Вакцина, способная сообщать хозяину иммунитет против инфекции, вызванной streptococcus группы b, способ предупреждения инфекции, вызванной streptococcus группы b, и способ ослабления инфекции, вызванной streptococcus группы b

Вакцина, способная сообщать хозяину иммунитет против инфекции, вызванной streptococcus группы b, способ предупреждения инфекции, вызванной streptococcus группы b, и способ ослабления инфекции, вызванной streptococcus группы b

Реферат

 

Изобретение относится к вакцине, способной вырабатывать иммунитет у реципиента против инфекции, вызванной стрептококками группы B. Вакцина включает в себя полисахарид, конъюгированный с белком. При этом указанные белок и полисахарид являются характерными молекулами стрептококков группы B. Используемый белок является рекомбинантным белком S1 и кодируется плазмидой pJMSI АТСС N 40659. Вакцина индуцирует T-независимый иммунитет против инфекции, вызываемой стрептококками группы B. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл.

Изобретение относится к области микробиологии и вакцинной технологии и направлено на разработку вакцины, способной вырабатывать иммунитет против инфекции, вызванной бактериями группы B Streptococcus.

Бактерии рода Streptococcus являются возбудителями многих заболеваний человека и животных. Стрептококки подразделяются на иммунологические группы на основе присутствия специфических углеводных антигенов на их клеточных поверхностях. В настоящее время известны трептококки групп A- O (Davis B.D. и др., Microbilogy, 3-е изд., с. 609 (Harper & Rom, 1980).

Стрептококки являются одними из наиболее известных и серьезных возбудителей заболеваний человека.

Хотя стрептококки группы B ассоциируются с болезнями животных (например, такими, как маститы у рогатого скота), однако бактерия Streptococcus agalactiae (стрептококк группы B) является основной причиной возникновения неонатального сепсиса у человека в США, который по установленным данным уносит свыше 6000 жизней ежегодно Hill H.P. и др., Sexually Transmitted Diseases, McGraw Hill, с. 397-407). Стрептококки группы B являются также основными патогенами затяжных менингитов у детей, послеродовых эндометритов, и нарушений иммунологической реактивности у взрослых людей (Patt erson, M.J. и др., Bact. Rev. 40:774-792(1976)). Хотя человеческий организм и восприимчив к действию антибиотиков, однако, острое начало заболевания и быстрое развитие сепсиса у новорожденных и менингитов у детей приводит к высокому проценту заболеваемости (50%) и смертности (20%) Baker C.J. и др., New Eng. J. Med. (Editorial) 314(26): 1702-1704 (1986); Baker, C.J. и др., J. Infect.Dis. 136:137-152 (1977)).

Streptococcus группы B является основным компонентом нормальной микрофлоры влагалища и прямой кишки человека. Хотя в большинстве случаев инфецирование новорожденных происходит интернатально в результате вагинальной колонизации, однако, имеются случаи также внутрибольничного заражения новорожденных, которые описаны, например, Patterson M.J. и др., Bact. Rev. 40: 774-792 (1976)). Однако лишь небольшой процент инфекций у детей, вызванных стрептококком группы B, развиваются в серьезные заболевания. При этом следует отметить, что роль хозяйских факторов и детерминат бактериальной вирулентности в механизме перехода от колонизации до инфекции не совсем ясна.

Очевидно, за вирулентность и иммунитет ответственны некоторые белки стрептококков группы B (Ferrieri P., Rev. Infect. Dis. 10:S363, 1988). В 1975 г. Lancefield обнаружил способность белков C стрептококков группы B вырабатывать защитный иммунитет (Lancefield, R. C. и др., J. Exp.Med. 142: 165-179 (1975)). По всей вероятности указанная группа белков содержит несколько различных полипептидов и антигенных детерминант. С точки зрения этих исследователей, усилия по предупреждению инфекций, вызываемых Streptococcus группы B, должны быть направлены на профилактическое введение антибиотиков и на разработку вакцины против стрептококков группы B (Baker C.J. и др., Rev. of Infect. Dis. 7:458-467 (1985)), Baker C.J. и др., New Eng. J.Med.(Editor al) 314(26): 1072-1704 (1986)). Полисахаридные вакцины против стрептококков группы B описаны Kasper D. L. (патенты США 4 207 414 и заменяющий патент PE3172, а также патент США 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221, 4 367 221, 4 367 222 и 4 367 223), Carlo D. L. (патент США 4 413 057, публ. Европатента 38265), и Yavordios D. и др. (публ. Европатент 71515); все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

За исключением небольшой группы детей с установленным риском материнской колонизации стрептококками группы B и другими факторами риска в перинатальном периоде, в большинстве случаев использование антибиотиков в профилактических целях либо не проводилось, либо не давало эффективных результатов (Boyer K. M. , и др., New Eng. J. Med. 314(26):1665-1669(1986)). Интернатальная химиопрофилактика также не получила широкого распространения по следующим причинам: практически невозможно установить материнскую колонизацию Streptococcus группы B быстрым, надежным и экономически эффективным способом; около 40% новорожденных появляется на свет в обстановке пониженного риска; практически трудно выявить и/или обработать всех матерей или детей с потенциально высоким риском; и фактически невозможно осуществить профилактическую обработку антибиотиками для предупреждения затяжного менингита (7200 случаев в год в США) или послеродового эндометрита (45000 случаев в год) (Baker C.J. и др., New Eng. J. Med. (Editorial) 314:1702-1704, (1986).

Хранение микроорганизмов.

Плазмиды pJMSI и pJMS23 происходят от плазмиды pUX12, которая содержит ДНК, способную кодировать антигенные белки Streptococcus, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением. Плазмида pUX12 происходит от плазмиды pUC12. Плазмиды pJMSI и pJM223 были депонированы 15.099.1989 в Американской коллекции типовых культур, Роквил, M.D. под входящими номерами АТСС 40659 и АТСС 40660 соответственно.

Streptococcus agalactiae является наиболее известным патогеном, вызывающим сепсис новорожденных в США, и уносящим от 6000 до 10000 жизней в год. Хотя группоспецифический капсульный полисахарид стрептококка группы B является иммуногенным и имеет важные защитные антигены, однако, клинические испытания полисахаридной вакцины показали недостаточную реактивность (Baker C. J. и др., New Engl. J. Med. 319:1180 (1980); Insel R.A. и др. New Eng. J. Med (Editorial) 319:(18):1219-1220 (1988)).

Настоящее изобретение направлено на разработку конъюгатной вакцины к стрептококкам группы B (т. е. Streptococcus agalactiae), где используется протективный белковый антиген, полученный в результате экспрессии гена, клонированного из Streptococcus группы B. Эта новая конъюгатная вакцина имеет то преимущество, что она вырабатывает Т-независимый иммунитет посредством адъювантного действия белка-носителя, а также вносит дополнительные протективные эпитопы, которые присутствуют на клонированном белке Streptococcus группы B (Insel R. A. и др., New Eng, J. Med (Editorial) 319(18): 1219-1220, (1988)); Baker C. J. и др. , Rev. of Invec. Dis. 7: 458-467 (1985)).

В частности, настоящее изобретение относится к конъюгатной вакцине, способной сообщать иммунитет хозяина против инфекции, вызываемой стрептококками группы B и содержащей (a) полисахарид, конъюгированный с (b) белком, причем как полисахарид, так и белок являются характерными молекулами Streptococcus группы B.

Изобретение также относится к способу предупреждения или аттенуации инфекции, вызываемой Streptococcus группы B, который заключается в том, что пациенту с предполагаемым риском заражения вводят эффективное количество конъюгатной вакцины, способной сообщать иммунитет хозяина против указанной инфекции, и содержащей: (a) полисахарид, конъюгированный с (b) белком; причем как полисахарид, так и белок являются характерными молекулами Streptococcus группы B.

Кроме того, изобретение относится к способу предупреждения или ослабления инфекции, вызываемой Streptococcus группы B, который заключается в том, что беременным женщинам вводят эффективное количество конъюгироватной вакцины, способной сообщать иммунитет еще неродившемуся ребенку против указанной инфекции и содержащей: (a) полисахарид, конъюгированный с (b) белком; причем как полисахарид, так и белок являются характерными молекулами Streptococcus группы B.

Изобретение также относится к способу предупреждения или ослабления инфекции, вызванной Streptococcus группы B, который заключается в том, пациенту с предполагаемым риском заражения указанной инфекцией вводят эффективное количество антисыворотки, взятой от другого индивидуума, которому была введена конъюгатная вакцина, способная сообщать иммунитет против инфекции и содержащая: a) полисахарид, конъюгированный с b) белком; причем как полисахарид, так и белок являются характерными молекулами Streptococcus группы B.

Фиг. 1, 2, 3 иллюстрируют модификацию плазмиды puC12, осуществленную для получения плазмиды puX12; на фиг. 2 представлены рестрикционные карты вставок стрептококков группы B в гибридных плазмидах: (a) pPHC10. Фрагменты субклонировали из рекомбинантных фагов ⁺ и ⁺ соответственно, в соответствующие сайты полилинкера p C18. Рестрикционные сайты обозначены следующими аббревиатурами: E - EcoRI; BL - BalI; EV - EcoRV; Hp - HpaI; P - PstI; H - Hind III; Bg lII. - омега, инсерции фрагмента; _ направление транскрипции; kb - тысяча пар оснований ДНК; на фиг. 3 представлена рестрикционная карта ДНК-вставки GBC в плазмиде pJMS23 и Hind III - фрагмент 5,5 kb. Рестрикционные эндонуклеазные сайты показаны на нижней линии, а расположение TnS - инерций - на верхней линии и обозначены черточками и кружками. Результаты Вестерн-блоттинга, представляющие экспрессию предполагаемых клонированных генов, проиллюстрированы кружочками: - полноразмерные генные продукты, - частичные генные продукты; - генные продукты не обнаружены. Сайты расщепления рестрикционных эндонуклеаз обозначены следующими аббревиатурами: B - Bam HI; Hc - Hin cIII; Hd - Hind III; N - NheI; S - StyI; на фиг. 4 представлена рестрикционная и транскрипционная карта плазмиды pUX12; на фиг. 5 - модификации, внесенные в плазмиду pUX12 для получения плазмиды pUX12+1 с рамкой считывания +1 (A), и плазмиды pUX12-1 с рамкой считывания - 1 (C). (B) представляет собой конструкцию, которая способна дополнительно продуцировать плазмиду с рамкой считывания -1; на фиг. 6 - исследования иммунитета мышей с использованием кроличьей антисыворотки против S1 и S23. Иммунитет наблюдали у мышей, инокулированных антисывороткой против S1 (p < 0,002) или антисывороткой против S23 (p < 0,022). Из-за размера исследуемых проб, различия между наблюдаемыми статистическими значениями в экспериментах S1 и S23 являются незначительными. На этой фигуре вверху над каждой полосой указано количество мышей, выживших после испытания.

Описание предпочтительного осуществления изобретения.

Иммунопрофилактика матерей с использованием вакцины против Streptococcus группы B была предложена в целях защиты матери и ребенка от заражения, осуществляемой посредством перинатального переноса антител (Baker C.J. и др., New Eng. J. Med. (EditoriaI) 314(26): 1702-1704 (1986): Baker C.J. и др., New Eng. J. Med. 319:1180 (1988); Baker C.J. и др., J. Infect. Dic. 7:458 (1985)). Как и в случае других инкапсулированных бактерий, восприимчивость к инфекции коррелирует с отсутствием группоспецифических антител (Kasper D.L., и др. , J. Clin. Invest. 72:260-269 (1983); Kasper D.L. и др., Anti biot. Chemother. 35: 90-100 (1985)). Отсутствие "опсонически" активных группоспецифических антикапсулярных антител к Streptococcus группы B является фактором риска для развития заболевания в результате колонизации стрептококками группы B (Kasper D.L. и др., J.Infect.Dis. 153: 407-415, 1986).

Один из способов вакцинирования предусматривает использование очищенных группоспецифических капсулярных полисахаридов.

Способы получения таких вакцин и их использование для иммунизации против Streptococcus группы B были описаны Kasper D.L. (патент CША 4 207 414 и замена патента США PE31672, а также патенты США NN 4 324 887, 4 356 263, 4 367 221, 4 367 222 и 4 367 223), Carlo D.J. (патент США 4 413 057, публикация Европатента 38265) и Yavordios D. и др., (публикация Европатента 71515) (все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

Хотя полисахаридная капсула стрептококков группы B хорошо изучена, и уже известно, что она играет важную роль в индуцировании как вирулентности, так и иммунитета (Kasper D.L. J. Infect. Dis. 153:407 (1986)), однако, было обнаружено, что ее иммуногенность варьируется в зависимости от вида капсулы и факторов иммунной системы хозяина (Baker C.J., и др.; Rev. Infect. Dis. 7: 458-467 (1985)). Недавно проведенные клинические исследования по оценке вакцины, содержащей капсульный полисахарид стрептококков группы B, показали иммунный ответ в целом 63%, что свидетельствует о том, что указанная вакцина не обладает оптимальной иммуногенностью (Baker C.J. и др., New Eng. J. Med 319(18):1180-1185 (1988)).

Различие в иммуногенности наблюдалось также и при испытаниях капсульных полисахаридов других бактерий. Например, вакцина против менингококка типа C является высокоактивной, тогда как полисахаридная вакцина против менингококка типа B является неиммуногенной (Kasper D.L. и др. J. Infect. Dis. 153: 407-415 (1986)). Т-независимые функции иммунной системы хозяина часто бывают необходимы для повышения иммунного ответа к полисахаридным антигенам. Отсутствие Т-независимого иммунного ответа к полисахаридным антигенам может быть причиной низкого уровня антител против Streptococcus группы B у матерей, дети которых впоследствии заражаются стрептококками группы В. Кроме того, дети в возрасте от 18 до 24 месяцев обычно плохо вырабатывают иммунный ответ к Т-независимым антигенам.

Детерминанты вирулентности и иммунитета у Streptococcus группы B.

Существуют пять серотипов стрептококков группы B, которые имеют общий группоспецифический полисахаридный антиген. Однако антитела этой группы антигена не являются протективными в живых моделях. Первоначально с помощью техники, использующей преципитин, Lancefield подразделял стрептококки группы B на четыре серотипа (Ia, Ib, II и III). Состав и структура уникальных группоспецифических капсульных полисахаридов для каждого серотипа были затем определены Jennings H.J. и др., Biochem. 22:1258-1264 (1983), Kasper D.L. и др. J. Infect. Dis. 153: 407-415(1986), Wessels M.P., и др. Trans. Assoc. Amer. Phys. 98: 384-391 (1985). Пятый серотип Ic был определен Wilkinson путем идентификации белкового антигена (первоначального названного белком Ibc), присутствующего во всех штаммах серотипа Ib и в некоторых штаммах с капсулой типа Ia (Wilkinson H.W., и др. J. Bacteriol. 97:629-634 (1969), Wilkinson H. W., и др. Infec. and Immun. 4:596-604 (1971). Затем было установлено, что этот белок по своей распространенности варьируется между различными серотипами стрептококков группы B, и отсутствует в серотипе Ia (Johnson D.R. и др. J. Clin. Microbiol. 19:506-510 (1984)).

Недавно номенклатура была изменена и классификация серотипов Streptococcus группы B проводилась лишь на основании капсульных группоспецифических полисахаридов; при этом был также описан пятый капсульный тип (тип IV) (Pritchard D.G. и др., Rev. Infec. Dis. 10(8):5367-5371, 1988). Поэтому при типировании штаммов стрептококков группы B больше не принимался во внимание антигенный Ibc-белок, который теперь уже именуется белком C. Штамм типа Ic был переклассифицирован в серопит Ia на основании состава его капсульного полисахарида, учитывая также дополнительную информацию относительно белка C.

Иммунологические, эпидемиологические и генетические данные позволяют предположить, что группоспецифическая капсула играет важную роль при выработке иммунитета к инфекциям, вызываемым стрептококками группы B. В последнее время состав и структура группоспецифических капсульных полисахаридов и их роль в вирулентности и иммунитете являются объектом интенсивных исследований (Ferri eri P. и др., Infec/ Immun. 27:1023-1032 (1980), Kranse R.M. и др. , J. Exp. Med. 142:165-179 (1975), Levy N.J. и др., J. Infec. Dis. 149: 851-860 (1984), Wagner B., и др., J. Gen. Microboil. 118:95-105 (1980), Wessel M.R. и др., Trans. Assoc, Amer. Phys. 98:384-391 (1985)).

Специалисты придерживаются различных мнений относительно структурного расположения группоспецифических и стрептококковых полисахаридов группы B на поверхности клетки относительно иммунологически важных факторов, связанных с группоспецифическими полисахаридами, а также относительно механизмов капсуло-детерминированной вирулентности стрептококков группы B (Kasper D.L. и др. , J. Infec. Dis. 153:407-415 (1986)). Для изучения роли капсулы в вирулентности Rubens и др. использовали метод транспозонного мутагенеза в целях получения изогенной линии Streptococcus группы B типа III, которая является неинкапсулированной (Rubens C. E. и др., Proc. Nat I. Acad. Sci. США, 84: 7208-7212 (1987)). Этот эксперимент показал, что, например, в модели новорожденной крысы потеря капсулы приводит к значительному снижению вирулентности. Однако вирулентность клинических изолятов с одинаковым строением капсулы также широко варьировалась. Это дает основание предположить, что помимо капсулы, в патогенезе стрептококков группы B играют роль и другие бактериальные факторы.

Были также описаны некоторые белки и другие бактериальные продукты, которые входят в состав стрептококков группы B и роль которых в вирулентности и иммунитете еще не установлена, например, такие, как CAMP (Кристин-Аткинс-Мунх-Петерсона) фактор, пигмент (вероятно каротиноид), R-антиген, X-антиген, антифагоцитные факторы, и недостаточно определенные "легочные токсины (Ferrieri P. и др., J. Exp. Med. 151: 56-68 (1980), Ferrieri P. и др., Rev. Inf. Dis. 10(2): 1004-1071 (1988), Hill H.R. и др., Sexually Transmitted Diseases Mc Graw Hill, стр. 397-407). Белок C обсуждается ниже.

Изогенные линии стрептококков группы B, не содержащие гемолизина, не показывают уменьшения вирулентности в моделях новорожденных крыс (Weiser J.N. и др. , Infec. and Immun. 55:2314-2316 (1987)). Однако в клинических изолятах, ассоциированных с инфекцией, гемолизин и нейраминидаз присутствуют не всегда. CAMP-фактор является внеклеточным белком стрептококка группы B с молекулярной массой 23500 Да, который в присутствии стафилококкового бета-токсина (сфингомиелиназа) вызывает лизис мембран эритроцитов. Ген, кодирующий CAMP-фактор в стрептококке группы B, недавно удалось клонировать и экспрессировать в E.coli (Schneewind O., и др., Infec. and Immun. 56:2174-2179 (1988)). Роль (если она вообще имеет место) CAMP-фактора, X- и R-антигенов, и других факторов, перечисленных выше, в патогенезе стрептококков группы B не раскрывается в прототипах (Fehrenbach F., и др., In : Bacterial Protein Toxins, Gustav Fischer VerIag, Штуттгарт (1988); Hill H.P. и др., Sexyally Transmitted Diseases, McGraw Hill, W.Y, стр. 297-407 (1984)).

Белки C относятся к группе белковых антигенов, ассоциирующихся с клеточной поверхностью стрептококков группы B, и первоначально были экстрагированы из стрептококков группы B (WiIkinson H.W., и др., J. Bacteri 01.97:629-634 (1969), Wilkinson H. W. и др., Infec and Immun 4:597-604 (1971)). Эти исследователи использовали нагретую соляную кислоту (HCl) для экстракции клеточной стенки и трихлоруксусную кислоту (TCA) для осаждения белковых антигенов. Были описаны две популяции белков C, отличающихся по своей антигенности, а именно: (1) группа белков, подверженных разложению пепсином, но не трипсином, и именуемых либо TR - (трипсин-резистентными), либо -белками, (2) другая группа белков стрептококков группы B, подверженных разложению как пепсином, так и трипсином, и обозначаемых либо TS - (трипсин-восприимчивыми) или -белками (Bevanger L. и др., Acta Path. Microbio. Scand Sect. B. 87: 51-54 (1979), Bevanger L. и др., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B 89: 205-209 (1981), Bevanger L. и др., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B 91: 231-234 (1983), Bevanger L. и др., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 93: 113-119 (1985), Bevanger L. и др., Asta Path. Microbi ol. Immunol. Scand. Sect. B. 93: 121-124 (1985), Johnson D.R., J. Clin. Microbi ol. 19:506-510 (1984), Russell-J ones G.J., и др., J. EXP. Med. 160:1476-1484 (1984).

В 1975 г. Lancefield и др. использовали исследования мышиного иммунитета, проводимые с помощью антисыворотки, взятой у кроликов, для определения функциональной способности белков C к продуцированию защитного иммунитета против штаммов стрептококков группы B, несущих аналогичные белковые антигены (Lancefi eld R. C. и др., J. Exp. Med. 142:165-179 (1975)). Многими исследователями были получены неочищенные препараты антигенных белков, происходящих от стрептококков группы B и называемых белками C, путем химического экстрагирования из клеточной стенки с использованием либо HCl, либо детергентов (Bevanger L. , и др., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 89: 205-209 (1981), Bevanger L. и др., Acta Path. Microbio. Scand. Sect. B. 93: 113-119 (1985), Russell-Jones G.J., и др., J. Exp. Meg. 160:1476-1484 (1984), Valtonen M. V. и др., Microb. Path. 1:191-204 (1986), Wilkinson H.W., и др., Infec. and Immun 4:596-604 (1971). Полученные значения размеров этих антигенов варьируются между 10 и 90 кДа, но ни один вид этих белков не был выделен или охарактеризован (Ferri eri P. и др. , Rev. Inf. Dis. 10(2): 1004-1071 (1988)).

Посредством скрининга с использованием протективной антисыворотки белки C могут быть обнаружены приблизительно в 60% клинических изолятов стрептококков группы B и были обнаружены во всех серотипах, но с различной частотой встречаемости (Johnson D. R., и др., J Clin. MicrobioI. 19:506-510 (1984)) Отдельные изоляты стрептококков группы B ( далее сокращенно - стрептококки B) могут иметь как TR-, так и TS -антигены, или либо один, либо другой из этих антигенов. За исключением способности частично очищенных антигенов вырабатывать защитный иммунитет, роль этих антигенов в патогенезе не исследовалась in vitro. In vivo - исследования штаммов стрептококков В,имеющих белки C, позволяют предположить, что белки C могут быть ответственными за резистентность к опсонизации (Payne N. R. и др., J.Infec. Dis 151:672-681 (1982)), и могут ингибировать внутриклеточный киллинг стрептококков B после фагоцитоза (Payne N. R. и др., Infec. and Immun 55:1243-1251 (1987). Было установлено, что линии типа II стрептококков B, несущие белки C, являются более вирулентными в модели сепсиса новорожденных крыс (Ferrieri P. и др., Immun. 2751023-1032 (1980), Ferrieri P. и др., Rev. Inf. Dis. 102:1004-1071 (1988). Поскольку генетические данные о белках C отсутствуют, то изогенные линии, не содержащие белков C, ранее не были исследованы. Очевидно, что один из TS, или - белков C связываются с IgA (Russell-Jones G.J. и др., L. Exp. Med. 160: 1476-1484 (1984)). Однако влияние связывания IgA белками C на вирулентность, если оно вообще имеет место, не раскрывается.

В 1986 г. Вальтонен и др. выделили белки стрептококков группы B из супернатантов клеточных культур, которые вырабатывали иммунитет в мышиных моделях (Waltonen M.V. и др., Microb. Path. 1:191-204 (1986))/ Они идентифицировали и частично очистили трипсин-резистентные белки стрептококков B с молекулярной массой 14 000 Да. Антисыворотка с этими белками, полученная от кроликов, индуцировала у мышей иммунитет против их последующего заражения стрептококками группы B типа lb (иммунитет 89%).Этот белок по определению Лансфилда является белком C. Однако при использовании антисыворотки против этого белка для экстрактов иммунопреципитата антигенов стрептококков B был обнаружен ряд реактивных белков с более высоким молекулярным весом. Это позволяет предположить, что белок с молекулярной массой 14 000 может представлять собой общий эпитоп для нескольких белков стрептококков B, либо он представляет собой продукт разложения, обнаруженный в супернатантах культур стрептококков. B. Разница в размерах белков C, выделенных из бактериальных клеток и из супернатантов, дает основание предположить, что белки C могут представлять семейство генов и поддерживать антигенное многообразие как механизм защиты против иммунной системы.

Разнообразие полученных молекулярных масс и трудности в очистке отдельных белков C влекут за собой проблемы, аналогичные тем, с которыми сталкивались многие исследователи при выделении белка M стрептококков группы A (Dale J. B., и др., Infec. and Immun 46(1)267-269 (1984), Fis chett: V.A и др., J, Exp. Meo. 144:32-53 (1976), Fischetti V.A. и др., J.Exp. Med. 146:1108-1123 (1977). Ген, кодирующий белок M, выделен и клонирован, в результате чего было установлено, что он содержит ряд повторяющихся ДНК-последовательностей (Hollin gshea S.K., т др., J. Biol. Chem. 261:1677-1686 (1986), Scott J. R., и др. , Prolc. Natl, Acad. Sci. США 82:1822-1826 (1986), Scott J. R. и др., Infec. fnd Immun. 52:609-612 (1986)). Эти повторяющиеся последовательности могут быть ответственными за посттранскрипционный процессинг, результатом которого является разнообразие размеров продуцируемых белков M. Механизм указанного эффекта не установлен. Различие молекулярных масс, полученных для белков C стрептококков B, может быть результатом аналогичного процесса.

Cleat и др. попытались клонировать белки C, используя препараты антисыворотки против стрептококков B, полученной от Bevanger ( и ) , для скринирования библиотеки ДНК стрептококков B в E.coli (Bevanger L. и др., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B. 93:113-119 (1985), Claet P.H. и др., In f ec. and Immun., 55(5):1151-1155 (1987); все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Эти исследователи описали два клона, которые продуцировали белки, связывающие с антистрептококковыми антителамии. Однако им не удалось установить, обладают ли клонированные белки способностью вырабатывать защитные антитела, либо преобладание этих генов связано с линиями стрептококков B, которые, как известно, содержат белки C. Роль последовательностей клонированных генов в вирулентности стрептококков B не исследована. После того, как было установлено, что белки C обладают способностью вырабатывать защитные антитела, этим исследователям все же не удалось получить доказательство того, что любой из этих клонов кодирует белок C.

Конъюгантная вакцина изобретения.

Изобретение позволяет устранить описанные выше недостатки уже имеющихся вакцин против стрептококков B посредством разработки конъюгатной вакцины, в которой капсульные полисахариды ковалентно связаны с остовом белка. Этот способ направлен на продуцирование T-зависимосго гуморального иммунного ответа на капсульные полисахаридные антигены и позволяет "обойти" требования T-независимости для продуцирования антитела (Baker C. и др., Rev. Infec. Dic. 7:458-467 (1985), Kasper D.L. и др., J. Infes. Dis. 153:407-415 (1986), все указанные работы вводятся в настоящее описание в виде ссылки).

В конъюгантной вакцине антигенная молекула такая, как капсульный полисахарид стрептококка B (обсуждается ниже), ковалентно связана с белком-носителем или полипептидом. Эта связь служит для повышения антигенности конъюгантной молекулы. Способы получения конъюгантных вакцин из антигенной молекулы и белка-носителя или полипептида известны специалистам (Jacob C.O. и др., Eur. J. Immunol. 16:1057-1062 (1986); Parker. M. P. и др., Modern Approaches to Vaccines, Chanock R.M., и др., Eds., стр.133-138, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Habor, Ny (1983); Zurawsk: V.P., и др., J. Immun ol. 121: -122-129 (1978); Kl: pstein F.A., и др., Infect. Immun. 37:550-557 (1982); Bessler W. G. Immunobiol. 170:239-244 (1985); Posnett D.N. и др., J. Biol. Chem. 263: 1719-1725 (1988); Chose A.C. и др., Molec, Immunol. 25:223-230 (1988); все указанные работы вводятся в настоящее описание в виде ссылки).

Ранее разработанная модель конъюгатной вакцины была направлена против Hemophilus influenzae (Anderson P. , Infec. and Immun. 39:322-238 (1983); Chu, C. и др. , Infec. Immun. 40:245-256 (1983); Lepow M. Pediat. Infect. Dis. J. 6:804-807 (1987); все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки), и эта модель может быть использована при конструировании новых вакцин изобретения. Другие способы получения таких конъюгатных вакцин раскрываются Anderson P. W. и др. (публикация Европатента 245045; Anderson P.W. и др., патент США NN 5673574 и 4761283; Prank P. и др., патент США 4789735; публикация Европатента 206852; Gordon L. K. патент 4619828; и Beachey E. H. патент США N 4284537; все указанные работы вводятся в настоящее описание посредством ссылки).

В конъюгатных вакцинах против Hemophilus influenzae для остовов белков использовали белки, не имеющие общих антигенных свойств с целевым организмом, из которого были получены бактериальные капсульные полисахариды (Ward J. и др., Vaccines, Plotkin S.A. и др., Eds., Saunder, Филадельфия, с. 300 (1988)).

В противоположность этому в конъюгатной вакцине изобретения в качестве остова используются иммуногенные белки стрептококков B. Как было установлено, такой способ позволяет получить более эффективные вакцины (Insel R.A. и др., New Eng. J. Med. (Editorial) 319(18): 1219-1220 (1988)). Конъюгатная вакцина изобретения, состоящая из белка и полисахарида, является первой вакциной, в которой могут быть использованы белки стрептококков B. В конъюгатных вакцинах изобретения в качестве белков могут быть использованы любые белки, которые являются характерными для стрептококков группы B. Однако для целей изобретения предпочтительно использовать белок C стрептококков группы B. Как будет показано ниже, плазмиды pjMS1 и pJMS23 содержат ДНК, кодирующую стрептококковый белок C. Наиболее предпочтительными белками C являются белки, полученные путем экспрессии указанных ДНК в бактериях.

Как указывалось выше, изобретение относится к клонированию и экспрессии генов, кодирующих протективные белковые антигены стрептококков B. Указанные белки предпочтительно используются в качестве белковых остовов, с которыми связываются капсульные полисахариды стрептококков B с образованием конъюгатной вакцины против указанных бактерий. Кроме того, роль этих белков в вирулентности и иммунности стрептококков группы B может быть использована для разработки дополнительных средств терапии против инфекции, вызываемой стрептококками B. Выделение и характеризация этих генов бактериального происхождения позволит осуществлять обработку генных продуктов в целях оптимизации адъювантных и антигенных свойств полипептидного остова/носителя конъгатной вакцины.

Генетические исследования белков C.

Таким образом, изобретение относится к клонированию белков C стрептококков группы B, их роли и вирулентности и иммунитете, и их способности служить в качестве иммуногена для конъюгатной вакцины против стрептококков группы B.

Несмотря на большое количество литературы, посвященной клонированию во многих группах Streptococcous, лишь ограниченное количество работ раскрывает манипуляции, осуществленные в Steptococcus группы B (Macrina F.L., Ann. Rev. MicrobioI. 38: 193-219 (1984), Waneger A.R. и др., Infec. and Immun. 55: 1170-1175 (1987)). Наиболее широко используемая техника манипулярования в Streptococcus группы B относится к разработке Tn 916 и его использование в транспозонном мутагенезе (Rubens C.E. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 85: 7208-7212 (1987), Wanger A. R., и др., Res. Vet. Sci. 38:202-208 (1985)). Однако, поскольку очевидно, что имеется более чем один ген, кодирующий белки C, и иммунная антисыворотка связывается с несколькими белками, то скринирование на гены для белка C путем траспозонного мутагенеза является практически неэффективным.

В изобретении клонирование белков C и любых других белков, оказывающих влияние на вирулентность стрептококков группы B или на иммунитет против стрептококков группы B, осуществляется с использованием нового плазмидного вектора. Для этих целей желательно использовать такой вектор клонирования, который можно было бы быстро скринировать на экспрессию белков, способных связываться с естественно продуцируемым антителам к стрептококкам группы B. Поскольку эти антитела являются гетерологичными поликлональными антителами, а не моноклональными антителами, то необходимо, чтобы используемый вектор можно было бы легко скринировать посредством многих позитивных клонов для идентификации нужных генов.

Для скринирования клонов на экспрессию антигенов, связывающихся со специфической антисывороткой, могут быть использованы стандартные способы (Aruffo A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. США 84:8573-8577 (1977). Наиболее широко используемая система GT11, была разработана Young и Davis (Huynh T.V. и др. , DNA CIOning, A Practi cal Approach vol.1. (Glover D.M. ed.) IRL Press, Вашингтон, стр. 49-78); Wong W. W. и др., J. Immunol. Methods. 82: 303-313 (1985); все указанные работы вводятся в настоящее описание в виде ссылки). Эти способы позволяют проводить быстрое скринирование клонов, экспрессированных в лизоненном фаге, продукты которого выделяются посредством фагового лизиса. При использовании этой системы обычно сталкиваются с проблемами, связанными с необходимостью субклонирования ДНК-фрагментов в плазмидные векторы для более детального рестрикционного картирования, получения зондов и ДНК-секвенирования. Кроме того, получение ДНК из фаговых культур является довольно трудоемкой процедурой и ограничивает число потенциально положительных клонов, которые могли бы быть эффективно исследованы. И наконец, получение сырых экстрактов белка из клонированных генов в фаговых векторах-хозяевах является проблематичным.

Для решения указанных проблем в изобретении используется плазмидный вектор, который была разработан в целях скрининга клонированной бактериальной хромосомной ДНК для экспрессии белков, причастных к вирулентности и/или иммунитету. Кроме того, изобретение относится к разработке и использованию эффективного вектора клонирования, который может быть быстро отобран для экспрессии белков, связывающихся с естественно продуцированными антителами к стрептококкам группы B. Этот вектор получали путем модификации обычно используемого плазмидного вектора клонирования, puC12 (Messing J. и др., Gene 19: 269-276 (1982); Norrander J. и др., Gene 26:101-106 1983; Vieira J. и др., Gene 19:259-268 (1982)); все указанные работы вводятся в настоящее описание в виде ссылки). Изобретение относится к описанному ниже вектору и его функциональным эквивалентам.

Используя эту систему, можно легко обрабатывать плазмидные клоны, картировать с помощью рестрикционных эндонуклеаз, и исследовать последовательности ДНК-вставок, полученные зонды и генные продукты, не прибегая к обязательному субклонированию. puC12 представляет собой плазмиду в 2,73 кв с высоким числом копий, несущую ColEI-начало репликации, резистентность к ампициллину и полилинкер в IacZ-гене (Ausub el F.M. и др., Current Topics in Molecular BioIOOy; Greene PubI. Assn./ Wiley Interscience, NY, (1987)); эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки).

Некоторые модификации были осуществлены в полилинкере puC12 (Aruffo A., и др., Proc. NatI. Acad. Sci. США 84:8573-8577 (1987), эта работа вводится в настоящее описание посредством ссылки). В целом схема изменения puC12 сводится к модификации полилинкера для получения идентичных, но не "липких" BstXI-сайтов для клонирования; к добавлению "stuffer" - фрагмента для легкого отделения линейной хозяйской плазмиды, и к обеспечению экспрессии от Iac-промтора во всех трех трансляционных рамках считывания.

Для получения сайта для инсерции чужеродной ДНК с высокой степенью эффективности и минимизации возможности самолигирования плазмиды к полилинкеру добавляют BstXI с инвертированными не "липкими" концами. Как показано на фиг. 1, puC12 сначала разрезают BamHI (Стадия 1) и плазмиду с двумя синтетическими олигонуклеотидными адапторами, которые являются частично комплементарными: с 15-мером (GATCCATTGTGCTGG) и 11-мером (GTAACACGACC) (Стадия 2). При лигировании этих адапторов в puX12, образуются два новых BstXI-сайта, но при этом также сохраняются первоначальные BamHI - сайты (Стадия 3). Затем плазмиду обрабатывают полинуклеотид-киназой и лигируют с образованием замкнутой кольцевой плазмиды (Стадия 4). При обработке этой плазмиды BstXI полученные концы были идентичными и не "липкими" (обе имеют GTGT-выступа) (Стадия 5).

Вторую модификацию в полилинкере осуществляли для очистки плазмиды в целях клонирования без загрязнения из частично разрезанной плазмиды, способной к самолигированию. Fnu 2 фрагмент в 365 п. о. и с тупым концом получали из плазмиды pCbM. Эта кассета или фрагмент - "stuffer", который не содержал BstXI-сайт, был лигирован тупым концом к двум синтетическим олигонуклеотидам, которые являются частично комплементарными: 12-мер (ACACGAGATTTC) и 8-мер (CTCTAAAG) (Стадия 6). Полученный фрагмент с адапторами имел "выступы" в 4 п. о. (ACAC), которые являются комплементарными концами модифицированной плазмиды puC12, показанной в Стадии 5. Модифицированную плазмиду рuC12 лигировали к pCDM-вставке с адапторами, и полученную конструкцию обозначали puX12 (фиг. 4). Плазмида puX12 может быть снова получена из плазмид pJMS1 или pJMS23 путем вырезания введенных ДНК-последовательностей Streptococcus. Альтернативно она может быть образована с помощью рекомбинантной техники (или путем гомологичной рекомбинации) с использованием плазмиды puC12.

Поскольку puX12 используется в качестве экспрессирующего вектора, то последующую модификацию полилинкера предпочтительно осуществлять таким образом, чтобы он содержал все три возможные рамки считывания для Iac-промотора. Эти модификации осуществляют с учетом правильной трансляционной рамки считывания для фрагментов клонированного гена с частотой повторяемости один к шести. Например, клонированный фрагмент может быть введен в вектор в одной из двух ориентаций и в одной из трех рамок считывания. Для конструирования рамки считывания +1 плазмиду puX12 разрезали рестриктазой EcoRI в уникальном сайте полилинкера. Однонитевые липкие 5' - концы затупляли, используя 5' - 3'- полимеразную активность ДНК-полимеразы T4, т два тупых конца лигировали. В результате этих манипуляций теряли EcoRI-сайт и создавали новый XmnI-сайт (фиг. 5). Эту конструкцию подтверждали путем проверки на отсутствие EcoRI-сайта и присутствие нового XmnI-сайта в полилинкере. Помимо этого, осуществляли секвенирование двухнитевой ДНК на +1-модифицированной плазмиде рuX12 с использованием стандартных праймеров секвенирования (Ausu b el P. M., и д. р. , Current Topic in Molecu lar Biology; Greene Publ. Assh/Wiley Interscience, NY (1987)). Секвенирование ДНК-последовательности показало добавление 4 п. о. к полилинкеру и подтвердило модификацию puX12 в +1 рамку считывания. Эту плазмиду обозначали puX12+1.

Для конструирования рамки считывания -1 вектор puX12 разрезали рестриктирующим ферментом Sac1 в уникальном сайте полилинкера puX12. Однонитевые липкие 3'-концы обрезали для получения тупых концов с использованием эндонуклеазной активности 3'- 5' полимеразы T4 и полученные тупые концы лигировали. В полученной последовательности