Пептиды, или их фармацевтически приемлемые кислоты, или соли, фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью по отношению к бомбезину, способ лечения рака у млекопитающих

Пептиды, или их фармацевтически приемлемые кислоты, или соли, фармацевтическая композиция, обладающая антагонистической активностью по отношению к бомбезину, способ лечения рака у млекопитающих

Реферат

 

Изобретение относится к пептидам формулы (I): X - A¹ - A² - Тгр - Ala - Val - Gly - His - Leu - psi - A⁹ - Q, где X представляет собой водород, простую связь, связывающую альфа-аминогруппу A¹ с гамма-карбоксильной частью на 3-пропионильной части A², если A² является Glu[-], или группу формулы R¹CO-, где R¹ выбирают из группы, включающей в себя: водород, C₁ - C₁₀ - алкил, или фенил C₁ - C₁₀ - алкил, A¹ представляет собой D- или L-аминокислотный остаток, выбранный из группы, включающей в себя: Phe, p - Hl - Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, незамещенный Trp или Trp, замещенный в бензольном кольце одним или несколькими заместителями из группы, включающей C₁ - C₃ - алкил, либо A¹ представляет собой пептидную связь, связывающую ацильную часть R₁CO с альфа-аминочастью A², если A² представляет собой Gln, Glu/-/ Glu (Y) или His, где /-/ представляет собой простую связь, связывающую гамма-карбоксильную группу A² с альфа-аминогруппой A¹, если A² является Glu, где X представляет собой простую связь, Y представляет собой - ОR⁵, где R⁵ является водородом, C₁ - C₃ - алкилом или фенилом; Leu - psi - представляет собой редуцированную форму Leu, где C = 0 - часть присутствует вместо - CH₂-, так, что связь указанной - CH₂ - части с альфа-аминогруппой соседнего A⁹ - остатка является псевдопептидной связью; A⁹ представляет собой Тас, МТас, или DМТас; а Q представляет собой NH₂ или CQ¹, где Q¹ является водородом, и к фармацевтически приемлемым кислотам или солям, а также к фармацевтической композиции, обладающей антагонистической активностью по отношению к бомбезину и к способу лечения рака у млекопитающих на основе пептидов формулы (I). 4 с. и 11 з.п. ф-лы, 11 табл., 4 ил.

Изобретение относится к новым пептидам, которые влияют на рост раковых опухолей у человека. Более конкретно, изобретение относится к антагонистам бомбезина, которые представляют собой ^8-9 - псевдопептиды, содержащие Tac-, MTac- или OMTac- остаток в C-концевом положении; к их солям и фармацевтическим композициям, а также к способам синтеза указанных пептидов и к способам их использования. Эти пептиды являются антагонистами по отношению к бомбезину или бомбезинподобным пептидам.

Изобретение относится к полипептидным соединениям, которые обладают антагонистической активностью по отношению к бомбезину или бомбезинподобным пептидам, таким как гастрин-высвобождающий пептид (GRP), нейромедин C и т.п. (называемый далее бомбезин-антагонистической активностью) и которые могут быть использованы, например, для лечения злокачественных опухолей у теплокровных животных, включая человека. Изобретение относится к новым полипептидным соединениям и способам их получения, а также к новым фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептидные соединения, и к способам изготовления лекарственных препаратов, способных продуцировать бомбезин-антагонистический эффект при их введении теплокровным животным, включая человека.

Бомбезин представляет собой амид тетрадекапептида, который впервые был выделен из кожи лягушки Bombina bombina (краснобрюхая жерлянка) (Anastasi, Erspamer and Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Известно, что указанный бомбезин является сильным митогеном для фибробластных клеток мышей Swiss 3Т3 (Rozengurt and Sinnett-Smith, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 2936) и стимулирует секрецию амилазы из ацинуса поджелудочной железы морских свинок (Jensen, Jones, Folkers and Gardner, Nature, 1984, 309, 61). Кроме того, известно, что бомбезинподобные пептиды продуцируются и секретируются клетками мелкоклеточного рака легких (SCL C) человека (Moody, Pert, Gazdar, Garney and Minna, Science, 1981, 214, 1246). Известно также, что экзогенно добавленные бромезинподобные пептиды могут стимулировать in vitro рост клеток SCLC человека (Garney, Cuttita, Moody and Minna, Canser Research, 1987, 47, 821) и что моноклональное антитело, которое является специфическим к C-концевой области бомбезина и GRP, может блокировать связывание GRP с его рецептором и предупреждать рост SCLC-клеток человека как in vitro, так и in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler and Minna, Nature, 1985, 316, 823).

GRP (гастрин-высвобождающий пептид), который обладает бомбезинподобными свойствами, является широко распространенным амидированным пептидом, содержащим 27 аминокислот, выделенных из кишки свиньи (McDonald, Jornvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom and Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90, 227), где C - концевая аминокислотная последовательность является почти идентичной C-концевой последовательности бомбезина. Нейромидин C представляет собой амидированный декапептид, который имеет структуру, идентичную десяти последним аминокислотным в C-концевой области CPP, и который был выделен из тонкой кишки собаки (Reeve, Walsh, Chew, Clark, Hawke and Shively, J. Biol. Chem. , 1983, 258, 5582). GRP стимулирует ряд биологических реакций, включая высвобождение гастрина в большом круге кровообращения, а в фибробластных мышиных клетках ЗТЗ и в клетках мелкоклеточного рака легких (SCLC), он также играет роль фактора роста. Поэтому было высказано предположение, что GRP играет непосредственную патофизиологическую роль в развитии SCLC посредством аутокринного механизма роста.

Бомбезин, нейромедин C и C-концевой нонапептид GRP имеют следующую структуру: Бомбезин: pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

Нейромедин C: H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

C-концевой нонапептид GRP: Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂.

В результате исследования других бомбезинподобных пептидов, происходящих от земноводных, из кожи лягушки, обитающей в Папуа- Новой Гвинеи, удалось выделить литорин, который представляет собой нонапептид ( pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH₂ и который, как оказалось, является исключительно сильным аналогом бомбезина (Yasukara et al, Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Исследования аналогов бомбезина показали, что сегмент, состоящий по меньшей мере из 9 аминокислотных остатков в 6-14 положениях, обладают полным спектром бомбезиновой активности.

Было охарактеризовано несколько видов антагонистов бомбезина. Субстанция P (Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gen-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH₂), которая имеет очень слабую гомологию с аминокислотной последовательностью бомбезина, не способна ингибировать связывание бомбезина и бомбезинподобных пептидов, однако, как было обнаружено, аналоги cубстанции P, модифицированные путем замены нескольких L-аминокислот D-аминокислотами, например, такие, как (D-Arg¹, D-Pro², D-Trp^7,9, Leu¹¹), субстанция P и (D-Arg¹, D-Phe⁵, D-Trp^7,9, Leu¹¹), субстанция P (Moody и др., Fed. Proceedings, 1987, 46, 2201), могут блокировать секрецию бомбезина в клетках ацинуса поджелудочной железы и подавлять рост-стимулирующее действие бомбезина в клетках Swiss 3Т3. Было также установлено, что два типа антагонистов бомбезина, происходящих от бомбезина, например (D-Phe⁶, D-Phe¹²), бомбезин и [Leu¹³-psi-Leu¹⁴], бомбезин (Coy и др., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056 и пептиды, 1989, 10, 587), являются сильными in vitro и in vivo ингибиторами бомбезинового ответа.

Другой тип антагонистов бомбезина, обнаруженный Heimbrook и др., (Bio. Chem., 1989, 264, 11258), представляeт собой N-ацетил-GRP (20-26) и его аналоги, которые образуются от GRP (20-27) - аналогов путем делеции C-концевого метионинового остатка. Coy [J. Biol. Chem., 264, 1989, 25, 14691)] показал, что некоторые короткоцепочечные антагонисты бомбезина, полученные на основе последовательности литорина, например, [D-Phe⁶, Leu¹³ -psi-Phe¹⁶] бомбезин (6-14) и [D-Phe⁶, Leu¹³-psi-Leu¹⁴] бомбезин (6-14), обладают гораздо более высокой активностью, чем их соответствующие родственные пептиды [Leu¹³-psi-Leu¹⁴] бомбезин.

Линейные (нециклические) бомбезиновые аналоги GRP и бомбезина земноводных, имеющие, но необязательно, в CH₂-NH непептидную связь, описаны в заявке на патент PCTWO 90/03980 (a родственные аналоги описаны в WO 91/02746). Как указывается в этой заявке, эти аналоги, которые действуют как ингибиторы натуральных бомбезиновых пептидов, имеют следующую формулу: где R₁ и R₂ = H; A^o может быть делетирован; из многих возможных аминокислот в каждом положении: A¹ может представлять собой D-Phe, D-Trp или D-Nal; A² может представлять собой Gln; A⁴ может представлять собой Ala; A⁵ может представлять собой Val; A⁶ может представлять собой Gly; A⁷ может представлять собой His, a W представляет собой: где R₄ = CH₂-NH; в некоторых случаях Z₁ может представлять собой идентифицирующую боковую цепь Leu, т.е. - CH₂OH (CH₃)₂; Z₂ может представлять собой идентифицирующую боковую цепь Cys или Met, т.е. - CH₂-SH или (CH₂)₂ - S-CH₃; V = N(R₆)R₇, где R₆, R₇ и R₈ могут представлять собой H; а R₁ и R₂ могут представлять собой H или COE₁, где E₁ может быть C₁C₂₀-алкилом.

Линейные пептидные аналоги бомбезина описаны также в EP 0309297. Эти пептиды могут иметь C - концевой Met - остаток и [CH₂ - NH] псевдопептидную связь между C - концом и примыкающим к нему остатком.

Изобретение относится к новым полипептидам, которые являются сильными антагонистами бомбезина, к способам их синтеза и к новым лекарственным средствам, включая фармацевтические композиции, содержащие указанные полипептиды, и к использованию этих композиций в качестве фармацевтически активных агентов.

А. Синтетические пептиды.

Более конкретно, один из вариантов осуществления изобретения относится к псевдопептидам, обладающим сильной бомбезин-антагонистической активностью, и имеющим формулу I; X-A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A⁹-Q (1) где X представляет собой водород; простую связь, связывающую альфа-аминогруппу A¹ с гамма-карбоксильной частью на 3-пропионильной группе A², если A² является Glu, или группу формулы R¹CO-, где R¹ выбирают из группы, включающей в себя: a) водород, C₁-C₁₀-алкил, фенил, фенил-C₁-C₁₀-алкил, P-H1-фенил, p-H1-фенил-C₁-C₁₀-алкил, нафталин- C₁-C₁₀-алкил, индолил, индолил- C₁-C₁₀-алкил, пиридил, пиридил- C₁-C₁₀-алкил, тиенил, тиенил- C₁-C₁₀-алкил, циклогексил, или циклогексил - C₁-C₁₀-алкил, где H1, например, является F, Cl, Br, OH, CH₃ или OCH₃; b) где R² представляет собой водород, C₁-C₁₀-алкил, фенил, или фенил-C₁-C₁₀-алкил; R³ представляет собой водород, или C₁-C₁₀-алкил; c) R⁴ - O, где R⁴ представляет собой C₁-C₁₀-алкил, фенил, или фенил-C₁-C₁₀-алкил; A¹ представляет собой D-, L- или DL- аминокислотный остаток, выбранный из группы, включающей в себя Phe, p-Hl-Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi незамещенный Trp или Trp, замещенный в бензольном кольце одним или несколькими заместителями, выбранными из F, Cl, Br, NH₂ или C₁-C₃-алкила; либо пептидную связь, связывающую ацильную часть R¹CO с альфа-амино-частью A²; A² представляет собой Gln, Glu[-], Glu (Y), или His, где [-] означает простую связь, если X является простой связью, а A² является Glu, причем эта связь связывает гамма-карбоксильную часть или 3-пропионильную часть A² с альфа-аминогруппой A¹, а Y представляет собой: (a) - OR⁵, где R⁵ является водородом, C₁-C₃-алкилом или фенилом; или (b) где R⁶ является водородом или C₁-C₃-алкилом; а R⁷ является водородом, C₁-C₃-алкилом, или -NHCONH₂; Leu-psi представляет собой редуцированную форму Leu, где вместо -CH₂- присутствует часть C=O, так, что связь указанной -CH₂- части с альфа-аминогруппой соседнего A⁹ - остатка является псевдопептидной связью; A⁹ представляет собой Tac, MTac, или DMTac; Q представляет собой NH₂ или -OQ¹, где Q¹ является водородом, C₁-C₁₀ - алкилом, фенилом, или фенил - C₁-C₁₀ - алкилом, и, кроме того, изобретение относится к фармацевтически приемлемым кислотам или солям описанных псевдопептидов.

Если A⁹ = Tac, MTac или DMTac, то у A⁹ имеется 5-членное гетероциклическое кольцо. Это кольцо в основном образуется путем окисления боковой цепи остатка A⁹ на определенной стадии синтеза нонапептида формулы I (проводимого предпочтительно с использованием формальдегида или ацетальдегида), в результате чего происходит циклизация боковой цепи с альфа-аминогруппой остатка A⁹. Идентичность полученного циклизованного остатка A⁹ зависит от идентичности оригинала (т.е., неоксидированного A⁹) и от оксиданта.

Так, например, если -CH₂-SH-группа Cys⁹ циклизуется с альфа-аминогруппой Cys⁹, связанной посредством Leu-psi-псевдопептидной связью, в реакции с формальдегидом, то образующееся кольцо имеет структуру формулы IIA (ниже показана как -Leu⁸-psi-Tac⁹-NH₂-фрагмент нонапептида формулы I): Эти псевдопептиды обладают более высокой биологической активностью и большей стабильностью, чем их нециклические варианты, где A⁹ является Cys или Ren. Тем не менее в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения в том случае, если в пептидах формулы I A⁹ является нециклизованным, а X, A² и Q являются такими, как они определены выше, то указанный A⁹ - остаток представляет собой Cys или Ren, а A¹ представляет собой не встречающуюся в природе аминокислоту, выбранную из L- или D- Pal, L- или D - Tpi или Hca.

В некоторых предпочтительных вариантах X представляет собой R¹CO, R¹ представляет собой водород или C₁C₁₀-алкил (предпочтительно метил); A¹ = D - Cpa, D - Nal, D - Rhe, D- или D-Tpi или D-Trp; A² = Gln; A⁹ = Tac или DMTac, а Q = NH₂.

Однако в другом предпочтительном варианте изобретения, если A¹ является пептидной связью, связывающей ацильную часть R¹ - CO-группы с альфа-аминогруппой остатка A², то A² является Gln или His; A⁹ является Tac, M-Tac, или DM-Tac, а Q является NH₂. В предпочтительной форме указанных пептидов X является Hca, Hna, Paa, Mpp, Hpp или Naa; A² является Cln; а A⁹ является Тас.

B. Способы синтеза.

Антагонисты бомбезина формулы I могут быть синтезированы путем твердофазного синтеза. В первой схеме синтеза все аминокислоты последовательно присоединяются друг к другу после того, как C-концевой остаток будет связан с твердофазным полимерным носителем. Затем после связывания аминокислотных остатков с полимером осуществляют реакцию боковой цепи C-концевого остатка с оксидантом, в результате которой образуется 5-членное гетероциклическое кольцо псевдопептида. Полученный псевдопептид подвергают HF-обработке для его отделения от твердофазного полимерного носителя. Эта реакция позволяет также удалить защитные группы боковой цепи.

Во второй схеме синтеза псевдопептиды формулы I могут быть получены в виде двух фрагментов, которые синтезируются путем твердофазного синтеза, либо путем синтеза в жидкой фазе. Трипептид, содержащий C-конец, связывают с олигопептидом, в результате чего получают полный антагонист бомбезина формулы I.

5-членное гетероциклическое кольцо образуют при помощи реакции боковой цепи A⁹ с оксидантом. Затем пептид подвергают HF-обработке, в результате которой удаляются все защитные группы боковой цепи аминокислотного остатка, а пептид отщепляется от полимерного носителя.

C. Лекарственные средства.

Псевдопептиды формулы I могут быть использованы в фармацевтических композициях, предназначенных для лечения раковых или других заболеваний у млекопитающих путем введения этим млекопитающим эффективной дозы псевдопептида или его терапевтически приемлемой кислоты или соли в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Указанные псевдопептиды в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем могут быть введены в дозе, составляющей от около 1 до 1000 мг на 1 кг веса тела в день. Эти композиции могут быть введены парентерально, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интраназально, с помощью легочных аэрозолей и инъекций замедленного всасывания.

На фиг. 1 изображен график, иллюстрирующий величину объема опухоли рака молочной железы мыши МХТ в зависимости от введения некоторых антагонистов бомбезина и полученный исходя из данных, представленных в табл.7 примера 7; на фиг. 2 - график, иллюстрирующий величину объема опухоли SCLC у "голых" мышей в зависимости от введения некоторых антагонистов бомбезина и полученный на основе данных, представленных в табл. 9 примера 8; на фиг. 3 - график, иллюстрирующий величину объема опухоли поджелудочной железы (MIA PACA-2) у "голых" мышей в зависимости от введения некоторых антагонистов бомбезина и полученный на основе данных, представленных в табл. 10 примера 9; на фиг. 4 - график, иллюстрирующий величину объема опухоли поджелудочной железы CAPAN-2 у "голых" мышей в зависимости от введения некоторых антагонистов бомбезина и полученный на основе данных, представленных в табл.11 примера 10.

Описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения.

A. Синтетические пептиды.

1. Номенклатура.

В данном описании для удобства используемые аминокислоты, пептиды и их производные обозначаются в соответствии со стандартными аббревиатурами, обычно принятыми в пептидной химии и рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре Международного союза по теоретической и прикладной химии (IUPAC - IUB) [European J. Biochem., 1984, 138, 9-37].

Аббревиатуры для отдельных аминоксилотных остатков образованы на основе тривиальных названий аминокислот, например, Ala означает аланин, Cys - цистеин, Gln - глутамин, Glu - глутаминовая кислота, pGlu - пироглутаминовая кислота, Gly - глицин, His - гистидин, Leu - лейцин, Phe - фенилаланин, Trp - триптофан и Val - валин. Clu может иметь функциональные группы, связанные с его гамма-карбоксильной боковой цепью.

[-] или Y является такими, как они были определены выше, Dpa представляет собой 2,3-диаминопропионовую кислоту. В том случае, если aминокислотный остаток имеет изомерные формы, то, если нет каких-либо указаний, подразумевается L-форма, в противном же случае перед названием аминокислоты имеются D- или DL.

Используемые в данном описании редко встречающиеся аминокислоты имеют следующие обозначения: Cpa - п-хлорфенилаланин Dpa - 2,3-диаминопропионовая кислота PGlu - пироглутаминовая кислота Nal - 3-(2-нафтил)-аланин Pal - 3-(3-пиридил)-аланин Pen - пеницилламин Tpi - 2,3,4,9-тетрагидро-1H-пиридо-[3,4-b]индол-3-карбоновая кислота Tac - тиазолидин-4-карбоновая кислота DMTac - 5,5-диметил-тиазолидин-4-карбоновая кислота MTac - 2-метил-тиазолидин-4-карбоновая кислота Аналоги аминокислот имеют следующие обозначения: Hca - гидрокоричная кислота или дес-амино-фенилаланин Hna - 3-гидрокси-2-нафтойная кислота Hpp - 3-(4-гидроксифенил)пропионовая кислота Mpp - 3-(4-метоксифенил)пропионовая кислота Naa - нафтилуксусная кислота Paa - фенилуксусная кислота Кроме того, были использованы следующие обозначения: AC - ацил Ac - ацетил AcOH - уксусная кислота BHA - бензидриламин Boc - трет-бутоксикарбонил (BOC)₂O - ди-трет-бутилдикарбонат Bom - бензилоксиметил But - бутил Bzl - бензил BSA - альбумин бычьей сыворотки DIC - 1,3-диизопропилкарбодиимид DMEM - модифицированная по способу Дульбекко, среда Игла DMF (ДМФ) - диметилформамид Et - этил EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота FCBS - околоплодная сыворотка теленка Fmoc - флуоренилметилоксикарбонил For - формил HITES - среда RPMI 1640 + 10^-8M гидрокортизона, 5 мкл/мл бычьего инсулина, 10 мкг/мл трансферрина человека, 10^-8M - эстрадиола и 3 10^-8 M Na₂SeO₃ HOBt - 1-гидроксибензотриазол HPLC (ВРЖХ) - высокоразрешающая жидкостная хроматография Leu - psi редуцированная форма Leu, где вместо - CH₂ - присутствует C = 0 - часть, так, что связь указанной - CH₂ - части с амино-частью остатка A⁹ является псевдопептидной связью Me - метил MeCN - ацетонитрил MeOH - метиловый спирт PBS - фосфатно-буферный раствор TEA - триэтиламин TFA - трифтороуксусная кислота.

В данном описании запись пептидных последовательностей проводится в соответствии с общепринятой нормой, т.е., N-концевая аминокислота находится слева, а C-концевая аминокислота находится справа. Однако при этом следует отметить, что в описании, если это не оговорено особо, стандартная нумерация аминокислотных остатков во фрагментарном пептиде не соблюдается и не соответствует их истинным положениям в полном тетрадекапептидном антагонисте бомбезина. Если следовать стандартной нумерации, то остатки в нонапептиде формулы I должны быть пронумерованы от 6 до 14, а ядро Trp - Ala - Val - Gly - His - Leu- антагонистов бомбезина должно быть пронумеровано A⁸ - A⁹ - A¹⁰ - A¹¹ - A¹² - A¹³. Вместо этого во избежание путаницы пептидные антагонисты бомбезина, используемые в данном описании, были пронумерованы следующим образом: N-концевой аминокислотный остаток (или остаток аналога) был обозначен A¹; C-концевой аминокислотный остаток (или остаток аналога) был обозначен A⁹; а промежуточные остатки были пронумерованы по порядку от A² (остаток, примыкающий к N-концевому остатку A¹) до A⁸ (остаток, примыкающий к C-концевому остатку A⁹).

2. Предпочтительные варианты осуществления изобретения.

В предпочтительных вариантах своего осуществления настоящее изобретение относится к пептидным антагонистам бомбезина, имеющим формулу I: X - A¹ - A² - Trp - Alа - Val - Gly - His - Leu - - A⁹ - Q I где X, A¹, A², Leu - , A⁹ и Q являются такими, как они были определены выше.

Указанные псевдопептиды, антагонисты бомбезина, отличаются своей аминокислотной последовательностью, особенно в остатках A¹, A² и A⁹, а также наличием псевдопептидной связи между A⁸ и A⁹ и необязательно наличием 5-членного гетероциклического кольца у A⁹. Кольцевая структура определяется идентичностью остатка A⁹ и соединением, используемым для его окисления. Так, например, если используется формальдегид, а A⁹ представляет собой Cys, то полученное кольцо имеет структуру Tac формулы IIA (показанную ниже в виде Leu⁸ - -Tac⁹ - Q - фрагмента пептида формулы I, где Q = NH₂) : Если используeтся ацетальдегид, а A⁹ является Cys, то полученное 5-членное гетероциклическое кольцо имеет структуру MTac формулы IIB (показанную ниже в виде Leu⁸ -MTac⁹ - Q - фрагмента пептида формулы I, где Q = NH₂) : Если используется формальдегид, а A⁹ является Pen, то полученное кольцо имеет структуру DMTac формулы IIC ( показанную ниже в виде - Leu⁸ - - DMTac⁹ - Q - фрагмента нонапептида формулы I, где Q = NH₂) : В описанных предпочтительных вариантах осуществления изобретения желательно, чтобы X=H или Ac, A¹=D-Phe, A²=Gln и Q=NH₂.

Ниже представлены наиболее предпочтительные псевдопептидные антагонисты бомбезина данного изобретения: Пептид - Структура 1. - D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 2. - D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 3. - D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 4. - Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- Tac-NH₂ 5. - D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 6. - D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 7. - D-Nal-Glh-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 8. - Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 9. - D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 10. - D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 11. - Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 12. - Tpi-Gin-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 13. - D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 14. - Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 15. - D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 16. - D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His- Leu- -Tac-NH₂ 17. - D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 18. - D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -DMTac-NH₂ 19. - Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -DMTac-NH₂ 20. - D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -DMTac-NH₂ 21. - Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -DMTac-NH₂ 22. - D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -DMTac-NH₂ Особенно предпочтительными вариантами являются следующие пептиды 2. - D-Phe-Gln-Trp-Ala-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 13. - D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -Tac-NH₂ 18. - D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu- -DMTac-NH₂ B. Методы синтеза 1. Обзор Псевдопептиды формулы I могут быть получены любым способом, обычно используемым в пептидной химии. Такие способы описаны, например, в книге M. Bodanszky, Principees of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.

Все псевдопептиды формулы I могут быть получены в соответствии с техникой твердофазного синтеза. Этот способ является наиболее предпочтительным для получения указанных псевдопептидов и их промежуточных пептидов. Техника твердофазного синтеза описана в руководстве J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rocrford, IL, 1984 (2-ое изд. ), и в образе G.Barany и др., Imt. J. Peptide Protein Res., 30, 705 - 739, 1987. Дополнительная стадия окисления C-концевого остатка A⁹, проводимая для циклизации конкретной боковой цепи этого остатка с его альфа-аминогруппой, может быть осуществлена в одной из нескольких ступеней синтеза пептидов формулы I.

Для получения псевдопептидных антагонистов бомбезина формулы I могут быть использованы по крайней мере две схемы синтеза. В первой схеме все аминокислоты последовательно присоединяются друг к другу, начиная от C-концевого остатка A⁹, который предварительно присоединяют к твердофазному носителю. Во второй схеме сначала на полимерном носителе синтезируют трипептид. Затем этот трипептид присоединяют к олигопептиду, несущему все остальные аминокислоты, необходимые для образования нужного пептида. В обеих схемах синтез начинают с C-концевого остатка A⁹, к которому последовательно добавляют соответствующие аминокислоты вплоть до N-концевого остатка.

1 (а) Первая схема. В качестве полимерного твердофазного носителя для синтеза псевдопептидов может быть использована бензгидриламиновая (BHA) смола или хлорометилированная полистироловая смола, сшитая (на 1%) с дивинилбензолом, причем указанные две смолы являются коммерчески доступными. C-концевой остаток A⁹ присоединяют к одной из указанных смол посредством его карбоксильной группы. Для предупреждения реакции между двумя указанными остатками, перед тем как присоединить этот остаток (A⁹) к смоле-носителю, альфа-аминогруппу каждого A⁹- остатка блокируют с помощью химической защитной группы. Защитной группой для альфа-аминогруппы A⁹-остатка, и каждого последовательно присоединяемого остатка, может быть либо 9 - флуоренилметилоксикарбонильная (Fmoc) или трет-бутоксикарбонильная (Boc) группа. Fmoc предпочтительно использовать при связывании C-концевого остатка A⁹ с остатками до A², поскольку реакция удаления Boc также способствует удалению защитной группы боковой цепи от C-концевого A⁹остатка. В процессе указанных реакций присоединения функциональные группы боковых цепей некоторых аминокислотных остатков могут быть также защищены от нежелательных химических реакций путем их связывания с химической защитной группой (подходящей группой для A⁹ является But) до осуществления реакции присоединения.

После присоединения C-концевого Fmoc-A⁹(But)-остатка к твердому носителю альфа-аминогруппу этого остатка подвергают разблокированию, а затем к нему присоединяют Fmoc-Leu-CHO, образуя тем самым псевдопептидную связь.

Остальные остатки, A⁵, A⁴, A³ и A², защищенные предпочтительно oc-группой, и A¹, защищенный предпочтительно Boc-группой, постадийно добавляют в обратном порядке (A⁷, A⁶ и т.п.), в результате чего получают нужный псевдопептид.

Если в указанном псевдопептиде присутствует His или Clu то в процессе реакций их присоединения или реакций присоединения других остатков боковые цепи указанных остатков могут оказаться незащищенными от нежелательных химических воздействий. В соответствии с этим перед осуществлением реакции присоединения этих аминокислот их боковые цепи могут быть связаны с химической защитной группой.

После того как все аминокислотные остатки будут присоединены к BHA-смоле, Boc-группа у N-конца псевдопептида может быть удaлена. 5-членное гетероциклическое кольцо у Tac, MTac или DMTac может быть образовано с помощью реакции - CH₂ - SH-части Cys (или -C(CH₃)₂SH Pen) и вторичной аминогруппы редуцированной связи, соединяющей остатки A⁸ и A⁹ (т.е. альфа-аминогруппы A⁹), с оксидантом, таким, как формальдегид или ацетальдегид. Промежуточный псевдопептид, еще несущий защитные группы боковых цепей, подвергают HF-обработке в целях его отщепления от твердофазного носителя, а также в целях удаления защитных групп боковой цепи.

1. Вторая схема.

Во второй схеме в соответствии с процедурой твердофазного синтеза конструируют трипептид с использованием BHA-смолы в качестве носителя, в результате чего получают следующий защищенный трипептид на носителе: Boc-His (Bom)⁷-Leu⁸- -Cys(But)⁹-BHA-смола Boc¹ - группу и But - группу удаляют, а -CH₂-SH-часть Cys подвергают циклизации с вторичным амином редуцированной связи, соединяющей остаток A⁸ с остатком A⁹, в результате чего получают His(Bom)⁷-Leu⁸-psi-Tac⁹-BHA-смолу. После HF-обработки, получают свободный трипептид: His⁷-Leu⁸-psi-Tac⁹-NH₂. В соответствии со стандартным методом твердофазного синтеза, на Gly-OCH₂-смоле постадийно конструируют пептид на носителе: "Boc A¹-A²-Trp-Ala-Val-Gly-OCH₂-смола", после чего эту конструкцию обрабатывают 95% метанолом, содержащим 1% KCN (в течение 12 ч), в результате чего Boc-олигопептид отщепляется. После конструирования этих двух фрагментов Boc-олигопептид присоединяют к свободному His⁷-Leu⁸- -Tac⁹-NH₂-трипептиду с использованием BOP-реагента. Затем Boc-группу удаляют и получают нужный пептид.

Ниже перед подробным описанием синтеза антагонистов бомбезина формулы I приводится несколько общих процедур осуществления синтеза, характерных для одной или обеих из указанных схем.

2. Общие процедуры полипептидного синтеза.

Процедура 1. Получение некоторых синтетических остатков для реагентов.

а) L и D-Tpi: 2,04 г (10 мМ) L-Trp растворяли в 25 мл кипящей воды, содержащей 2,1 г лимонной кислоты. Затем добавляли 0,5 мл 40%-ного водного формальдегида, после чего сразу начали образовываться твердые вещества. Полученную смесь охлаждали в ледяной бане, а осадок собирали, промывали холодной водой, осушали воздухом, а затем осушали при комнатной температуре, в результате чего получали 2,14 г твердого вещества (99%), т.пл. (с разложением) около 310^oC. D - изомер, который получали тем же способом из D-Trp, также имел т.пл. (разлож.) около 310^oC.

b) L - и D-Boc-Tpi. К размешанной суспензии из 10,8 г (50 мМ)-Tpi в 250 мл 0,2 н. NaOH и 7,5 мл триэтиламина добавляли 10 г Di-трет-бутилдикарбоната, полученную смесь размешивали 4 ч, а затем, размешивая, добавляли еще 10 г дикарбоната и после повторного 3- часового размешивания добавляли еще 10 г дикарбоната. После этого смесь размешивали в течение ночи и экстрагировали (2100 мл) эфиром, а эфирный слой отделяли и отбрасывали. К водному слою добавляли лимонную кислоту (в целях доведения pH до 3-5). Твердый остаток собирали, промывали водой и осушали воздухом в течение ночи.

Твердые вещества суспендировали в 100 мл тетрагидрофурана. При этом почти все твердые вещества растворялись. Нерастворимые вещества удаляли путем фильтрации, а ТГФ удаляли в вакууме. Остаток растирали с эфиром и получали 9,20 г (или 58%) нужного материала. Этот материал имел такую же т. пл. , что и исходный материал, но отличался от исходного материала по своей растворимости. ТСХ на силикагеле проводили с использованием смеси CHCl₃ : MeOH : HOAC = 85:15:0,5.

Повторяя аналогичную процедуру с использованием 2,55 г - Tpi, получали 2,22 г или 59% Boc-Tp.

с) Fmoc-Leu-CHO. Сложный метиловый эфир Fmoc-лейцина (35 г, 134 мМ) в безводном толуоле (250 мл) в атмосфере азота охлаждали с использованием смеси сухого льда и ацетона, после чего в течение 30 мин добавляли 150 мл 25% гидрида ди-изобутилалюминия в толуоле. После этого смесь размешивали 20 мин в бане из сухого льда/ацетона, а затем осторожно добавляли метанол (15 мл). Полученную смесь выливали в 1000 мл ледяной воды, размешивали и фильтровали. Затем толуол отделяли, а водную фазу снова экстрагировали эфиром (3х300 мл). Толуол и эфирные экстракты объединяли и осушали сульфатом натрия. Полученное масляное вещество быстро пропускали через колонку с силикагелем (3х50 см) в 1500 мл 15% EtOAc/ петрола. И наконец получали Fmoc-Leu-CHO в виде твердого веществ (27,6 г).

d) Синтетические аминокислоты или аналоги аминокислот, вводимые в псевдопептиды данного изобретения, являются в основном коммерчески доступными. Так, например, Hca поставляется фирмой Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, Milwaukee, W1 53233. Boc- или Fmoc-защищенные аминокислоты поставляются фирмой Advanced Chem. Tech., 5609 Fern Valley Road, Louiville, KV 40228; или Bachem California, 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505.

Процедура 2. Получение смолы и присоединение A⁹-остатка.

BHA-смолу получали путем обработки 10% TEA в CH₂Cl₂ (для нейтрализации) (два раза по 3 мин), а после обработки ее 6 раз промывали метиленхлоридом. Fmoc-A⁹ (But) - остаток связывали со смолой путем добавления 1,35 мМ Fmoc-A⁹ (But) и 1.50 мМ 1-гидрокси-бензотриазола (HOBt) в ДМФ с последующим перемешиванием полученной смеси в течение 3 мин. Затем смесь перемешивали путем встряхивания в течение 60 мин при комнатной температуре. Полученную Fmoc-A⁹ (But)-BHA-смолу промывали метиленхлоридом, метанолом (каждый раз дважды) и три раза снова метиленхлоридом, после чего эту смолу анализировали с помощью теста Keiser (Anal. Biochem. 34, 595 (1970). В случае, если обнаружилось неполное связывание, описанную процедуру повторяли.

Процедура 3. Образование псевдопептидной связи.

Отщепление (т.е. разблокирование) Fmoc - группу от A⁹ осуществляли путем добавления 50% пиридина в ДМФ с последующим 30-минутным размешиванием, промыванием ДМФ (6х1 мин), а затем (i) добавлением Fmoc-Leu-CHO (3 экз.) в ДМФ, содержащей 1% AcOH; (ii) добавлением NaBH₃CN(3,5 экв.) в ДМФ, и размешиванием (путем встряхивания) в течение 60 мин. Полученную смесь последовательно промывали 50% MeOH (3х1 мин); 100% MeOH (3х1 мин) и ДМФ (3х1 мин).

Процедура 4. Присоединение аминокислот и образование пептидной связи В качестве защитной группы для альфа-аминогруппы A⁹-остатка и каждого последовательно присоединяемого аминокислотного остатка могут быть использованы либо 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc)-группы, либо трет-бутилоксикарбонил (Boc)-группа. При связывании A⁹ с последующими аминокислотными остатками вплоть до N-концевого аминокислотного остатка предпочтительной является Fmoc-группа, поскольку реакция удаления Boc позволяет одновременно удалить защитную группу боковой цепи A⁹-остатка.

A) Использование Fmoc-аминокислоты.

Для введения Fmoc-аминокислоты в Fmос-промежуточный пептид осуществляли следующие процедуры: (1) Fmос - промежуточный пептид подвергали разблокированию и нейтрализации, а затем промывали метиленхлоридом (3х1 мин) и ДМФ (3х1 мин) (2) Fmос - аминокислоту присоединяли к разблокированному промежуточному пептиду путем (i) добавления Fmос-аминокислоты (3 экв.) и HOBt (3,3 экв.) в ДМФ (3 мин) к промежуточному пептиду; (ii) добавления 3 экв. DIC (в виде 20%-ного раствора в CH₂Cl₂); и 90-минутного встряхивания полученной смеси.

(3) Затем смесь промывали этанолом (3х1 мин) и диметилформамидом (3х1 мин).

Для присоединения других остатков только что присоединенную Fmос-аминокислоту подвергали разблокированию 50% пиперидином в течение 30 мин, а затем промывали диметилформамидом (6х1 мин). Последующие процедуры присоединения осуществляли в соответствии с описанием в стадии (2).

Каждый раз после присоединения новой аминокислоты к смоле или пептиду проводили тест Kaizer и в случае обнаружения неполного связывания реакцию повторяли.

Для присоединения Fmос-Gly и Fmос-Gln стадию (2) описанной процедуры модифицировали следующим образом: к смеси ДМФ - раствора Fmос - аминокислоты (3,0 экв.) и HOBt (3,3 экв.) добавляли (в течение 15 мин