Днк, кодирующая фитазу aspergillus niger, рекомбинантная плазмидная днк для экспрессии фитазы (варианты), штаммы- продуценты фитазы (варианты), способ получения фитазы и рекомбинантная фитаза aspergillus niger

Днк, кодирующая фитазу aspergillus niger, рекомбинантная плазмидная днк для экспрессии фитазы (варианты), штаммы- продуценты фитазы (варианты), способ получения фитазы и рекомбинантная фитаза aspergillus niger

Реферат

 

Изобретение может быть использовано в микробиологическом производстве фитазы. Разработан экономически рентабельный способ производства фитазы. Получен фрагмент геномной ДНК и к ДНК, кодирующих фитазу Aspergillus niger и имеющих определенные аминокислотные последовательности. Рекомбинантная плазмидная ДНК p FYT3 для эспрессии фитазы в Aspergillus имеет размер 15,3 т.п. о. и состоит из вектора РТZ 18 и фрагмента ДНК, оперативно связанного с промотором глюкоамилазы Aspergillus niger, содержит ген amds Aspergillus nidulans в качестве селективного маркера. Рекомбинантная плазмидная дНК pAF - 2 - 2 S для экспрессии фитазы в Aspergillus имеет размер 13,4 т.п.о., состоит из вектора pUC 19 и pVU II фрагмента, размером 6,1 т.п.о. Последний содержит ДНК фрагмент. Плазмида включает ген amds Aspergillus nidulons в качестве селективного маркера. Штамм Aspergillus niger CBS 513.88 трансформирован рекомбинантной плазмидой pFYT3 или pAF 2 - 2S. Штамм Aspergillus ficuum NRRL 3135 трансформирован рекомбинатной плазмидой pFYT3. Штаммы являются продуцентами фитазы Aspergillus. Фитазу получают культивированием клеток-продуцентов фитазы Aspergillus niger или Aspergillus ficuum. Рекомбинантную фитазу Aspergillus niger получают в клетках Aspergillus ficuum NRRL 3135 или Aspergillus niger СВ 513.88 кодированием фрагментом ДНК. Фитаза имеет N - концевую последовательность Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Gly Asp Thr Val Asp, удельную активность 100 ед/мг, оптимум pH 5,5, тампературу 50^oC, молекулярную массу 85 кД. 9 с.п. ф-лы, 36 ил., 8 табл.

Изобретение относится к микробиологическому производству фитазы.

Незаменимым элементом для роста любого организма является фосфор. В животноводстве для обеспечения быстрого роста животных с простым желудком (например, свиней, рыбы, домашней птицы) корма обогащают неорганическим фосфором.

Напротив, в корма жвачных животных неорганический фосфор не добавляют, так как присутствующие в рубце микроорганизмы вырабатывают ферменты, которые катализируют превращение фитата (миоиноизитолгексакис-фосфата) в инозитол и неорганический фосфат.

Фитат представляет собой резервный источник фосфора практически во всех пищевых материалах растительного происхождения (см. обзор: фитовая кислота, химия и практическое использование (Phytie acid, chemistry and applications, E. Graf (ed.), Pilatus Press, Minneapolis, MN, USA, 1986).

Содержание фитата в орехах, зерновых, бобовых и масличных культурах, спорах и пыльце составляет 1 - 3%. Сложные соли фитовой кислоты называются фитинами. Считают, что фитовая кислота ухудшает пищеварение, поскольку она служит хелатом таких минеральных элементов, как кальций, цинк, железо и магний, и, кроме того, может вступать в реакцию с белками, уменьшая, таким образом, биологическую доступность последних и важных минеральных компонентов корма.

Содержащийся в фитате фосфор проходит через желудочно-кишечный тракт животных с однокамерным желудком и выводится с экскрементами. Хотя в толстом кишечнике и происходит частичный гидролиз фитата, освобождаемый при этом неорганический фосфор не имеет существенной питательной ценности, поскольку он может всасываться только в тонком кишечнике. В результате такие животные не используют большое количество фосфора, имеющего значительную питательную ценность, несмотря на его присутствие в корме.

Экскреция содержащегося в фитате фосфора с экскрементами также имеет известные последствия. На протяжении последних десятилетий значительно возросло поголовье сельскохозяйственных животных. Одновременно увеличилось и количество навоза, что создает угрозу чистоте окружающей среды в различных районах земного шара. Частично это обусловлено накоплением содержащегося в навозе фосфата в поверхностных водах, что в свою очередь, приводит к эутрофикации водоемов.

Ферменты, синтезируемые микроорганизмами и катализирующие превращение фитата в инозитол и неорганический фосфор, широко известны под названием фитаз. В число микроорганизмов, продуцирующих эти ферменты, входят такие бактерии, как Bacillus subtilis (V.K.Paver and V.J.Jagannathan, 1982, J. Bacteriol. , 151. 1102-1108) и Pseudomonas (D.J.Cosgrove, 1970, Austral. J. Biol. Sci., 23, 1207-1220),такие виды дрожжей, как Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayini and P. Markakis, 1984, Lebensmittel Wissenschft und Technologie, 17, 24-26) и такие виды грибов, как Aspergillus Terreus (K. Yamada Y. Minoda and S. Yamamoto, 1986, Aprie. Biol. Chem. 32, 1275-1282). Фитазу продуцируют и другие виды Aspergillus, среди которых Aspergillus ficuum синтезируют фермент с наиболее высокой специфической активностью и более выраженной термостабильностью по сравнению с фитазами других микроорганизмов (неопубликованные данные).

Идея добавлять бактериальную фитазу в корма животных с простым желудком высказывалась уже неоднократно (см., например, Ware J.H., Bluff L. and Shien T. R. , 1967, US Patent N 3.297.548; Nelson T.S., Shien T.R, Wodzinski R.J. and Ware J.H., 1971, J. Nutrition, 101, 1289-1294).

Однако до настоящего времени ее практическое применение представлялось экономически нерентабельным из-за высокой стоимости микробиологического производства ферментов (Y. W. Han, 1989, Animal Feed Sci & Technol., 24, 345-350). Таким образом, по причинам экономического порядка неорганический фосфор продолжают вводить в корма животных с однокамерным желудком.

Бактериальные фитазы находят и другое применение в хозяйственной деятельности. В качестве примера можно упомянуть процесс промышленного получения крахмала из зерна таких культур, как кукуруза и пшеница. Образующиеся в процессе сырого перемалывания продукты, в частности глютены, поступают на рынок в качестве кормов для сельскохозяйственных животных. В ходе вымачивания добавляют фитазу, причем технологические условия особенно благоприятны для грибных фитаз (температура порядка 50^oC при pH 5,5) (см., например, заявку на Европейский патент 0321004 Alko Ltd). Важным преимуществом описанного процесса является возможность получения из отходов производства животных кормов, содержащих фосфат вместо фитата.

Предложено также использовать фитазы при переработке сои (см.Finas TM Enzymes by Alko - информационный буклет, выпущенный компанией Alko Ltd., Rajamaki, Финляндия). Соевые бобы содержат большое количество фитата - фактора, ухудшающего пищеварение, который делает белки непригодными для использования в продуктах детского питания, а также в кормах рыб, телят и нежвачных животных. Обогащение этого важного источника белков соответствующими ферментами повышает коммерческую и пищевую ценность этого материала.

Проведены исследования с целью более подробной характеристики различных фитаз и совершенствования способов их получения и практического использования. Ullah предложил метод очистки фитазы из дикого штамма Aspergillus ficuum, а также изучил ряд биохимических параметров конечного продукта такой очистки (Ullah A., 1988a, Preparative Biochem, 18, 443-438). Полученные этим автором данные приводятся в табл.1.

Аминокислотная последовательность N - концевого фрагмента фитазы A.ficuum была представлена Ullah дважды: Ullah A., 1987, Enzyme and Engineering Conference IX, October 4-8, 1987, Santa Barbara, California (poster presentation) и Ullah A., 1988b, Prep. Biochem., 18, 459-471.

Последовательность аминокислотных остатков, расшифрованная этим автором, показана на фиг.1 (последовательность E).

Из полученных Ullah данных следуют несколько интересных выводов. Прежде всего, "очищенный" препарат, описанный им в 1988a и 1988в, при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия давал две белковые полосы. Нами установлено, что очищенная из A.ficuum фитаза содержит посторонний материал, который и дает при электрофорезе в полиакриламидном геле одну из полос, которую Ullah идентифицировал как фитазу.

Аналогичное заключение можно сделать на основании анализа аминокислотных последовательностей, опубликованных Ullah (1987, 1988b; сравните последовательности A и B с последовательностью С на фиг.1). Мы показали, что одна из аминокислотных последовательностей внутренних пептидов фитазы, описанных Ullah (см.рисунок 1B, последовательность E), на самом деле представляет собой посторонний белок с молекулярной массой 100 кДа (фиг.3), который присутствует в материале, получаемом по методу Ullah, и дает одну из двух полос при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (Ullah, 1968a, 1968b). Ullah не признает наличия такого загрязняющего материала и считает, что указанная полоса представляет собой другую форму фитазы. Между тем этот посторонний компонент затрудняет отбор и идентификацию именно той нуклеотидной последовательности, которая кодирует биосинтез фитазы. Кроме того, его присутствие снижает удельную активность тестируемого белка.

Продолжая анализ данных Ullah, следует отметить, что аминокислотный остаток в положении 12 был идентифицирован этим автором как глицин. Используя методику секвенирования белков и ДНК, мы показали, что в этом положении на самом деле присутствует не глицин, а цистеин (см. фиг.11-17 и 19-20).

Наконец, по мнению Ullah, фитаза представляет собой белок с молекулярной массой 85 кДа, которая после гликозилирования уменьшается до 61,7 кДа (Ullah, 1988 b). Эта величина значительно ниже ранее приводившейся тем же автором - 76 кДа (Ullah A. and Gibson D., 1988, Prep. Biochem. 17 (1), 63 - 9 1) и была рассчитана на основании относительного количества углеводов, выделяющихся при гидролизе, и молекулярной массы нативного белка, которую определяли посредством электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия. Однако наши исследования показали, что гликозилированная фитаза однозначно имеет молекулярную массу 85 кДа, тогда как у дегликозилированного белка она колеблется в диапазоне от 48 до 56,5 кДа, в зависимости от степени дегликозилирования.

В сообщении Mullaney et al. (Filamentous Fungi Conference, April 1987, Pacific Grove, California (poster presentation) также приводится характеристика фитазы из A.ficuum. И в этом исследовании при электрофорезе в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия были получены две белковые полосы, одна с молекулярной массой 85 кДа, а другая с массой 100 кДа - обе с "очищенным" белковым материалом. Авторы идентифицировали обе полосы в качестве различных форм фитазы. Однако, в сообщении не описывается способ трансформации бактериальных клеток - хозяев. Описание методов клонирования и выделения последовательности ДНК, кодирующей фитазу, также отсутствует.

Очевидно, что разработка экономически рентабельного способа производства фитазы имела бы большое значение, в частности, при промышленном получении кормов для животноводства. Одним из путей достижения этой цели является использование рекомбинантной ДНК - методики, с помощью которой можно усилить экспрессию фермента в различных видах микроорганизмов, продуцирующих высоко активные пептиды и белки. Однако в настоящее время неизвестны способы выделения и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих биосинтез фитазы.

Изобретение относится к способу получения и очистки последовательности ДНК, кодирующей фитазу. Выделение и клонирование такой последовательности осуществлялось с помощью специфических нуклеотидных зондов, которые были разработаны специально для целей настоящего изобретения. Требуемая последовательность ДНК, кодирующая фитазу, была получена из грибов, в частности из нитчатых грибов рода Aspergillus.

Другим предметом изобретения является способ получения вектора, содержащего фактор экспрессии, который в свою очередь включает по меньшей мере одну реплику по крайней мере одной (желательно гомологичной) ДНК, кодирующей фитазу. Такая последовательность ДНК функционально связана с соответствующей регуляторной областью, обеспечивающей высокий уровень экспрессии пептидов или белков с фитазной активностью в подходящих для этой цели клетках - хозяевах.

Фактор экспрессии согласно настоящему изобретению может быть введен в вектор, предпочтительно плазмиду, способный трансформировать бактериальные клетки - хозяева и внедряться в геном.

Еще один предмет настоящего изобретения - способ получения трансформированной клетки, желательно бактериальной, которая претерпевает изменения под воздействием вектора, описанного в предшествующем параграфе. Согласно изобретению такими трансформированными клетками могут служить нитчатые грибы родов Aspergillus, Trichoderma, Mucor и Penicillium дрожжи родов Kluyveromyces и Saccaromyces или бактерии рода Bacillus. Наиболее предпочтительно использование в качестве клеток - хозяев нитчатых грибов рода Aspergillus. Трансформированные клетки способны синтезировать большие количества рекомбинантной фитазы в промышленном масштабе и при достаточном уровне экономической рентабельности.

Другие аспекты изобретения относятся к рекомбинантным белкам и пептидам, которые обладают фитазной активностью как в гликозилированной, так и в негликозилированной форме; к способу получения таких негликозилированных белков и пептидов; к белкам и пептидам с фитазной активностью, свободным от посторонних примесей; к моноклональным антителам, реагирующим с этими рекомбинантными или очищенными белками.

В табл. 1 приведены сравнительные биохимические характеристики фитазы, полученной Ullah из дикого штамма A.ficuum, и дополнительно очищенной фитазы из A.ficuum дикого типа, полученной согласно настоящему изобретению. Следует обратить особое внимание на данные об удельной активности, которые свидетельствуют о том, что у полученного нами фермента она в два раза выше, чем у фитазы, описанной Ullah.

Настоящее изобретение относится также к нуклеотидной последовательности, кодирующей белки с фитазной активностью, а также к аминокислотным последовательностям таких белков. Полученные последовательности можно использовать для разработки олигонуклеотидных зондов, которые в свою очередь применяются в гибридизационных скрининговых исследованиях с целью идентификации генов фитазы из других источников, особенно из различных видов микроорганизмов, которые в последующем могут быть выделены и клонированы.

Последовательности, получаемые согласно настоящему изобретению, можно использовать в качестве исходных материалов для конструирования фитаз "второго поколения". Фитазы "второго поколения" - это фитазы, измененные под воздействием мутагенных факторов (в частности, методом направленного мутагенеза) и обладающие свойствами, которые отличаются от свойств фитаз дикого типа или рекомбинантных фитаз, например, получаемых согласно настоящему изобретению. Для оптимизации того или иного процесса изменяют такие его параметры, как температура и оптимальная величина pH, удельная активность белков или сродство субстратов.

Применительно к данному изобретению понятие фитаза охватывает семейство ферментов, которые катализируют реакции, направленные на удаление неорганического фосфора из разнообразных миоинозитолфосфатов.

Для определения активности фитазы существует много способов, выбор которых не лимитируется настоящим изобретением. В порядке иллюстрации можно отметить способ количественного определения активности фермента по его расходу на освобождение неорганического фосфора из 1,5 мМ фитата натрия со скоростью 1 мкмоль/мин при 37^oC и pH 5,50.

Следует также иметь в виду, что термин "фитаза", употребляемый в тексте настоящей спецификации, относится ко всем белкам и пептидам, обладающим фитазной активностью. Это положение иллюстрируется фиг.1, на котором сопоставляются последовательности A и B (последовательности, полученные в ходе настоящего исследования) с последовательностью C, полученной Ullah (1988в). Фиг.1 показывает, что с помощью нашего метода можно получить белки, в которых отсутствуют первые 4 аминокислотные остатка нативной фитазы A.ficuum (белок с последовательностью А не имеет первых 7 аминокислотных остатков). Указанные белки сохраняют тем не менее фитазную активность. Полная аминокислотная последовательность белка фитазы, полученная на основании результатов анализа соответствующей нуклеотидной последовательности, показана на фиг.19-20.

Фитазы, получаемые по предлагаемому способу, могут использоваться в самых разнообразных процессах, требующих превращения фитата в инозитол и неорганический фосфор.

В частности, получение фитазы согласно настоящему изобретению позволяет снизить стоимость ее промышленного микробиологического производства и обеспечить экономическую рентабельность последнего при изготовлении кормов для животных, а в конечном счете добиться такого же соотношения затрат и эффективности использования кормов, как в случае применения добавок неорганического фосфата. Кроме того, значительно снизится содержание фосфора в навозе.

Получение фитаз по ценам, сопоставимым с ценами неорганического фосфата, расширит возможности промышленности кормоматериалов в смысле увеличения ассортимента высококачественных кормов. Например, обогащение кормов фитазой позволяет отказаться от добавок неорганического фосфата и повысить в них долю фитатсодержащего материала.

Помимо использования получаемой согласно настоящему изобретению фитазы в качестве добавки к кормам животных и при переработке сои (см. выше), она может найти применение в следующих отраслях промышленности: - производство жидких кормов для свиней и домашней птицы. В настоящее время широкое распространение получила практика замачивания кормов за несколько часов до скармливания животным. На протяжении этого периода фитаза превращает фитат в инозитол и неорганический фосфат; - промышленное производство инозитола или инозитолфосфатов из фитата; - другие промышленные процессы с использованием фитатсодержащих субстратов, такие как производство крахмала и ферментация, включая пивоварение. Хелирование металлических ионов фитатом может сделать их недоступными для микроорганизмов. Ферментативный гидролиз фитата устраняет эту проблему.

Эти и другие предметы и преимущества настоящего изобретения еще более очевидны из следующего ниже подробного его описания.

На фиг. 1 представлена N-концевая аминокислотная последовательность очищенной фитазы. Аминокислотные последовательности, обозначенные буквами A и B, получены в ходе настоящего исследования с использованием подформ фитазы с изоэлектрическими точками соответственно 5,2 и 5,4. Последовательность C приводится по публикациям Ullah (1987, 1938в, supra). Согласно нашим данным аминокислотный остаток в положении 12 последовательностей A и B не является глицином (знак * означает сомнительную идентификацию, а знак ** отсутствие определяемого остатка); на фиг.2 представлена N-концевая последовательность внутренних фрагментов фитазы после расщепления CNBr. Аминокислотные последовательности, обозначенные буквами A и B, с приблизительными молекулярными массами соответственно 2,5 и 36 кДа получены в ходе настоящего исследования. Последовательности C и E даны по Ullah (1988 b, supra); на фиг.3 - N-концевая аминокислотная последовательность белка с молекулярной массой 100 кДа, который по данным настоящего исследования присутствует в неочищенных препаратах фитазы; на фиг. 4,5 - олигонуклеотидные зонды, сконструированные на основании данных фиг.1 (пептиды A - E); на фиг.6,7 - олигонуклеотидные зонды, сконструированные на основании данных фиг.2 (пептиды A и B); на фиг.8 - олигонуклеотидные зоны, использовавшиеся для выделения гена, кодирующего кислую фосфатазу; на фиг. 9 - рестрикционная карта бактериофага лямбда AF 201, содержащего локус фитазы A.ficuum. Стрелка показывает положение гена фитазы и направление транскрипции. Клон # указывает субклоны, полученные с помощью указанных рестрикционных ферментов из фага AF201 в pAN 8-1 (для pAF 28-1) и в pUC 19 (для всех других субклонов); на фиг.10 - физическая карта pAF 1-1. Фрагмент Bam HI длиной в 10 килооснований, внедренный в pUC19, содержит полный ген, кодирующий кислую фосфатазу A.ficuum; на фиг.11-17 представлены нуклеотидные последовательности плазмид pAF 2-3, pAF 2-6 и pAF 2-7, включающие хромосомные генные локусы фитазы. Кодирующая фитазу область локализуется между нуклеотидами в положениях 210 и 1713. Интрон размещается в хромосомном гене между нуклеотидами 254 и 355. Показаны также другие существенные признаки: начальный и конечный кодоны фитазы, рестрикционные участки и положение интрона; на фиг. 18 представлена подробная физическая карта секвенированного хромосомного локуса фитазы. Стрелки показывают локализацию двух экзонов области, кодирующей фитазу; на фиг.19,20 - нуклеотидная последовательность трансляционной зоны фрагмента кДНК фитазы и выведенная из нее последовательность аминокислотных остатков в молекуле фитазы. Начало зрелой молекулы белка обозначено как положение +1. N-конец внутреннего белка с молекулярной массой 36 кДа находится в положении 241, тогда как белок с молекулярной массой 2,5 кДа начинается в положении 390; на фиг.21 - физическая карта блока экспрессии фитазы pAF 2-2S. Стрелки указывают направление транскрипции генов; на фиг.22,23 - доказательство сверхэкспрессии фитазы в трансформированных клетках A.ficuum NRRL 3135 методами изоэлектрофокусировки и электрофореза в полиакриламидном геле. Равные объемы культуральной жидкости A. ficuum (полоса ) и трансформированных клеток pAF 2-2S SP7 (полоса 2), выращивавшихся в одинаковых условиях, анализировали в системе Phast (Framacia) методами электроизофокусировки и электрофореза в полиакриламидном геле при pH от 4,5 до 6.0. Для сравнения анализировали образец фитазы a.ficuum, очищенной до гомогенного состояния, либо отдельно (полоса 4), либо в смеси с культуральной жидкостью (полоса 3). Гели окрашивали или на фосфатазу, как описано в тексте (A), или на общий белок (кумасси бриллиантовый синий, B). Полосы, соответствующие фитазе, обозначены звездочками; на фиг. 24,25 представлено доказательство сверхэкспрессии фитазы в трансформированных клетках A.niger CBS 513.88 методами изоэлектрофокусировки и электрофореза в полиакриламидном геле. Равные объемы культуральной жидкости родительского штамма A.niger (полоса 1) или трансформированных клеток pAF - 2-2S # 8 (полоса 2) pFYT3 # 205 (полоса 3) и # 282 (полоса 4) анализировали методами изоэлектрофокусировки и электрофореза в полиакриламидном геле, как описано в подписи к фиг.22,23. Гели окрашивали либо на общую фосфатазную активность (A), либо на общий белок (B). Полосы, соответствующие фитазе, обозначены звездочками; на фиг. 26 представлена физическая карта pAB 6-1. Вставка ДНК Hind III длиной 14,5 килооснований в pUC19 содержит полный локус глюкоамилазы из A.niger (AG); на фиг.27 дано схематическое изображение полимеразной цепной реакции для слияния промотора AG и гена фитазы. Последовательности всех олигонуклеотидных затравок приведены в тексте; на фиг.28 представлена физическая карта блока экспрессии фитазы PAF 2-2S H; на фиг.29-31 - физическая карта промежуточных блоков экспрессии фитазы pXXFYT1 и PXXFYT2 и блока pXXFYT3, в которых XX - лидирующая последовательность (L). В p18FYT# и p 24FYT# включены соответственно лидирующие последовательности AG 18 aa и 24 aa, тогда как в pFYT# в качестве лидера использована фитаза; на фиг.32 - физическая карта плазмиды pFYT3 Qmds; на фиг.33 - физическая карта плазмиды pFYT3INT; на фиг.34 - физическая карта замещающего вектора pREPFYT3 фитазы /AG; на фиг.35,36 - ауторадиограммы хромосомной ДНК, после переваривания pVU II (A) и Bam HI (B) и гибридизации с меченной ³²P кДНК фитазы A.ficuum, в качестве зонда следующих микроорганизмов: S.cerevisiae (полоса 2), B.subtilis (полоса 3), K.lactis (полоса 4), P.crysogenus (полоса 5), P.aeruginosa (полоса 6), S.lividans (полоса 7), A.niger, 1 мкг (полоса 8), A.niger, 5 мкг (полоса 9), контроль (полоса 10), C.thermocellum (полоса 11). Полоса 1 - маркерная ДНК.

Клонирование генов, кодирующих определенные белки, которые продуцируются тем или иным микроорганизмом, может осуществляться различными способами. Один из них состоит в очистке требуемого белка, последующего определения его N-концевой аминокислотной последовательности и скрининга геномной библиотеки данного микроорганизма с использованием олигонуклеотидного зонда ДНК, полученного исходя из расшифрованной аминокислотной последовательности N-концевого фрагмента. В качестве примера успешного применения этой методики можно указать клонирование гена изопенициллин-N-синтетазы Cephalosporium acremonium (S.M.Samson et al., 1985, Nature, 318, 191-194) и выделение гена, кодирующего ТАКА амилазу Aspergillus oryzae (Boel et al., 1986, европейская патентная заявка 0238023).

Используя этот подход, мы попытались изолировать ген, кодирующий фитазу из Aspergillus ficuum. Белок тщательно очищали и определяли ряд его биохимических параметров. Полученные данные сравнивали с результатами исследования Ullah (1968a). Материалы обоих исследований представлены в табл.1.

Для выделения кодирующего фитазу гена сначала получали набор олигонуклеотидных зондов, конструировавшихся, как описано выше (фиг.4,5), на основании данных расшифровки аминокислотной последовательности. В качестве контроля всего процесса, аналогичным образом выделяли ген, кодирующий кислую фосфатазу, используя для этой цели характеристики белка, полученные Ullah и Cummins (Prep. Biochem., 17, 397-422, 1987). Выделение гена кислой фосфатазы не представляло существенных трудностей. Совсем иной была ситуация с выделением гена фитазы. Несмотря на многочисленные попытки с использованием зондов, полученных исходя из последовательности N-концевых аминокислотных остатков, не удалось выделить геномные фрагменты ДНК или клоны геномной библиотеки, в которых можно было бы однозначно показать присутствие гена, кодирующего фитазу.

Для решения этой задачи очищенную фитазу расщепляли CNBr и выделяли образовавшиеся белковые фрагменты, определяя их N-концевые аминокислотные последовательности (фиг.2).

Используя полученные данные, конструировали новые олигонуклеотидные зонды (фиг.6,7). Эти олигонуклеотидные зонды оказались способными идентифицировать специфические фрагменты ДНК и пригодными для выявления требуемых клонов геномной библиотеки. Перекрестная гибридизация между полученными таким образом новыми клонами или фрагментами ДНК и первым набором олигонуклеотидных зондов или клонами, выделенными с использованием первого набора зондов, отсутствовала.

В связи с этим второй набор зондов также можно использовать при идентификации кодирующих последовательностей для соответствующих фитаз.

Вновь выделенные клоны были использованы для гибридизации (Northern blot hybridization). Дискретные мРНК удавалось определять только в тех случаях, когда их выделяли из мицелия, вырабатывающего фитазу. Гибридизационный сигнал отсутствовал, если мРНК получали из мицелия, в котором отсутствовала продукция фитазы. мРНК имела в длину примерно 1800 оснований и теоретически давала белок с максимальным молекулярным весом около 60 кДа. Эта величина соответствует молекулярной массе негликозилированного белка и молекулярной массе белка, рассчитанной на основании данных о нуклеотидной последовательности ДНК.

Более того, после внедрения такой мРНК в грибную клетку посредством трансформации наблюдали увеличение фитазной активности. Это неопровержимо свидетельствует о том, что была получена нуклеотидная последовательность, кодирующая фитазу. Последовательность аминокислотных остатков в очищенной фитазе и в белковых фрагментах, полученных после переваривания CNBr, была такой же, как аминокислотная последовательность, рассчитанная на основании нуклеотидной последовательности клонированного гена. Нуклеотидная последовательность и выведенная из нее последовательность аминокислотных остатков представлены на фиг.11-17, 19, 20, которые служат дополнительной иллюстрацией структуры клонированного гена, кодирующего фитазу.

Выделение нуклеотидной последовательности, кодирующей фитазу, является предпосылкой получения последней в промышленных масштабах на основании современной технологии рекомбинантных ДНК, включающей такие операции, как амплификация гена, замена регуляторных элементов (промоторов, сигналов секреции) или комбинация различных методов.

В связи с этим предметом настоящего изобретения являются также трансформированные клетки - хозяева, в которых происходит эффективная экспрессия пептидов и белков, обладающих фитазной активностью, при высоких концентрациях этих соединений, а также (в случае необходимости) - эффективная экспрессия кислых фосфатаз. Такими клетками могут служить нитчатые грибы родов Mucor, Aspergillus, Trichoderma и Penicillium, дрожжи родов Kluyveromyces и Saccharomyces и бактерии, принадлежащие к роду Bacillus. Рекомендуется в качестве организмов - хозяев отбирать формы, способные к интенсивной секреции собственных эндогенных белков.

Особый интерес представляют промышленные штаммы Aspergillus, в частности, A. niger, A. ficuum, A.awamori, A.oryzae. В качестве альтернативы, могут использоваться Trichoderma reesei, Mucor, miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis.

Трансформированные клетки содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют требуемый белковый продукт, и обычно включают сигнальную последовательность секреции, способную функционировать в данном хозяине и необходимую для освобождения синтезируемого пептидного или белкового продукта.

Настоящее изобретение допускает применение различных сигнальных последовательностей. Прежде всего, можно использовать сигнальные последовательности, гомологичные клонированной нуклеотидной последовательности, которая подлежит экспрессии. С другой стороны, для оптимизации гомологичной рекомбинации можно использовать сигнальную последовательность, которая гомологична или в значительной степени гомологична сигнальной последовательности в соответствующем локусе гена клетки-хозяина. Кроме того, допускается применение сигнальной последовательности, сконструированной специально, с целью улучшения секреции требуемого продукта, продуцируемого данным организмом, например, описанной в работах Von Heyne (1983), Eur. J.Biochem., 133, 17-21, Perlman & Halverson (1983) J.Med.Biochem., 167. Последовательность ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, может присоединяться непосредственно к последовательности, кодирующей требуемый белок, через последовательность, кодирующую сигнал процессинга (участок узнавания места расщепления), либо через короткий мостик, длиной обычно не более десятка кодонов.

Согласно настоящему изобретению предпочтительно использовать сигнальные последовательности, гомологичные клонированной нуклеотидной последовательности, подлежащей экспрессии, сигнальную последовательности в форме 18-членной глюкоамилазы (AG) или глюкоамилазы (AG) из 24 аминокислотных остатков. Две последние последовательности могут быть либо гомологичны, либо гетерологичны подлежащей экспрессии нуклеотидной последовательности.

Продуктом экспрессии или требуемой нуклеотидной последовательностью могут служить ДНК, гомологичные или гетерологичные для данного организма-хозяина.

Для целей настоящего изобретения под термином "гомологичная" ДНК понимается ДНК из клеток, относящихся к тому же биологическому роду, что и организм-хозяин. Например, клетки грибов Aspergillus трансформируются ДНК из грибов рода Aspergillus. Такой подход позволяет улучшить свойства клеток гриба данного рода, избежав придания им тех свойств, которые не свойственны данному организму в отсутствие трансформации.

"Гетерологичная" ДНК - это ДНК, полученная из клеток более чем одного рода микроорганизмов (как следует из примера, приведенного в предыдущем параграфе, гетерологичной ДНК может служить ДНК из иных, нежели Aspergillus, микроорганизмов, которую используют для экспрессии в клетках Aspergillus).

Нуклеотидные последовательности, кодирующие белки с фитазной активностью, желательно получать из грибов. Наиболее предпочтительны кодирующие фитазу нуклеотидные последовательности из грибов Asperhillus ficuum или Aspergillus niger.

Область 5' открытой считываемой последовательности требуемой нуклеотидной последовательности должна включать регуляторную зону инициирования транскрипции (или промотор). Можно использовать любую функционально активную область нуклеотидной последовательности клетки-хозяина, в том числе промотор, гомологичный кодирующей фитазную активность нуклеотидной последовательности, которая подлежит экспрессии. Однако в большинстве случаев используют область, гомологичную области локуса-мишени. Это позволяет заменить продукт экспрессии локуса-мишени требуемым продуктом. В этом случае регуляторная зона инициирования транскрипции обычно удовлетворяет предъявляемым требованиям в том смысле, что достигаемый уровень экспрессии и секреции белка, кодируемого локусом-мишенью, обеспечивает достаточно эффективную продукцию последнего. Тем не менее, в отдельных случаях может требоваться более высокий уровень транскрипции, нежели тот, что обеспечивается локусом-мишенью, либо возникает необходимость получать продукт экспрессии, используя специфический индуцирующий фактор. В таких случаях используют регуляторную зону инициирования транскрипции, которая отличается от зоны, присутствующей в локусе-мишени данного гена. Известно большое число функционально активных регуляторных зон инициирования транскрипции из различных видов нитчатых грибов. К их числу относятся зоны, кодирующие гликоамилазу (AG), грибную амилазу, кислую фосфатазу, GAPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AbdA, гистон H2A, Pyr G, Pyr4, изопенициллин-N-синтетазу, ФГК, кислую протеазу, ацилтрансферазу и т.д..

Желательно, чтобы локус-мишень кодировал ген белка с высоким уровнем экспрессии, т.е. ген, продукт экспрессии которого синтезируется в концентрации не менее 0,1 г/л (в конце процесса ферментации). Продолжительность такого процесса, помимо прочих факторов, может зависеть от характера требуемого белка. В качестве примера такого гена можно указать на ген, кодирующий гликоамилазу (AG). Среди других представляющих интерес генов: гены грибной альфа-амилазы, кислой фосфатазы, протеазы, кислой протеазы, липазы, фитазы и целлобиодеградазы. Особенно ценны локусы гена гликоамилазы A.niger, гена амилазы A.oryzae, гена целлобиогидролазы T.reesei, гена кислой протеазы Mucor michei, гена лактазы Kluyveromyces lactis и гена инвертазы Saccharomyces cerevisiae.

Регуляторная зона окончания транскрипции может быть получена из используемого гена, локуса-мишени или любой другой подходящей последовательности. При наличии в клетке других последовательностей, расположенных ниже используемого гена (по направлению транскрипции), зона окончания транскрипции, в случае ее гомологичности локусу-мишени, должна быть значительно короче, чем гомологичная фланкирующая область.

Обычно используют маркер селективности, являющийся частью трансформированного генома, подлежащего экспрессии, или отделенный от трансформированного участка, в результате чего он может быть внедрен за пределами используемого гена. Поскольку рекомбинантные молекулы согласно настоящему изобретению трансформируются преимущественно в клетки промышленных штаммов микроорганизмов, маркеры селективности для контроля трансформации должны быть по преимуществу доминантными маркерами. Иными словами, их введение в клетки-хозяева не должно сопровождаться мутациями. Примером таких маркеров, обеспечивающих рост трансформированных клеток на контролируемой питательной среде, может служить ген A. amdnudulansS, который поддерживает рост трансформированных клеток A.niger на ацетамиде в качестве единственного источника питания, а примером маркеров, обеспечивающих резистентность к антибиотикам, - ген ble, ответственный за устойчивость к флеомицину, или ген hph, от которого зависит устойчивость к гигромицину В.

Ген селективности должен иметь собственные регуляторные зоны инициирования и окончания транскрипции и трансляции, так как это необходимо дли независимой экспрессии маркера. Как указывалось выше, известно большое число регуляторных зон инициирования транскрипции, которые можно использовать в сочетании с маркерным геном. В тех случаях, когда используется феномен резистентности к антибиотикам, концентрация последних может варьироваться в зависимости от типа последних от 30 до 300 мкг/мл.

Отдельные последовательности можно присоединять с помощью одного из существующих методов, например, рестрикции, соединения комплементарных рестрикционных участков и их лигирования, получения тупых концов посредством заполнения выступов с последующим лигированием, Bal 31 резекции, репарации праймера, мутагенеза in vitro и т.п.. В случае необходимости можно использовать множественные связки (полилинкеры) и адаптеры. Их внедряют и удаляют с помощью общепринятых методов с целью облегчения сборки конструируемых единиц экспрессии. На каждой стадии синтеза таких блоков применяются клонирование фрагментов, анализ рестрикционных ферментов, секвенирование, гибридизация и другие операции. Имеется большое число векторов клонирования, однако выбор того или иного из них не является лимитирующим фактором в данном изобретении. Обычно клонирование производится в E.coli.

Фланкирующие области могут включать по к