позволяет им распознавать матрицу поли (Y). Первая тРНК, тРНК^А_з^ла (ААА), была сконструирована по аналогии с элонгаторной тРНК^Ала E. coli (Спринзл М. и др. , 1985, Nncl, Acids Res., 13: г1 - 104). Ген тРНК^А_з^ла (ААА) (пАЛА или последовательность 1Д, N 3) был сконструирован посредством копирования гена тРНК^Ала (ГТЦ) из генома E. col; с помощью ПЦР. Антикодон был изменен с ГГЦ на ААА. Далее для получения пАЛА следовали методам образования тупых концов, расщепления, лигирования, трансформации и отбора, которые применялись для пСЕР.

Вторая тРНК, тРНК^А_и^ла (ААА), являлась аналогом инициаторной тРНК^М_ф^ет E. coli и была сконструирована посредством копирования этого гена (Спринэл М. и др., 1985, Nucl. Acids. Res., 13 : г1 - г104). Хотя первичная структура этой тРНК была модифицирована для облегчения аминоацилирования и транскрипции in vitro, те особенности, которые считаются необходимыми для инициаторной функции, были сохранены. Эти особенности включают неУорсон-Криковскую пару оснований на конце акцепторной шпильки (Сеонг В.Л. и др., 1987, Ргос. Natl. Acad. Sci. США, 84 : 334 - 338; Уакао Х. и др., 1989, J. Вiol. Chem, 264 : 20363 - 20371), пару оснований пиримидин-11-пурин-24 в дигидроуридиновой ножке (Сеонг В.Л. и др., 1987) и серии остатков гуанина и цитозина в антикодоновой ножке, которые образуют три последовательные пары оснований Г-Ц (Сеонг В.Л. и др., 1987).

Следующие изменения были сделаны в тРНК^М_ф^ет дикого типа при формировании гена тРНК^А_и^ла (ААА) (пФМЕТ или последовательность 1Д, N 4): основания А заменили основания C и T в антикодоне гена с образованием антикодона ААА: основания Г заменили основания 1C и 3C; основания Т заместили основания 70Г и 72А; основание А было вставлено между основаниями гена 17С и 17аТ. Методы, примененные для получения тупых концов, расщепления, лигирования, трансформации и скрининга пСЕР, затем использовали для образования пФМЕТ.

Транскрипция in vitro. Плазмидную ДНК для транскрипции готовили путем расщепления ее рестиктазой BstN1 (3) ед/мкг в течение одного часа при 60^oC. Смесь экстрагировали фенолом, ДНК осаждали этанолом. ДНК в линейной форме (40 мкг) добавляли к 2 мл транскрипционной смеси, содержащей 50 мМ ХЕПЕС-КОН (pH 7,6), 10 мМ дитиотрейтола, 50 мМ NaCl, 4 мМ спермидина, 25 мМ MgCl₂, 1,6 мМ ГТФ, 4 мМ ГМФ, АТФ, СТФ, УТФ, 50 ед pHазина, и 0,1 мг/мл РНК-полимеразы Т7. После инкубирования в течение 2 ч при 37^oC матричную ДНК расщепляли с помощью 100 ед ДНКазы1, свободной от РНКаз. Короткие незавершенные транскрипты, лНТФ-ы и рНТФ-ы отделяли от транскриптов тРНК при помощи гель-фильтрации с использованием спектра-геля А202, уравновешенного 10 мМ ТРИС-HCl (pH 7,6), 1 мМ ЭДТА и 150 мМ NaCl. Фракцию тРНК экстрагировали один раз семсью фенол/хлороформ/изоамидовый спирт (25 : 24 : 1), один раз смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24 : 1), а затем дважды осаждали этанолом.

Аминоацилирование тРНК. Синтетические РНК-ты аминоацилировали с использованием синтеза пшеничных проростков, которые присутствуют в белках фракции S-150, осажденных 0 - 70%-ным раствором сульфата аммония (Лакс С. и др. , 1986, Meth. Enzymol 118 : 109 : 128). Типичная смесь содержала 100 мМ ХЕПЕС-КОН (pH 7,8), 15 мМ Mg (ОАц)₂, 2 мМ спермидина, 5 мМ дитиотрейтола, 5 мМ АТФ, 30 мкМ соответствующей радиоактивной аминокислоты (100 Сi моль), 0,8 мг/мл синтетазной фракции и 0,5 - 1 А₂₆₀ тРНК/мл; смесь инкубировали в течение 20 мин при 27^oC. Эффективность аминоацилирования определяли путем осаждения тРНК трихлоруксусной кислоты и измерения радиоактивности отфильтрованного осадка при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Хотя тРНК^Цис (ААА) была получена из гена тРНК^Цис E. coli дикого типа, она не может аминоацилироваться синтетазой фракции S-150 E. coli. А синтетазы, которые содержат фракцию S-150 проростков пшеницы, осажденную 0 - 70% сульфатом аммония, действительно аминоацилируют тРНК^Цис (ААА). Эта ферментная фракция также эффективно аминоацилирует синтетическую тРНК^Сер (ААА). На основании результатов реакций трансляции, в которых участвовала только фракция S-150 E. coli, можно заключить, что тРНК^Сер (ААА) также может быть достаточно хорошо аминоацилирована синтетазами E. coli (см. табл. 1).

Дрожжевая тРНК^Фен была аминоацилирована с использованием фракции S-150 E. coli в качестве источника аминоацил-тРНК-синтетазы (Хардести В. и др., 1971, Meth. Enzymol. 20 : 316 : 330), тРНК^Сер (ААА), тРНК^А_з^ла (ААА) и тРНК^А_и^ла (ААА) аминоацилировали с использованием синтетазной фракции проростков пшеницы, которая описана выше. Для использования в неэнзиматической инициации трансляции Фен-тРНК, Сер-тРНК, Ала-тРНК^А_э^ла (ААА) и тРНК^А_и^ла (ААА) аминоацилировали по их -аминогруппе методом Раппопорта и Лапидо (1974, Meth. Enzymol 29 : 685 - 688).

Эффективность аминоацилирования была различной для разновидностей синтетической тРНК, тРНК^Цис (ААА), транскрибированную in vitro можно было аминоацилировать только на 20%, в то время как более 55% тРНК^сер (ААА) было аминоацилировано синтетазами проростков пшеницы (данные не показаны). К несчастью цис-тРНК^Цис (ААА) была нестабильна, что препятствовало ее выделению после аминоацилирования.

Нестабильность цис-тРНК^Цис (ААА) препятствовала и последующей очистке, однако для дальнейшего исследования реакцию аминоацилирования можно было скомбинировать с реакцией трансляции E. coli. Напротив, сер-тРНК^Cер (ААА) была очень стабильной на протяжении неоднократных манипуляций, в процессе которых она была очищена и помечена кумарином.

Аминоацилирование тРНК^А_э^ла (ААА) в обычной практике достигало около 60% (пмоль включенного Aла/пмоль тРНК) при использовании синтеза из проростков пшеницы или из фракции S-150 E. coli, истощенной по тРНК, в качестве источника амино-тРНК-синтетазы. Аминоацилирование тРНК^А_и^ла (ААА) достигало около 20% с любым препаратом синтетазы. Ни в одном случае не наблюдалось, чтобы любая тРНК была аминоацилирована какой-либо аминокислотой, отличающейся от аланина (данные не показаны).

В табл. 1 представлен поли(У)-направляемый синтез полифенилаланина, полицистеина и полисерина. Все реакции были инициированы неэнзиматически путем предварительного связывания 60 пмоль Ацфен-тРНК или АцСер-тРНК в концентрации, равной концентрации рибосом в течение 5 мин при 37^oC. Все образцы были инкубированы при 37^oC в течение 30 мин; в это время концентрацию NaOH в образцах доводили до 0,1 М, а затем из инкубировали еще 15 мин при комнатной температуре для гидролиза связи тРНК-аминокислота. Белки реакционной смеси затем осаждали трихлоруксусной кислотой и отфильтровывали. Отфильтрованное вещество высушивали и измеряли его радиоактивность. Образцы при 28^oC инкубировали 120 мин перед измерением включения [35S] цистеина.

Трансляция in vitro с использованием синтетических тРНК. Для проверки синтетической активности тРНК^Цис (ААА) и тРНК^Сер (ААА), каждая из них была использована для поли(У)-зависимого полипептидного синтеза. Поли(У)-зависимое включение [14С]фенилаланина в полифенилаланин измеряли (Одом О. и др., 1980). Для неэнзиматической инициации 0,6 мкМ Ацфен-тРНК или АцСер-тРНК предварительно связывали с 0,6 мкМ рибосом E.coli в присутствии поли(У) в течение 10 мин при 37^oC (Пикинг У.Д. и др., 1990). Для того, чтобы проверить чувствительность к эритромицину антибиотик в конечной концентрации 5 мкМ добавляли до этапа предварительной инкубации. Включение [14С]серина в полисерин проводили точно также, как и синтез полифенилаланина за исключением того, что тРНК^Фен E.coli была заменена на 1,17 А₂₆₀/мл синтетической тРНК^Сер (ААА). Элонгацию начинали путем добавления фракции S-150 E.coli к конечному объекту 100 мкл.

Эксперимент по трансляции был модифицирован для облегчения поли/-(У)-зависимого синтеза полицистеина. Ацфен- тРНК или АцСер-тРНК/60 пмоль предварительно связывали с 60 пмоль рибосом, как описано выше. Затем смесь доводили до 100 мкл всем необходимым для трансляции за исключением тРНК и аминокислоты. Для начала полицистеинового синтеза реакцию аминоацилирования Цис-тРНК^Цис (ААА), описанную выше, соединяли с реакцией трансляции посредством добавления равных объемов реакционных смесей для каждой реакции с образованием конечного объема в 200 мкл. Затем реакционную смесь инкубировали при 37^oC в течение 30 мин или при 28^oC в течение 120 мин для предоставления возможности реаминоацилирования тРНК^Цис (ААА) цистеинил-тРНК-синтетазой пшеничных проростков, для того, чтобы проверить конформацию и окружение каждого растущего пептида. СРМ-Фен-ТРНК или СРМ-Сер-тРНК предварительно связывалось, как описано выше. Для обеспечения того, чтобы основная масса флюорофора действительно была связана, концентрация флуоресцентного аналога аминоацил-тРНК была снижена на, приблизительно, 10% по отношению к концентрации рибосом. Мечение СРМ аминокислотной группы каждой из двух синтетических [14С] аланил-тРНК также выполняли, как описано предварительно для природных и синтетических тРНК-т. СРМ-Ала-тРНК очищали при помощи C₁ обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии, в сущности, как описано для СРМ-Сер-тРНК^Сер (ААА).

Результаты трансляции in vitro с использованием синтетических Цис- и Сер-тРНК-т и тРНК^Фен дикого типа показаны в табл. 1. Включение цистеина измеряли как при 37, так и при 28^oC. Более низкая температура делает возможным большее реаминоацилирование тРНК^Цис (ААА) ферментом пшеничных проростков. Все реакции трансляции были инициированы неэнзиматически с Ацфен-тРНК или АцСер-тРНК, которые предварительно связывались с рибосомами в молярном соотношении 1:1 в присутствии поли(У). Были образованы шесть типов реакционных смесей с рибосомами, несущими растущие полипептиды с N-Ацфен и N-АцСер на аминоконце в каждой третьей смеси соответственно. Также была проверена чувствительность синтеза каждого полипептида к подавлению 5 мкМ эритромицина. Параллельно для инициации каждого полипептида использовали [14С] Ацфен-тРНК в присутствии немеченой аминокислоты для того, чтобы оценить число рибосом, которые полностью активны в синтезе каждого типа растущего пептида (данные не показаны).

Более 1500 пмоль фенилаланина было включено в полифенилаланин в присутствии или отсутствии эритромицина (см. табл. 1). Было определено, что 30% (18 пмоль) рибосом в реакционных смесях было активно в полифенилаланиновом синтезе. Используя это значение, было вычислено, что растущие полифенилаланиновые пептиды составляют, приблизительно, 80 аминокислот в длину. Так как синтетическую тРНК^Сер (ААА) можно аминоацилировать при помощи неочищенной фракции S-150 E.coli, синтез полисерина выполняли таким же образом, как и синтез полифенилаланина. В том случае, однако, только около 500 пмоль серина было включено в полисерин. Этот синтез подавлялся эритромицином приблизительно на 90% (см. табл. 1). Только около 10% рибосом было активно в полисериновом синтезе, которые, однако, также давали среднюю длину пептида, приблизительно в 80 аминокислот (данные не показаны).

При 37^oC 99 пмоль цистеина включались в полицистеин в течение 30 мин. Процесс на 41% подавлялся эритромицином (см. табл. 1). По произведенной оценке 15% (10 пмоль) рибосом было активно в полицистеиновм синтезе, что соответствует средней длине пептида, приблизительно в 10 аминокислот. Следует отметить, что этот синтез проводили в соединенной системе - аминоацилирование (пшеничные проростки): трансляция (E.coli). Только очень ограниченное реаминоацилирование тРНК синтетазой пшеничных проростков может осуществляться при 37^oC. Для подбора лучших условий полицистеионовый синтез также инициировали при 28^oC и проводили его при этой же температуре в течение 120 мин (см. табл. 1). В этом случае было включено 247 пмоль. Как и при 37^oC, 10 пмоль рибосом было активно в полицистеиновом синтезе, что дает среднюю длину пептида, приблизительно в 25 аминокислот в этом случае.

Больший масштаб полифенилаланинового синтеза (большая средняя длина пептида, более высокое соотношение рибосом с растущими пептидами) в поли(У)-направляемой трансляционной системе может отражать атипичные свойства фенилаланиновых пептидов. Очевидно, что короткие фенилаланиноновые пептиды более легко осаждаются трихлоруксусной кислотой, чем короткие пептиды серина или цистеина. Это может способствовать относительно большей общей величине включения фенилаланина и, вероятно, является главным фактором, ответственным за относительно низкий процент рибосом, которые, по-видимому, активны в синтезе полисерина или полицистеина. Другим фактором, который может содействовать относительно большой величине общего включения фенилаланина, является протяженное время, в течение которого поддерживается почти линейная скорость пептидного синтеза в процессе образования полифенилаланина. Снижение скорости пептидного синтеза, которое наблюдается для большинства пептидов, отличающихся от полифенилаланина, может отражать подавление продуктом (реакции). (Спирин А.С. и др., 1988, Science, 242: 1162 - 1164). Наблюдали почти линейные скорости синтеза в течение многих часов, если пептидный продукт удаляли из реакционной смеси по мере его образования. Растущие полифенилаланиновые пептиды являются настолько нерастворимыми, что они могут эффективно удаляться из раствора во время реакции, приводя таким образом к ситуации, равноценной той, что складывается в непрерывно действующей трансляционной системе.

Результаты, представленные в табл. 1, также демонстрируют, что пол(У)-направляемый синтез полицистеина и полисерина с участием синтетических тРНК является чувствительным к подавлению эритромицином. В противоположность этому, синтез полифенилаланина не подавляется антибиотиком при тех же условиях. Это согласуется с предшествующими наблюдениями (Чинали Т. и др., 1988, Biochem. Biophy. Acta. 949: 71 - 78; Отака Т. и др., 1975, Proc. Natl. A. Sci. , США, 72: 2649 - 2652; Васкуез Д., 1979. Молекулярная биология, биохимия и биофизика, Шпрингер-Ферлаг, Берлин, т. 30, с. 312) и поддерживает гипотезу о том, что эта разница в чувствительности к эритромицину является результатом свойств самого растущего пептида.

Были сделаны попытки провести поли(У)-зависимый полипептидный синтез с использованием Ала- тРНК^А_э^ла (ААА) и Ала- тРНК^А_и^ла (ААА). Полипептидный синтез был облегчен предварительным связыванием N-ацетилпроизводных Фен-тРНК, Ала- тРНК^А_э^ла (ААА) и Ала- тРНК^Ала_{и u} (ААА). N-ацетилирование аминоацил-тРНК выполняли с N-гидроксисукцинимидным эфиром уксусной кислоты в соответствии с методом Раппопорта и Лапидо (1974). Неэнзиматическое связывание тРНК с рибосомами выполняли в смеси 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 100 мМ NH₄Cl, 15 мМ Mg (OAY)₂, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мг/мл поли(У), 0,5 мкМ рибосом и 0,5 мкМ ацилированной тРНК. Полиаланиновый синтез инициировали, как описано, предварительно для полифенилаланина (Пикинг У.Д. и др., 1991, J. Biol. Chem. 266: 1534 - 1542) и полисерина - как описано выше, за исключением того, что [14С] аланин и либо тРНК^А_з^ла (ААА), либо тРНК^А_и^ла (ААА) были использованы в качестве источников аминокислоты и тРНК, тРНК^А_э^ла (ААА) была использована в конечной концентрации 1 А₂₆₀ ед./мл, ед./мл, в то время как тРНК^А_и^ла (ААА) была использована в концентрации около 3А₂₆₀ для достижения приблизительно одинаковых количество аминоацилированной тРНК во всех экспериментах с полиаланином. Включение [14С] аланина в полиаланин определяли, как описано предварительно Пикингом У.Д. и др., 1991.

Только тРНК^А_э^ла (ААА) поддерживала поли(У)-зависимый полиаланиновый синтез (фиг. 5). Синтез полиаланина, зависимый от синтетической элонгаторной тРНК, был линейным на протяжении более, чем 60 мин при 37^oC (фиг. 5), и на протяжении более, чем 2 ч при 20^oC (данные не показаны). Напротив, при использовании тРНК^А_и^ла (ААА) синтез полиаланина был только слегка выше фоновых уровней (фиг. 5). Интересной особенностью синтеза полиаланина в этой системе является то, что он чувствителен к подавлению эритромицином (фиг. 5). Это противоположно тому,