Белковый фактор, нуклеотидная последовательность, способ получения белкового фактора

Белковый фактор, нуклеотидная последовательность, способ получения белкового фактора

Реферат

 

Клонирован и секвенирован фрагмент геномной ДНК из седалищного нерва человека, кодирующий цилиарный нейротрофный фактор (SN-CNTF). Получена последовательность ДНК, пригодная для экспрессии SN-CNTF человека в E.coli и сконструированы рекомбинантные векторы экспрессии, включающие названную последовательность. После трансформации указанными векторами подходящего штамма E.coli, отбора и культивирования трансформантов из бактериальных клеток выделили активную форму рекомбинантного SN-CNTF человека с мол. массой 24 кДа и N-концевой аминокислотной последовательностью, совпадающей с последовательностью нативного белка. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 табл, 22 ил.

Изобретение относится к нейротрофным факторам и в особенности к цилиарному нейротрофному фактору (CNTF), колирующей его ДНК и способу получения рекомбинантного CNTF.

Сильнейшие нарушения, психические и физические, происходят при гибели нервных или глиальных клеток в нервной системе. Гибель нервных или глиальных клеток может вызываться нейродегенеративными заболеваниями, такими, как старческий склероз мозга и рассеянный склероз, ишемией, вызванной инсультом, травматическим повреждением, естественными процессами старения.

Нейтротрофные факторы - класс молекул, которые способствуют выживанию и функциональной активности нервных и глиальных клеток. Существуют основания для предположения, что нейротрофные факторы предотвращают нарушения деятельности в условиях, перечисленных выше Appel, 1981, Ann. Neurology 10:499.

Лучше всех охарактеризован фактор роста нерва (NGF).

Эксперименты на животных демонстрируют, что NGF предотвращает смерть холинчувствительных нервных клеток диэнцефалона после травмы и что NGF способен предотвращать потерю познавательной способности, которая случается с возрастом. Hefti и Weiner, 1986, Ann. Neurology 20:275, Fisher et al, 1987, Nature, 329: 65. Эти результаты предполагают потенциальную клиническую полезность этого фактора для людей в лечении утраты познавательной способности, наблюдаемой при болезни, травме или старении.

Сложность использования нейротрофных факторов заключается в их специфичности только к тем субпопуляциям нервных клеток, которые обладают соответствующими мембранными рецепторами. У большинства нервных клеток тела NGF рецепторы отсутствуют. Следовательно, чрезвычайно важно было выявить новые нейротрофные факторы, которые смогли бы обеспечить выживание других типов нервных и глиальных клеток.

Новые нейротрофные факторы были найдены по их способности поддерживать выживание в культуре нервных клеток, которые не являются чувствительными к NGF. Так были обнаружены факторы, которые способствуют выживаемости цилиарных ганглиозных моторных нейронов, которые инвертируют скелетные и гладкие мышцы (цилиарные ганглиозные нервные клетки принадлежат парасимпатической нервной системе и их выживаемость не поддерживается NGF).

Присутствие факторов, которые облегчают выживаемость цилиарных ганглиозных клеток, отмечено для множества тканей и видов. Эти цилиарные ганглиозные нефротрофные активности имеют следующие сходные химические и биологические свойства: (1) данная активность присутствует в высокой концентрации в седалищных нервах, (2) данная активность выдерживает присутствие ионного детергента SDS и редуцирующих агентов бета-меркаптоэтанола (BME) или дитиотрейтола (DTT) при электрофорезе в полиакриламидном геле и (3) на таких гелях эта активность мигрирует с кажущейся молекулярной массой между 24-28 кДа. Collins, 1985, Developmental, Bioligy, 109:255-258, Monthorpe et al/, 1986, Brain Pesearch, 367-282:286.

На основе этих сходных свойств предположили, что за цилиарную ганглиозную нейротрофную активность ответственны одни и те же близкородственные молекулы, обычно называемые "цилиарный нейротрофный фактор" или "CNTF".

Без достаточного количества данных нельзя утверждать, что белки, ответственные за эти активности, являются идентичными, поэтому CNTF обычно различают по происхождению (ткань и вид). Так, если вид, взятый в качестве источника - кролик, номенклатура - CNTF кроличьего седалищного нерва (кроличий SN-CNTF)/ SN-CNTF, по-видимому, находится в периферических нервах высочайших концентрациях. Он освобождается из клеток в нервы при травме. SN-SNTF поддерживает выживание и рост всех изученных нервных клеток периферической нервной системы, включая сенсорные, симпатические и парасимпатические нервные клетки. Таким образом, SN-CNTF оказывает действие на более широкий спектр нервных клеток, чем NGF. Как было недавно показано, крысиный SN-CMTF регулирует формирование специфических типов глиальных клеток в центральной нервной системе (Hughes et al., 1988, Nature 335:70).

Предполагается, что CNTF седалищного нерва - компонент ответа нервной системы на травму. SN-CNTF, освобождаемый из клеток в поврежденный нерв, как можно было ожидать, способствует выживанию и восстановлению роста поврежденных нервных клеток и регулирует функциональную активность глиальных клеток, необходимую для регенерации. Эти соображения показывают, что SN-CNTF может иметь терапевтическое значение при повреждении нервной системы, вызванном болезнью или травмой.

Несмотря на расширяющийся научный интерес к SN-CNTF, трудность выделения значительных количеств из натуральных источников и недоступность SN-CNTF человека затрудняют попытки четко продемонстрировать его значение в поддержании жизнеспособности нервных клеток. Предыдущие попытки очистить крысиный SN-CNTF привели к 800-кратному обогащению по сравнению с грубым экстрактом нервных клеток в отношении специфической активности Manthorpe et al., 1986, Brain Research 367:282-286.

Однако восьмиcоткратное увеличение специфической активности было недостаточно, чтобы получить белок одного вида. Термин "белки одного вида" используют здесь и в прилагаемой формуле исследования для обозначения полипептидов с одной с той же аминокислотной последовательностью во всех активных сайтах. Другими словами, если оперативная часть аминокислотной последовательности - одна и та же у двух или более полипептидов, они считаются здесь "белками одного вида", даже если имеется минорная гетерогенность в отношении длины или заряда.

Цель изобретения - получение SN-CNTF, очищенного до значительно большей степени, чем когда-нибудь достигнутая ранее, так, чтобы получить белок одного вида.

Еще одна цель изобретения - создание зондов для скрининга кДНК и геномной библиотек с целью клонирования животного и человеческого генов, кодирующих SN-CNTF.

Другая цель изобретения - получение последовательности ДНК для животного и человеческого CNTF.

Еще одна цель изобретения - обеспечение рекомбинантных экспрессионных систем, в которых нуклеотидная последовательность для человеческого или животного CNTF могла бы быть экспрессирована с получением человеческого или животного CNTF.

Эти и другие цели достигаются благодаря методу очистки SN-CNTF до такой степени, что специфическая активность увеличивается больше, чем в 25000 раз при сравнении экстракта и очищенного SN-CNTF, возможности анализа очищенного белка, получению на этой основе для скрининга кДНК и геномной библиотек SN-CNTF, клонированию и определению нуклеотидных последовательностей кроличьего и человеческого CNTF и использованию их в подходящей рекомбинантной экспрессионной системе с получением биологически активного SN-CNTF.

Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и последующее детальное описание, являются только примерными и не ограничивают данное изобретение. Сопровождающие рисунки, которые объединены и составляют одну из частей спецификации, иллюстрируют различные воплощения изобретения и вместе с этим описанием служат, чтобы объяснить принципы изобретения.

На фиг. 1 изображены примерные результаты хроматографии на колонке Моно Р; на фиг. 2 - примерное распределение нейротрофной активности в элюате каждого из семи участков, вырезанных из SDS-ПААГ геля после электрофореза; на фиг. 3 - примерные результаты обратнофазовой хроматографии; на фиг. 4 - примерные результаты прогона фракций на окрашенном серебром редуцирующем ДДС-ПААГ геле, эквивалентные активным и соседним с ними фракциям, показанным на фиг. 3; на фиг. 5 - профиль элюции пептидов после обработки эндопротеазой Asp-N и Lys-C; на фиг. 6 - профиль элюции пептидов после переваривания эндопротеазой Lys-C; на фиг. 7 - примерные результаты хроматографии фракций сульфата аммония на колонке фенил-Сефарозы HIC; на фиг. 8 - примерные результаты хроматографии на Mono P хроматосфокусированных на колонке алкил-Сефарозы FPLC-HIC фракций; на фиг. 9 - примерные результаты хроматографии препаративных SDS-ПЭГ фракций на C8 обратнофазовой HPLC колонке ((A) иллюстрирует результаты первоначальной процедуры очистки, (B) - результаты процедуры последовательной очистки после добавления еще двух HIC хроматографических стадий); на фиг. 10 - примерные результаты электрофореза SDS-ПААГ и Вестерн-анализа очищенного обратнофазовой хроматографией SN-CNTF (дорожка 1 в каждой из двух частей несет белки стандартного молекулярного веса (SIGMA SDS-7), дорожка 2 - очищенный SN-CNTF, (A) иллюстрирует результаты окраски серебром, (B) иллюстрирует результаты Вестерн-анализа с аффинно-очищенным антипептид-A- антителом); на фиг. 11 - нуклеотидная последовательность, кодирующая кроличий SN-CNTF (трансляция этой последовательности дает соответствующую аминокислотную последовательность, напечатанную внизу одиночным буквенным кодом, последовательности, которые подчеркнуты, подтверждены аминокислотной последовательностью, полученной при анализе белка SN-CNTF); на фиг. 12 - нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательность (трехбуквенный код) для кодирующей последовательности человеческого SN-CNTF. Последовательности человека находятся между линиями. Там, где нуклеотидная или аминокислотная последовательности кролика отличаются от человеческих, они надписаны выше или ниже линий, соответственно; на фиг. 13 - конструкция вектора экспрессии рCMVXVPL 2; на фиг. 14 - методы, использованные для конструирования CNTF-syn 1/3 для экспрессии SN-CNTF (рисунок характерен, но не в том масштабе, см. пример 7 для экспериментальных деталей); на фиг. 15 отражены методы, использованные для конструирования CNTF-syn 1/3 для экспрессии CNTF (рисунок типичный, но не в масштабе, см. пример 7 для экспериментальных деталей); на фиг. 16 - синтетические нуклеотиды с 1 по 4, используемые в конструкциях CNTF-syn 1/3 и CNTF-syn 2/3; на фиг. 17 - синтетические нуклеотиды с 5 по 10, используемые в конструкции CNTF-syn 2/3; на фиг. 18 - некоторые характеристики бактериального экспрессионного вектора pT5T, содержащего инсерцию ДНК, обеспечивающую экспрессию CNTF (рисунок типичен, но не в масштабе, см. пример 7 для экспериментальных деталей); на фиг. 19 отражены определенные черты бактериального экспрессионного вектора pT3х1-2, содержащего инсерцию ДНК для экспрессии CNTF (рисунок типичен, но не в масштабе, см. пример 7 для экспериментальных деталей); на фиг. 20 - редуцирующий SDS-полиакриламидный гель, в котором были разогнаны и окрашены Coomassie Brilliant Blue экстракты клеток, трансформированных различными экспрессионными конструкциями; на фиг. 21 - редуцирующий SDS-ПААГ, в котором были разогнаны и выявлены иммуноблоттом с аффинно-очищенным анти-CNTF пептид А-антителом экстракты клеток, трансформированных различными экспрессионными конструкциями; на фиг. 22 отражен биоанализ последовательных разведений супернатантов из бактериальных клеток, экспрессирующих pT5T:CNTF-syn 1/3 или pT3x1-2: CNTF-syn 2/3 ( вставка отражает биоанализ экстрагированных кусочков из редуцирующего SDS-ПАА-геля рТ5Т:CNTF-syn 1/3 супернатанта в районе геля непосредственно выше и ниже 24 кДа).

Хотя изобретение касается выделения CNTF из седалищного нерва кроликов, оно пригодно для выделения и очистки этого белка из других источников.

Вкратце, одно предпочтительное воплощение предлагаемого метода включает использование в качестве сырья растертого в порошок материала седалищного нерва кролика. Грубый экстракт из этого материала центрифугируют, супернатант окисляют, а полученный преципитат отбрасывают. Потом титруют супернатант NaOH и полученный осадок снова удаляют центрифугированием.

После pH-преципитаций к супернатанту добавляют насыщенный раствор сульфата аммония и удаляют преципитат центрифугированием. При дальнейшем добавлении сульфата аммония к супернатанту происходит преципитация белковой фракции, содержащей большинство SN-CNTF активности.

Вышеописанный препарат затем наносят на хроматофокусирующую FPLC колонку MonoP. Колоночные фракции собирают и анализируют pH и CNTF-активность. Фракции (указанные на фиг. 1 стрелкой с вертикальной чертой) с пиком SN-CNTF активности затем дополнительно обрабатывают, как это будет обсуждено в деталях ниже.

Сфокусированные фракции из множества прогонов через колонку MonoP наносят для электрофореза на SDS-полиакриламидный гель. Район геля, соответствующий молекулярным весам с 22 по 27 кДа, разрезают по всей толщине геля на многочисленные полоски и элюируют электрофоретически. Элюированные белки собирают и фракцию с наибольшей активностью в дальнейшем очищают, используя обратнофазовую HPLC. Этот процесс более детально описан в примерах, которые следуют.

Целесообразно проводить дополнительные стадии, которые включаются в процедуру очистки для того, чтобы обеспечить удобную обработку материала на ранних стадиях. В предпочтительном воплощении между фракционированием сульфатом аммония и хроматофокусированием вставляют хроматографию на гидрофобном носителе (фенил-Сефарозе), а гидрофобную хроматографию на колонке FPLC алкил-Сефарозы вставляют между хроматофокусированием и препаративным ЛДС-ПААГ (пример 1).

Разработанный метод очистки привел к получению SN-CNTF в очищенной форме (с более чем 25000-кратным увеличением специфической активности по сравнению с грубым экстрактом).

Увеличенная степень очистки облегчает определение аминокислотной последовательности SN-CNTF. В соответствии с изобретением определена аминокислотная последовательность, размер которой оказался достаточным, чтобы создать олигонуклеотидные пробы, которые облегчают скрининг к ДНК и геномной библиотек для клонирования животного и человеческого генов, кодирующих SN-CNTF.

Как будет обсуждаться более подробно ниже, эти гены в свою очередь сделали возможным производство в большом объеме (1) животного SN-CNTF, подходящего для изучения его способности восстанавливать животные модели повреждения нервной системы и человеческого (3) SN-CNTF, пригодного для включения в фармацевтические составы, полезные в лечении повреждений нервной системы человека.

Такие пептиды можно использовать для приготовления антител. Антитела к синтетическим пептидам получены и показано, что они реагируют с очищенным CNTF при Вестерн блот анализе (фиг. 10).

Из вышеприведенной работы конечная цель - клонировать и экспрессировать ген SN-CNTF человека для того, чтобы приготовить материал, подходящий для использования в фармацевтических препаратах для человека. Как только геномная последовательность известна, гены, кодирующие SN-CNTF, могут затем быть экспрессированы в животных или бактериальных клетках. Поскольку последовательность гена, кодирующего CNTF кролика и человека, была определена, в раскрытой здесь технологии рекомбинатной ДНК для производства CNTF могли использоваться не только природные, но и синтетические последовательности ДНК, кодирующие SN-CNTF.

Метод получения рекомбинантного CNTF включает а) приготовление последовательности ДНК, способной обеспечить в хозяйской клетке производство белка, имеющего CNTF-активность; б) клонирование последовательности ДНК в вектор, способный к введению, репликации и экспрессии последовательности ДНК в хозяйской клетке; в) перенос вектора, содержащего чужеродную последовательность ДНК и необходимые элементы в клетку хозяина, способную экспрессировать эту последовательность ДНК, кодирующую CNTF; г) культивирование клеток хозяина при условиях, подходящих для амплификации вектора и экспрессии CNTF; д) сбор CNTF и e) создание условий для образования полипептидом третичной структуры, благодаря которой он обладает CNTF-активностью.

В одном из воплощений изобретения (частично или полностью) синтетическая последовательность ДНК, использованная для получения рекомбинантного CNTF, может содержать иные нуклеотиды, чем природная последовательность ДНК, о при этом будет все еще кодировать полипептид с той же первичной структурой, что и CNTF, кодируемый CNTF генами животных или человека.

В другом воплощении изобретения природная последовательность ДНК, кодирующая CNTF, модифицируется, чтобы усилить экспрессию в организме хозяина или клетке. Такие модификации могут включать следующее: а) если нативная последовательность ДНК-геномная ДНК, то с целью последующей экспрессии в бактериальной системе может использоваться удаление интронов; б) изменение нуклеотидной последовательности путем введения последовательностей, узнающихся различными ферментами рестрикции, для простоты последующих стадий лигирования, клонирования и мутагенеза; в) изменение последовательности нуклеиновых кислот путем использования кодонов, предпочитаемых организмом хозяина, используемым для получения рекомбинантного белка; г) соединение нуклеотидных последовательностей с оперативными элементами, необходимыми для поддержания и экспрессии ДНК в организме хозяина или клетке.

Подготовленная таким образом последовательность вставляется в экспрессионный вектор, способный к существованию в организме хозяина и направлению экспрессии CNTF.

Векторы E.coli Векторы, предлагаемые для использования в изобретении, включают любые векторы, в которые, как обсуждалось выше, последовательность ДНК может быть введена вместе с любыми предпочтительными или требующимися оперативными элементами, и полученный вектор может затем быть последовательно введен в клетку хозяина и быть реплицирован в такой клетке. Предпочтительные векторы - те, чьи рестрикционные сайты хорошо известны и которые содержат оперативные элементы, предпочтительные или требуемые для транскрипции последовательности ДНК. Однако определенные приложения изобретения касаются и не полностью изученных в настоящее время векторов, содержащих одну или более описанных последовательностей ДНК. В частности, предпочтительно, чтобы все эти векторы имели некоторые или все следующие характеристики: (1) обладали минимальным количеством последовательностей организма-хозяина, (2) стабильно поддерживались и размножались в желаемом хозяине, (3) были способны присутствовать в большом числе копий в желаемом хозяине, (4) обладали регуляторным промотором, расположенным так, чтобы способствовать транскрипции интересующего гена, (5) имели по меньшей мере одну маркерную последовательность ДНК, кодирующую селективный признак, представленный в части плазмиды, отделенной от той, куда может быть инсерцирована последовательность ДНК, и (6) ДНК последовательности, способные к терминированию транскрипции.

В различных предпочтительных воплощениях изобретения эти клонирующие векторы, содержащие и способные экспрессировать последовательности ДНК изобретения, содержат различные оперативные элементы. Эти "оперативные элементы", как здесь обсуждается, включают по меньшей мере один промотор, по меньшей мере одну последовательность Шайн-Дельгарно и инициирующий кодон и по меньшей мере один терминаторный кодон. Желательно, чтобы эти "оперативные элементы" также содержали по крайней мере один из следующих: по меньшей мере один оператор, по меньшей мере одну лидерную последовательность для секреции белков, по меньшей мере один ген для регуляторного белка и также другие последовательности ДНК, необходимые или предпочтительные для свойственной им транскрипции и последующей трансляции векторной ДНК.

Определенные из этих оперативных элементов могут быть представлены в каждом из предпочтительных векторов изобретения. Любые другие дополнительные оперативные элементы, которые, возможно, потребуются, можно добавить к этим векторам, используя методы, известные всем, имеющим самые обычные знания в этой области, особенно в свете данного руководства.

Например, нужные последовательности ДНК лигируют в подходящие векторы, как описано у Maniatis и др., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories (1984), приводимой здесь в виде ссылки.

Векторы, подходящие для использования в микроорганизмах, других, чем E. coli, также рассматриваются в рамках этого изобретения. Такие векторы описаны в таблице. В дополнение к этому определенные предпочтительные векторы обсуждаются ниже.

б) Векторы Pseudomonas Некоторые векторные плазмиды, которые автономно реплицируются в широком спектре Грамм-негативных бактерий, являются предпочтительными для использования как клонирующих челночных векторов в хозяевах с геномом Pseudomonas. Определенные из них описаны Tait, R.C., Close T.J. Lundguist, R.C., Hagiya, M. Rodriguez, R. L., и Kado, C.I. B.Biotechnology, May, 1983, pp. 269-275, Panopoulos, N. J. в Genetic Engineering in the Plant Sciences, Praeger Publishers, New York, pp. 163-185 (1981); и Sakagucki, K. в Current Toric in Microbiology and Immunology 96:31-45 (1982), каждый из которых специально объединен здесь в ссылках. Одна особенно предпочтительная конструкция обычно содержит плазмиду RSF1010 и ее производные, как описано Bagdasarian, M., Bagdasarian, M. M. , Coleman, S., и Timmis, K.N. в Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance, Timmis, K.N и Puhler, A. eds, Elsevier/Noth Holland Biomedical Press (1979), специально внесенные здесь в ссылки. Преимущество RSF 1010 в том, что она относительно маленькая, высококопийная, которая легко трансформируется и стабильно поддерживается, как в E.coli, так и в видах Pseudomonas. В этой системе предпочтительно использовать Tac экспрессионную систему, как описано для Esherichia, поскольку оказалось, что trp промотор E. coli охотно узнается PHK-полимеразой Pseudomonas (Sakagucki, K. в Curent Toris in Microbiology and Immunology 96:31-45 (1982) и Gray, G.L., Mckeown, K.A., Jones, A.J.S. Seeburg, P.H., и Heyneker, H.L. в Biotechnology, Feb. 1984, pp. 161-165).

В тех случаях, где рестрикционные минус штаммы хозяина видов Pseudomonas не имеются в наличии, трансформационная эффективность плазмидных конструкций, выделенных из E.coli, невысокая. Следовательно, желателен пассаж клонирующего вектора Pseudomonas перед трансформацией желаемого хозяина через r^-m⁺ штамм других видов (Bagdasarian, M., и др. Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance, pp. 411-422, Timmis и Puhler eds., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979).

в) Векторы Bacillus Предпочтительная экспрессионная система с хозяином рода Bacillus включает использование плазмиды pUB-110 в качестве клонирующего челночного вектора. Как в других векторных системах, в Bacillus возможно экспрессировать CNTF изобретения внутриклеточно или в виде секреторного белка. Настоящее приложение включает обе системы. Челночные векторы, которые реплицируются, как в Bacillus, так и в E.coli, имеются в распоряжении для конструирования и тестирования различных генов, как описано Dubnau, D., Gryczan, T., Contente S., и Shivakumar, A.G., Genetic Engineering, Vol. 2, Setlow и Hollander eds. , Plenum Press, New York, pp. 115-131) (1980), специально внесенных здесь в виде ссылки. Для экспрессии и секреции CNTF в B. subtilis предпочтительно присоединяют к району ДНК, кодирующему белок, сигнальную последовательность альфа-амилазы. Для синтеза внутриклеточного CNTF последовательность ДНК можно присоединить с сохранением рамки к сайту связывания рибосом альфа-амилазной лидерной последовательности.

Транскрипция любой из этих конструкций предпочтительно направляется альфа-амилазным промотором или его производным. Это производное содержит сайт узнавания РНК-полимеразы нативного альфа-амилазного промотора, но также присоединяет и район lac оператора. Сходные гибридные промоторы, сконструированные из промотора гена пенициллиназы и оператора lac, как было показано, функционируют в хозяине Bacillus в регуляторной манере, как установлено Yansura, D. G. и Henner в Genetics and Biotechnology of Bacilli, Gansean A.T и Hoch, J.A., eds., Academic Press, pp. 249-263 (1984), специально внесенные в ссылки. Ген lac I E. coli может также быть включен в плазмиду для внесения регуляции.

г) Векторы Clostridium Одна из предпочтительных конструкций для экспрессии в Clostridium - плазмида pSU12, описанная Squires, C.H. и др. в J. Bacteriol., 159: 465-471 (1984), трансформированная в C. pertringens методом Heefner, D.L. др., как описано в J. Bacteriol. 159: 460-464 (1984). Транскрипция направляется промотором гена устойчивости к тетрациклину. Трансляция определяется наличием последовательности Шайн-Дальгарно того же гена tet^r.

д) Дрожжевые векторы Сохранение чужеродной ДНК, введенной в дрожжи, может осуществляться несколькими способами, как описано Botstein, D. и Davis, R.W., в The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Strathern, Jones and Braach, eds, pp. 607-636 (1982), специально внесенные здесь в ссылки. Одна из предпочтительных экспрессионных систем для использования Saccharomyces в качестве хозяйского организма и гена CNTF 2 м плазмида. Преимущества ее включают относительно высокое число копий и стабильность при введении в cir' штаммы. Эти векторы также могут включать начало репликации и по меньшей мере один маркер устойчивости к антибиотику из pBR322, чтобы разрешить репликацию и селекцию в E. coli. Двухмикронную последовательность и дрожжевой ген LEU2 обеспечивают использование в LEU2 дефектных мутантах дрожжей.

Если планируется, что рекомбинантный CNTF будет в конце концов экспрессироваться в дрожжах, предпочтительно, чтобы клонирующий вектор сначала был введен в Escherichia coli, где вектору позволили бы реплицироваться, после чего вектор трансформировали бы в дрожжи для окончательной экспрессии CNTF.

е) Клетки млекопитающих В качестве последовательностей для экспрессии CNTF в клетках млекопитающих служат кДНК и геномная ДНК, кодирующие SN-CNTF.

Должна иметься последовательность, которая будет эффективно связываться рибосомами, как описано Kozak, в Nucleic Acids Resеarch 15: 8125-8132 (1987), специально вынесенным здесь в ссылки. Рестрикционный фрагмент ДНК, несущий последовательность ДНК, кодирующую CNTF, можно вставить в экспрессионный вектор, который уже имеет транскрипционный промотор и энхансер, как описано у Guarente, L. в Cell 52: 303-305 (1988) и Kadonada, J.T. и др. в Cell 51: 1079-1090 (1987). Промотор может быть регуляторным, как в плазмиде (Pharmacia Cat. N 27450601), если конструктивная экспрессия ингибитора вредна для роста клеток. Вектор должен иметь полный сигнал полиаденилирования, как описано у Ausubel, F.M. и др. в Current Protocols in Molecular Biology, Wiley (1987), чтобы мРНК, транскрибируемая с этого вектора, правильно процессировалась. Кроме того, вектору следует иметь начало репликации и по меньшей мере один маркер устойчивости к антибиотику из pBR 322, чтобы разрешить репликацию и селекцию в E. coli.

Для того, чтобы селектировать стабильную клеточную линию, которая продуцирует SN-CNTF, экспрессионный вектор может нести ген селектируемого маркера, такой, как маркер лекарственной устойчивости, или нести комплементарный ген для дефектной клеточной линии, например, ген дигидрофолятредуктазы (dhfr) для трансформации dhfr - клеточной линии, как описано у Ausubel и др. supra. Плазмида, несущая селектирующий маркер, может быть котрансформирована вместе с экспрессионным вектором.

Клетки хозяина/Трансформация Вектор, полученный описанным образом, вводят в подходящую клетку-хозяина. Эти хозяйские клетки могут быть клетками микроорганизмов или клетками млекопитающих.

а) Микроорганизмы Считается, что может быть выбран любой микроорганизм, имеющий способность принимать экзогенную ДНК и экспрессировать ее гены и прилежащие оперативные элементы. После того, как организм хозяина выбран, в хозяйский организм вводят вектор, используя обычные методы. Примеры таких методов можно найти в Advanced Bacterial Genetics by R.W.Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1980). Предпочтительно, чтобы трансформация происходила при низкой температуре, так как температурная регуляция обсуждается как средство регулирования генной экспрессии через использование оперативных элементов, как указано выше. В другом воплощении, если в вектор введены осмотические регуляторы, изменение болевых концентраций во время трансформации требует предусмотреть подходящий контроль в чужеродных генах.

Предпочтительно, чтобы микроорганизм-хозяин был факультативный аэроб или анаэроб. Среди дрожжей целесообразно использовать Saccharomyces и особенно Saccharomyces cerevisiae. Среди бактерий предпочтительно являются роды Bacillus, Escherichia и Pseudomonas, особенно Bacillus subtilis и Escherichia coli. Другие хозяйские клетки перечислены в таблице.

б) Клетки млекопитающих Вектор может быть введен в культивируемые клетки млекопитающих несколькими технологиями, такими, как кальцийфосфат: ДНК-копреципитация, электропорация или слияние протопластов. Предпочтительный метод - копреципитация с фосфатом кальция, как описано Ausubel и др., supra.

Существует много стабильных клеточных типов, которые легко трансформируются и способны транскрибировать, процессировать и транслировать последовательность ДНК и продуцировать белок SN-CNTP. Однако клеточные типы могут быть вариабельными по отношению к гликозилированию белков и пост-трансляционным модификациям аминокислотных остатков (или любым другим). Таким образом, идеальные клеточные типы - те, что продуцируют рекомбинантный CNTP, идентичный природной молекуле.

Клетки хозяина культивируют в условиях, подходящих для экспрессии CNTF. Эти условия в основном специфичны для клетки хозяина и легко определяются специалистом средней квалификации в этой области в свете опубликованной литературы, касающейся условий роста для таких клеток и рекомендаций, содержащихся здесь. Например, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 8th Ed. , Williams & Wilkins Company, Baltimore, Maryland содержат информацию об условиях культивирования бактерий. Подобная информация по культивированию дрожжей и клеток млекопитающих может быть получена из работы Pollack, R. Mammalian Cell Culture, Cold Spring Habor Laboratories (1975), специально внесенной здесь в виде ссылки.

В одном из воплощений клетки выращивают до высокой плотности в присутствии подходящих регуляторных условий, которые ингибируют экспрессию последовательности ДНК. Когда достигнута оптимальная клеточная плотность, условия среды изменяют до подходящих для экспрессии последовательности ДНК.

Рекомбинантный SN-CNTF может быть очищен после экспрессии в клетке хозяина или организма.

В предпочтительном воплощении изобретения CNTF присутствует в его биологически активном состоянии уже при извлечении бактериальных культур. В альтернативном предпочтительном воплощении создают условия, в которых экспрессированный CNTF принимают свою активную структуру (на соответствующей стадии процесса очистки).

Для очистки рекомбинантного белка используют некоторые комбинации следующих стадий: анион-обменную хроматографию (Mono-Q, Mono-S и/или DEAE-Сефарозу), гельпроникающую хроматографию (Сефароза), хроматофокусирование (Mono-P) и хроматографию, оснащенную на гидрофобном взаимодействии (окти- и/или фенил-Сефароза).

Следующие примеры приводятся для иллюстрации определенных предпочтительных воплощений изобретения и не ограничивают его. Все ссылки, данные в этих примерах, специально внесены здесь.

Пример 1. Приготовление белка.

Материалы Седалищные нервы взрослых кроликов получены от Pel- Freez Biologicals, Rogers, Arkansas. Сульфат аммония (высокой чистоты) был закуплен у Schwartz /Mann Biotech. Cleveland ohio. Фенилметилсульфонилфторид (PMSF) эпсилон-аминокапроновая кислота, бензамидин, пепстатин, дитиотреитол (ДТТ), поли- L орнитин (Р3655) и 3-/4,5-диметилтиазол-2 yl) 2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) получены от Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri. _ MonoP хроматофокусирующие FPLC колонки получены из Pharmacia, Inc., Pisataway, New Jersey. C8 обратнофазовые HPLC колонки получены от Synchrom, Inc. Lafayette, Indiana. Ацетонитрил закуплен у J.T. Baker Chemicak Co., Phillipsburg, New Jersey. Трифтороуксусная кислота получена от Pierce Chemicals, Rockford, Illinoice. Эндопротеазы Asp-N и Lys-c получены от Boehringer Mannerheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana. Фетальная телячья сыворотка закуплена у Hyclone Laboratories, Logan, Utah. Культурные среды и солевые растворы получены от Irvine Scientific, Santa Ana, California. Культуральные чашки получены от Costar, Cambridge, Massachusetts. Патоген-свободные фертильные эмбриональные яйца курицы для сугубо практического использования получены от Spafas, Roanoke, Illinois.

б) Анализ SN-CNTF Культуры основных куриных эмбриональных цилиарных ганглиев готовили, как описано ранее (Collins, 1978, Develop. Biol. 65:50; Manthorpe et al., 1986, Develop. Brain Res. 25:191. Цилиарные ганглии удаляли из фертильных, патоген-свободных куриных яиц, которые инкубировали в течение 9 - 10 дней при 38^oC во влажной атмосфере. Ганглии подвергали химическому разделению при обработке сначала сбалансированным солевым раствором Хенкса без двухвалентных катионов, содержащих 10 мМ HEPES буфер, pH 7,2 10 мин при 37^oC, а затем обрабатывали раствором 0,125% бактотрипсина 1:250 (Difco, Detroit, Michigan) в сбалансированном солевом растворе Хенкса, модифицированного, как описано выше, 12 мин при 37^oC. Трапсинизацию останавливали добавлением фетальной телячьей сыворотки до конечной концентрации 10%.

После этой обработки ганглии переносили в раствор, состоящий из модифицированной Дульбекко среды Игла без бикарбоната, содержащей 10%-ную фетальную телячью сыворотку и 10 мМ HEPES, pH 7,2 и механически разделяли пропусканием 10 раз через пастеровскую пипетку, конец которой был гладко обожжен и вытянут до диаметра, позволяющего за 2 с наполнить пипетку.

Разделенные ганглии помещали в чашку (для тканевых культур диаметром 100 мм) с культуральной средой (см. выше), дополненной 10%-ной фетальной телячьей сывороткой, 4 мМ глутамина, 60 мг/л пенициллина-G, 25 мМ HEPES, pH 7,2 (40 разделенных ганглиев на чашку) на 3 ч. Такая процедура выполнялась для того, чтобы разделить ненейронные клетки, которые прилипали к чашке, и нервные клетки, которые не прилипали. После трех часов неприлипшие нервные клетки собирали центрифугированием, ресуспендировали в культуральной среде и высевали по 50 мкл на лунку в половину лунок 96-луночных микротитровальных планшетов для культуральной среды (с плотностью примерно 1500 нервных клеток на лунку).

Микротитровальные лунки предварительно обрабатывали раствором полиорнитина (1 мг/мл) в 10 мМ борате натрия, pH 8,4 в течение ночи при 4^oC, отмывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе.

10 мкл последовательных разведений образца добавляли в каждую лунку и планшеты инкубировали 20 ч при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 7,5% CO₂, с целью анализа нейротрофной активности. Через 18 ч в каждую лунку добавляли 15 мкм раствора тетразолиевой краски МТТ (1,5 мкг/мл) в среде Дульбекко без бикарбоната, содержащей 10 мМ HEPES, pH 7,2, и культуры помещали обратно в инкубатор (37^oC) на 4 ч. Затем добавляли 75 мкл раствора (6,7 мл 12М HCl на 1 л изопропанола) и содержимое каждой лунки гомогенизировали 30 раз, чтобы разрушить клетки и суспендировать краситель. Затем определяли поглощение при 570 нм по сравнению с 690 нм поправкой для каждой лунки, используя автоматический считыватель микротитровальных планшетов (Dynatech, Chantilly, Virginia). Поглощение содержимого лунок, которые не содержали какого-либо нейротрофного агента (негативные контроли), вычитали из поглощения образец-содержащих лунок. Окончательное поглощение пропорционально количеству живых клеток в каждой лунке, которые трактуют как нервные клетки, способные превращать краситель. Количество единиц нейротрофной активности определяли как эквивалентное разделение, которое дает 50% максимальной выживаемости нервных клеток. Активность в трофических единицах на 1 мл получена делением общего количества единиц активности на объем анализа (60 мкл).

Удельная активность определялась делением общей активности трофических единиц на количество белка, присутствующего в образце.

в) Очистка SN-CNTF В конце каждой из следующих стадий препарат либо использовался немедленно, либо оставлялся при -70^oC не более чем на одну неделю до использования.

Стадия 1. Приготовление грубого экстракта.

100 г (сырой вес) кроличьего седалищного нерва (около 300 нервов) оттаивали и растирали, используя политронный роторный гомогенизатор (Kinematica, Switzerland) 1 мин в 10 объемах (вес/об) воды, содержащей 10 мМ ЭДТА, 1 мМ эпсилон, аминокапроновую кислоту, 1 мМ бензамидин и 0,1 мМ PMSF, и центрифугировали при 140000 g 30 мин при 4^oC. Супернатант фильтровали через стеклянный фильтр, чтобы удалить флотирующие липиды.

Стадия 2. Обработка кислотой и аммонием Стадии центрифугирования, на которые ссылаются ниже, выполнялись при 17000 g 20 мин и все операции выполнялись при 4^oC, если не оговорено особо. Грубый экстракт центрифугировали. Супернатант закисляли до pH 3,65 н. HCl и полученный преципитат удаляли центрифугированием. Супернатант титровали до pH 6,3 1 н. NaOH и полученный проципитат снова удаляли центрифугированием. К указанному выше супернатанту добавляли