Способ получения живой коревой вакцины

Способ получения живой коревой вакцины

Реферат

 

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вакцинных препаратов. Для приготовления живой коревой вакцины суспензию аттестованных диплоидных клеток культуры Л-68 с концентрацией 200-300 тыс. кл/мл заражают вакцинным штаммом вируса кори Л-16. Множественность заражения составляет 0,1 - 0,01 ТЦД 50/кл. Культивируют зараженные клетки при температуре 32 - 35^oC. После образования монослоя его освобождают от балластных белков ростовой среды путем шестикратных отмывок питательной средой. Осуществляют сбор вируссодержащей жидкости не реже 1 раза через каждые 24 ч. Вирусные сливы с титром 5-6 lg ТЦД 50/0,5 мл и содержанием белка не более 16 мкг/мл объединяют. Освобождают их от клеточного детрита путем фильтрования, стабилизируют сорбитом-желатозой и подвергают лиофильному высушиванию. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вакцинных препаратов.

Известен способ получения живой коревой вакцины (ЖКВ) путем культивирования вакцинного штамма вируса кори Л-16 в первично трипсинизированной культуре клеток, например культуре клеток почек морских свинок, фибробластах эмбрионов безлейкозных кур, фибробластах эмбрионов японских перепелов [1]. В состав вакцины входят вакцинный штамм Л-16, культуральная жидкость и стабилизатор сорбит-желатоза.

ЖКВ по известному способу получают путем размножения вируса кори (штамм Л-16) в культуре фибробластов японских перепелов в течение 15 - 20 сут. при температуре 35 + 1^oC с последующим сбором вируссодержащей культуральной жидкости и сменой питательной среды через 2 - 3 сут., очисткой при помощи фильтрации или низкоскоростного центрифугирования, стабилизацией вируса сорбитом-желатозой в конечной концентрации 5% и лиофилизацией. Титр вакцины составляет 3,5 - 4,0 lg ТПЦ 50/0,5 мл.

Недостатками известного способа являются биологическая и генетическая нестандартность первичной культуры клеток, используемой для производства вакцины; возможность контаминации посторонними микроорганизмами в процессе получения культуры клеток; трудность работы с перепелиным яйцом; необходимость организации отдельного участка по получению первичной культуры клеток, обеспеченного квалифицированным персоналом и необходимым оборудованием (инкубатор, термостат, ламинар-бокс, холодильник, центрифуга, столы просмотра и обработки яиц, темная комната); наличие постоянно действующей перепелиной фермы, поставляющей эмбрионы перепелов, свободных от вируса лейкоза. Кроме того, в производстве ЖКВ по известному способу используется сыворотка крови крупного рогатого скота, не имеющая сертификата качества на отсутствие посторонних вирусов и обладающая анафилактогенными свойствами.

Задачей предлагаемого изобретения является создание новой простой и стандартизованной технологии производства получения живой коревой вакцины.

Для решения этой задачи при производстве ЖКВ производят замену субстрата, а именно замену первичной культуры клеток японских перепелов на аттестованный штамм диплоидных клеток Л-68. Культура клеток Л-68 заложена на хранение в виде посевного и рабочего банков и имеет сертификат национального контрольного органа - ГИСК им. Л.А. Тарасевиа. Сведений об использовании культуры клеток Л-63 для приготовления коревой вакцины в доступных источниках информации не обнаружено.

Вакцину готовят из вакцинного штамма Л-16 вируса кори (получен от Смородинцева А.А., Тарос Л.Ю. - авторов штамма) путем культивирования в диплоидных клетках легкого эмбриона человека Л-68 (ВСКК (МБЧ) N 18(9) 175).

Для решения этой задачи суспензию аттестованной культуры Л-68 с концентрацией клеток 200 - 300 тыс. кл/мл заражают вакцинным штаммом вируса кори Л-16 (из посевного банка вируса, аттестованного ГИСК им Л.А. Тарасевича) с множественностью 0,1 - 0,01 ТЦД 50/кл и культивируют при температуре 32 - 35^oC; после образования монослоя его освобождают от балластных белков ростовой среды путем шестикратных отмывок питательной средой; начиная с 3 - 4 сут. после заражения, осуществляют сбор вируссодержащей жидкости каждые 24 ч; вирусные сливы с титром 5 - 6 lg ТЦД 50/0,5 мл и содержанием белка не более 16 мкг/мл объединяют, освобождают от клеточного детрита путем фильтрования, стабилизируют сорбитом-желатозой и подвергают лиофильному высушиванию.

Новыми признаками способа по сравнению с прототипом являются следующие: использование в качестве клеточного субстрата для производства ЖКВ аттестованного штамма диплоидной культуры клеток Л-68, заложенного на хранение в ампулах в виде посевного и рабочего банков в криохранилище и обеспечивающего стандартные биологические и генетические характеристики субстрата; использование клеточной суспензии (с концентрацией 200 - 300 тыс. кл/мл) с множественностью заражения 0,1 - 0,01 ТЦД 50/кл; культивирование зараженных клеток в роллерах при температуре 32 - 35^oC и скорости вращения роллеров 2 - 12 об/мин; сбор вируссодержащих сливов через 24 ч с последующей заменой поддерживающей средой; сокращение общего цикла наработки вируса до 8 -10 дней.

Кроме того, преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что снимается вероятность загрязнения ЖКВ посторонними микроорганизмами, встречающимися на поверхности яйца или в эмбрионе; освобождаются помещения и оборудование участка приготовления первичной культуры клеток фибробластов японских перепелов, исключаются дорогостоящие и трудоемкие этапы доставки эмбрионов перепелов из специализированных ферм, получения и контроля каждой партии культуры клеток, что делает новый способ приготовления ЖКВ экономически более выгодным.

Полученная вакцина характеризуется высокой иммуногенностью, безвредностью, менее выраженным побочным действием на иммунную систему, стерильна, не обладает нейровирулентными и анафилактогенными свойствами.

Совокупность всех существенных признаков изобретения экспериментально найдена авторами, не известна из опубликованных источников информации, соответствует критерию "Изобретательский уровень".

Пример 1. Для приготовления жидкого полуфабриката коревой вакцины используют клетки рабочего банка диплоидного штамма легкого эмбриона человека Л-68. Рабочий банк клеток Л-68 приготовлен из одной ампулы посевного банка на 17 пассаже, охарактеризован в соответствии с требованиями ВОЗ и рекомендован для производства МИБП национальным контрольным органом - ГИСК им Л.А. Тарасевича.

Ампулу с суспензией клеток Л-68 извлекают из жидкого азота, размораживают при 37^oC, обрабатывают 70%-ным раствором спирта, асептически вскрывают; переносят клетки в культуральный сосуд (КС). Медленно небольшими порциями вносят питательную среду Игла МЕМ, доводят концентрацию клеток до 125000 кл/мл. Клетки инкубируют 3 - 4 сут. при температуре 36,5 + 0,5^oC, после чего пересевают с коэффициентом рассева 1 : 3 - 1 : 5 в соответствии с паспортом культуры. Пересевы повторяют каждые 3 - 4 сут. до получения необходимого количества клеточного субстрата. Отбирают КС с характерным для диплоидных клеток монослоем. Культуральную жидкость сливают, монослой промывают дважды смесью растворов 0,25% трипсина и 0,02% версена в пропорции 1 : 4 и оставляют при температуре 36,5 + 0,5^oC на 5 - 10 мин до отделения клеток от стекла. Клетки ресуспендируют в 50 мл свежей среды Игла МЕМ, обогащенной 10%-ной эмбриональной сывороткой КРС. Суспензию клеток из нескольких КС объединяют, определяют концентрацию клеток; добавляют свежую ростовую среду Игла МЕМ, обогащенную 10% эмбриональной сыворотки КРС, доводя концентрацию клеток до 250000 мл/кл. Взвесь клеток заражают вирусом кори Л-16 из посевного банка с множественностью заражения 0,1 - 0,01 ТЦД 50/кл. Суспензию перемешивают, разливают в роллерные бутыли, которые культивируют в роллерных установках при температуре 35 - 36^oC до образования монослоя (1 - 2 сут.). Клетки подвергают шестикратному отмыванию средой Игла МЕМ без антибиотиков, затем вносят поддерживающую среду Игла МЕМ без сыворотки и антибиотиков и продолжают культивирование при температуре 32 - 35^oC и скорости вращения роллеров 2 - 12 об/мин. Начиная с 3 - 5 сут. от момента заражения клеток, при появлении цитопатического действия вируса каждые 24 ч удаляют всю поддерживающую среду и заменяют ее свежей порцией поддерживающей среды. Сбор вируссодержащей жидкости проводят многократно до тех пор, пока на поверхности стекла сохраняется 50% клеток (5 - 6 сут.). Вирусные сливы с титром не менее 5 - 6 lg ТЦД 50/0,5 мл объединяют, добавляют стабилизатор сорбит-желатоза (в конечной концентрации 5%) и подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 2. Культивирование вируса кори Л-15 проводят, как описано в примере 1, используя разные условия культивирования (множественность заражения клеток вирусом, скорость вращения роллеров, режим сливов). Результаты культивирований представлены в табл. 1.

Пример 3. Суспензию клеток, восстановленную из рабочего банка, как описано в примере 1, выращенную в нескольких КС, ресуспендированную в 50 мл свежей питательной среды, обогащенной 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, объединяют, определяют концентрацию клеток. Путем добавления свежей питательной среды, обогащенной 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота, доводят концентрацию клеток до 200 - 300 тыс. кл/мл. Взвесь клеток заражают вирусом кори Л-16 из посевного банка с множественностью заражения 0,1 - 0,01 ТЦД 50/кл. Суспензию перемешивают, разливают в культуральные сосуды и выращивают в стационарном монослое при температуре 37^oC до образования монослоя (1 - 2 сут.). Клетки подвергают шестикратному отмыванию средой Игла МЕМ без антибиотиков, затем вносят поддерживающую среду Игла МЕМ без сыворотки и антибиотиков и продолжают культивирование при температуре 32 - 35^oC. Начиная с 3 - 5 сут. от момента заражения клеток при появлении цитопатического действия вируса через каждые 24 ч удаляют всю среду и заменяют ее свежей порцией поддерживающей среды. Сбор вируссодержащей жидкости проводят многократно до тех пор, пока на поверхности стекла сохраняется 50% клеток (5 - 6 сут.). Вирусные сливы с титром не менее 5 lg ТЦД 50/0,5 мл объединяют, добавляют стабилизатор сорбит-желатоза (в конечной концентрации по 5%) и подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 4. Контроль антигенных свойств вируса кори Л-16, пассивированного на культуре клеток Л-68 или фибробластах японских перепелов, проводят в РТГА с сыворотками крови морских свинок, предварительно иммунизированных культуральной жидкостью, содержащей вирус кори в дозах 2,84 - 6,20 lg ТЦД 50/0,5 мл. Результаты контролей приведены в табл.2.

Результаты показали высокие антигенные свойства вируса кори Л-16, пассированного на диплоидной культуре клеток Л-68.

Пример 5. Контроль экспериментальных серий живой коревой вакцины на биологическую активность, содержание белка, антибиотиков, микоплазмы, посторонних вирусов и бактерий, специфичность, безвредность, анафилактогенность, точность розлива, антигенную активность и при необходимости нейровирулентность проводят в соответствии с ВФС [2]. Стерильность проверяют высевом на тиогликолевую среду по методике, изложенной в "Сборнике инструкций" [3]. Полученные данные приведены в табл. 3.

Пример 6. Контроль остаточной нейровирулентности проводят на обезьянах. Для этого обезьянам интрацеребрально в оба зрительных бугра вводят живую коревую вакцину (серии 61, 85), приготовленную на культуре клеток Л-68, в количестве 4000 ТЦД 50 (по 10 обезьян на серию, 4 - в контроле). В течение опыта все обезьяны находятся под клиническим наблюдением, при этом ни у одного животного не было отмечено клинических проявлений поражения центральной нервной системы (ЦНС). Через месяц после инокуляции вакцины животные были забиты. Проведено гистологическое изучение различных отделов головного и спинного мозга (всего 1000 срезов), показавшее наличие у всех животных слабовыраженных морфологических изменений в зоне инокуляции Во всех других изученных отделах ЦНС патологических реакций не установлено. Использование серии вакцины в дозе 4000 ТЦД 50 (2 человеческие дозы) нейровирулентными свойствами не обладали.

Пример 7, отличающийся от примера 6 тем, что обезьянам интрацеребрально вводят жидкий полуфабрикат живой коревой вакцины, приготовленной на основе культуры клеток Л-68, в дозе 16000 ТЦД 50 (8 человеческих доз). Проведенное гистологическое исследование различных отделов головного и спинного мозга (всего 300 срезов) показало отсутствие признаков поражения нейронов в изученных областях и патологических реакций в различных отделах желудочковой системы. Таким образом, жидкий полуфабрикат живой коревой вакцины (с. 61), введенный в дозе 16000 ТЦД 50, нейровирулентными свойствами не обладает.

Источники информации 1. Руководство по вакцинному и сыворотному делу. /Под ред. П.Н. Бургасова. М.: Медицина, 1978, с. 220 - 223.

2. ВФС 42-179 ВС-88. Вакцина коревая культуральная живая сухая.

3. Сборник инструкций по общим методам контроля стерильности, физико-химических свойств, пирогенности, на отсутствие контаминирующих агентов и токсичности МИБП. Приказ МЗ СССР N 31 от 13.01.83.

Формула изобретения

1. Способ получения живой коревой вакцины путем заражения и культивирования вируса кори Л-16 на клеточном субстрате в ростовой и поддерживающей питательных средах с последующим сбором вируссодержащей жидкости, освобождения от клеточного детрита, стабилизации сорбитом-желатозой и лиофилизацией, отличающийся тем, что из клеточных субстратов используют суспензию диплоидных клеток легкого эмбриона человека Л-68 с концентрацией 200 - 300 тыс.кл. /мл, заражение проводят с множественностью заражения 0,1 - 0,01 ТЦД 50/кл, а сбор вируссодержащей жидкости осуществляют не реже 1 раза каждые 24 ч культивирования.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование зараженных культур ведут в роллерах при температуре 32 - 35^oC и скорости вращения роллеров 2 - 12 об/мин или в стационарном монослое при выращивании клеток в культуральной посуде.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование зараженных культур ведут на микроносителях при температуре 32 - 35^oC и скорости перемешивания 5 - 100 об/мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 10.12.2006        БИ: 34/2006

PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя

(73) Патентообладатель(и):Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU)

Адрес для переписки:630559, Новосибирская обл., Новосибирский р-н., р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Дата публикации: 20.03.2012