Слитой белок и способ выделения слитого белка

Слитой белок и способ выделения слитого белка

Реферат

 

Применение: в биологии и медицине для создания лекарств пролонгированного действия. Сущность изобретения: слитой белок, не встречающийся в природе, содержащий удлиняющий пептидный фрагмент, ковалентно-связанный своим C-концом с N-концом центральной части белка, общей формулы I: A - X - Y - (X¹ - Y)_n - белок, где A = H, Met; причем, если A = H, то белок - аналог bGRA, если A = Met, то белок Bur - PHказа4; X = Ala, Ser, Tyr, Val, Arg, Gly, Lys, Pro, Phe; y = Ala, Ser, Pro; X¹ = Ala, Gly, Jle, His, Lys, Phe, Tys; n = 0 - 4, причем если n = 0, а A = H, y = Ala, Ser, Thr. Способ выделения слитого белка формулы I, где A = Met; n = 4; X = Ala, Gly, Pro; y = Ala, Pro, X¹ = His; "белок" = BUR - PH; путем колоночной хроматографии на сефарозе Pharmacia, включающей иммобилизованные ионы металла. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к слитым полипептидам, которые не встречаются в природе и содержат N-концевые части, расщепляемые дипептидилпептидазой IV (DPP IV).

Техника молекулярной биологии, в частности техника рекомбинантных ДНК, позволяет получать относительно большие количества нужных биологически активных полипептидов. Кроме того, посредством модификации генетической информации, кодирующей эти полипептиды, могут быть получены относительно большие количества модифицированных полипетидов. Модификации этих полипетидов часто используют для улучшения их активности или облегчения их продуцирования и/или синтеза. В соответствии с этим было предпринято много попыток определить, какие именно модификации необходимы для увеличения, усиления или других изменений биологической активности нужных полипептидов. Кроме того, была проведена большая работа по модификации нужных полипептидов для облегчения их синтеза и очистки.

Природные полипептиды часто сначала биологически синтезируют в виде более крупных предшественников, которые затем усекают рядом протеолитических расщеплений с продуцированием конечных продуктов. Так, например, существует несколько протеаз, которые распознают и расщепляют специфические аминокислоты и/или аминокислотные последовательности. Эти протеазы участвуют в превращение белка-предшественника в конечный полипептидный продукт.

Одной из таких протеаз является дипептидилпептидаза IV (DPP IV) (EC 3.4.14.5). Впервые DPP была описана Hopsu-Havu, V.K. и G.G. Glenner, Histo. Chenue 3: 197-201 (1966), и, как было показано, она присутствует во многих тканях и млекопитающих. DPP IV является коммерчески доступной и выпускается Enzyme Systems Products (Дублин, Калифорния). DPP IV распознает специфические аминокислотные последовательности на N-концах белков. В частности, DPP IV будет отщеплять дипептид от N-конца, если второй аминокислотой от N-конца является пролин (Pzo), гидроксипролин (Hyp), аланин (Ala), серин (Ser) и треонин (Thr), а в положении N-концевого остатка находится любая аминокислота при условии, что пролин или гидроксипролин не являются третьим аминокислотным остатком от N-конца. Активность DPP IV является более эффективной, если пролин или аланин являются второй аминокислотой от N-конца, а особенно эффективной, если это положение занимает пролин. Широко описана активность DPP IV в поэтапном расщеплении "PRO"-частей предшественников природных пептидов.

Современные технологии дают возможность получить высокий уровень продуцирования биологически активных белков. Важные полипептиды могут быть получены с использованием пептидных синтезаторов или могут быть продуцированы в хозяйских клетках с использованием техники рекомбинантных ДНК. Часто биологически активные белки используют в качестве лекарственных средств. Существует множество примеров, в которых активные белки используют в качестве терапевтических или профилактических средств, либо для усиления или подавления каких-либо определенных признаков. Поскольку DPP IV и другие протеазы расщепляют белки, то эти лекарственные средства являются восприимчивыми к деградации. Таким образом, недостаток использования биологически активных полипептидов в качестве лекарственных средств заключается в том, что время их присутствия в организме должно быть минимизировано, а поэтому они должны вводиться более часто.

Быстрое развитие техники рекомбинантных ДНК, которая позволяет продуцировать полипептиды, белки и их аналоги в больших количествах и в очень короткий период времени, требует разработки высокоэффективного и предсказуемого способа выделения этих белков из комплексных смесей, включающих в себя полное количество белка, продуцируемого хозяйской клеткой, и белка в культуральной среде. Очистка гетерологических полипептидов, продуцированных хозяйскими клетками, может быть очень дорогостоящей процедурой, и может вызывать денатурацию самого белкового продукта. Обзор способов очистки белков приводится в патенте США 4782137 в главе "Известный уровень техники", выданном 1 ноября 1988 Hopp и др. и вводимым в настоящее описание посредством ссылки.

Для устранения вышеуказанных ограничений предшествующего уровня техники и получения более совершенных методов техника рекомбинантных ДНК может быть использована для получения нужных полипептидов в виде синтетических белков, содержащих линкерный пептид, который может быть использован в качестве лиганда или другой мишени в способах очистки. Например, в патенте США N 4782137 описан синтез не встречающегося в природе пептида, содержащего антигенный линкерный пептид. Этот синтетический пептид может быть пропущен через колонну, содержащую иммобилизованные антитела, которые связываются с антигенным линкером и способствуют тем самым выделению синтетического белка. В патенте США N 4569794 раскрывается способ очистки синтетических белков, которые содержат N-концевые удлиняющие сегменты, обладающие сродством к иммобилизованным металлам. Синтетические белки связываются с иммобилизованными металлическими ионами в колонке. Эти способы имеют тот недостаток, что использование линкерного пептида часто является нежелательным, а его удаление может представлять определенные трудности.

Изобретение относится к синтетическим гибридным белкам, которые состоят из центральной части белка и N-концевой части, которая отщепляется DPP IV. В соответствии с настоящим изобретением синтезируемый белок представляет собой гибридный белок, в котором удлиняющая часть, присоединенная к центральной части белка, не является природной N-концевой удлиняющей частью, связанной с сердцевиной белка, то есть, синтезируемый белок не является натуральным. Настоящее изобретение относится к пролекарствам, которые являются ненатуральными DPP-IV-расщепляемыми белками, где центральная часть белка представляет собой биологически активный белок. Настоящее изобретение относится к DPP-IV-расщепляемым белкам, не встречающимся в природе, которые могут быть использованы в способах очистки, поскольку присутствующий в них N-концевой удлиняющий сегмент сообщает этим белкам отличительную особенность или свойство, облегчающие их очистку.

Настоящее изобретение относится к синтетическим белкам, имеющим N-концевые удлиняющие сегменты, отщепляемые DPP IV, так что под действием DPP IV, эти синтетические белки превращаются в нужные белки. При использовании этих ненатуральных белков в качестве пролекарства они подвергаются in vivo-процессингу с помощью DPP IV, присутствующей в целевых видах, в результате чего образуется биологически активный белок. При использовании такого ненатурального белка в процессе очистки он может быть очищен с помощью специфически сконструированных N-концов, используемых в качестве лиганда и удаляемых затем посредством процессинга с участием DPP IV, в результате которого высвобождается нужный белок.

Изобретение позволяет продуцировать нужные белки в виде синтетических белков, которые затем превращаются в нужные белки под действием DPP IV. Пролекарство превращается в лекарственное средство в течение определенного периода времени с использованием эндогенной DPP IV пациента, в результате чего достигается длительное присутствие активного лекарственного средства в организме пациента и, следовательно, снижается частота введения этого средства пациенту. В соответствии с настоящим изобретением чистые нужные белки могут быть получены путем продуцирования и очистки синтезированных белков с последующим их in vitro-процессированием с помощью DPP IV, в результате чего образуется нужный белок.

Изобретение относится к слитому (гибридному) белку, не встречающемуся в природе и содержащему удлиняющую пептидную часть, которая своим C-концом ковалентно связана с N-концом центральной части белка и которая имеет следующую формулу: A-X-Y(X'-Y)_n где A является необязательным, а в случае его присутствия, он является метионином; n=0-7; X выбирают из группы Ala, Arg, Gly, Lys, Pro, Phe, Ser, Tyr, Val; X' = Ala, Gly, Ile, His, Lys, Phe, Tyr; Y выбирают из группы, состоящей из пролина, аланина, серина и треонина, при условии, что если n=0, то Y выбирают из группы, состоящей из аланина, серина и треонина.

Изобретение также относится к использованию указанных синтетических белков в изготовлении лекарственных препаратов и к способу выделения нужных белков из смеси, содержащей указанные ненатуральные белки и примеси, который включает стадии избирательного взаимодействия указанного ненатурального белка с материалом, иммобилизующим этот белок; удаления указанных примесей; выделения указанных ненатуральных белков из указанного материала; взаимодействия указанных ненатуральных белков с DPP IV и выделения указанных нужных белков.

Патент США 4569794, выданный Smith и др. 11 февраля 1986, относится к способу очистки белков и к соединениям, используемым в этом способе. В этом изобретении описывается способ выделения гибридных белков, которые в своем C-конце имеют биоактивные полипепетиды, а в N-конце- N-концевой удлиняющий линкер, который образует хелатный комплекс с ионом металла. Этот гибридный пептид обладает сродством к иммобилизованным ионам металла. Примеси могут быть удалены путем пропускания смеси, содержащей гибридный белок, через колонку, содержащую иммобилизованные ионы металла. Этот гибридный белок связывается с ионами металла, и в результате элюируются лишь примеси. Затем путем изменения условий гибридный белок освобождает от иммобилизованных ионов металла, получая таким образом очищенный гибридный белок.

В патенте США N 4782137, выданном Hopp и др. 1 ноября 1988, раскрывается синтез гибридного белка, имеющего высоко антигенную N-концевую часть и нужный полипептид в своей C-концевой части. Согласно Hopp и др., гибридные белки выделяют из сырого супернатанта путем пропускания этого сырого супернатанта через колонку, содержащую иммобилизованные антитела, которые распознают антигенную часть гибридного белка. Эти иммобилизованные антитела удерживают белок в колонке, в то время как нежелательные компоненты надосадочной жидкости элюируются. Затем путем изменения условий в колонке способствуют диссоциации комплекса "антиген-антитело". После этого гибридный белок элюируют и собирают.

Патент США 4734399, выданный Felix и др. 29 марта 1988, относится к аналогам фактора высвобождения гормона роста. В этом патенте раскрываются несколько аналогов, которые имеют концевые Tyr-Ala и His-Ala. Однако эти молекулы являются не гибридными белками, а лишь белками с центральным полипептидом. N-концевые дипептиды Felix и др. являются частью сердцевины молекулы bGRF-аналога.

В публикации европейской патентной заявки 0220958, опубликованной 6 мая 1987, описано селективное химическое удаление N-концевых остатков. Это изобретение относится к способу удаления N-концевых остатков из нужных полипетидов и к соединениям, используемым в этом способе. Нужный полипептид присутствует в виде гибридного белка, имеющего желаемый полипептид, который в N-конце соединен с линкером, имеющим формулу X-Pro. При воздействии на гибридный белок специфическим буфером образуется дикетопиперазин X-Pro-части гибридного белка, после отщепления которого из гибридного предшественника продуцируется нужный полипептид. Гибридные белки указанной заявки EPO 220958 ('958) не могут быть включены в настоящее изобретение, поскольку согласно настоящему изобретению в том случае, если N-концевой удлиняющий фрагмент является всего лишь дипептидом, т.е. если A отсутствует, n=0, а X является природной аминокислотой, то Y представляет собой либо аланин, либо серин, либо треонин. Таким образом, всегда, когда удлиняющий фрагмент является дипептидом, он имеет формулу X-Ala, X-Ser или X-Thr. В заявке '958 описано химическое, не ферментативное, отщепление дипептида X-Pro. Дипептид X-Ala, X-Ser и X-Thr является невосприимчивым к отщеплению химического типа, указанного в заявке '958, где удлиняющий сегмент X-Pro отрезают от центральной части белка.

В документе по патентной заявке Австралии AU-A-12709/88 раскрываются гибридные белки, которые содержат аффинные пептиды, используемые в аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (IMAC). Афинные пептиды, которые раскрываются в этом документе, содержали по крайней мере два соседних гистидиновых остатка. Описываемый способ IMAC-очистки требует специальной химической технологии синтеза полимеров нитрилотриуксусной кислоты (NTA).

Статья Tallon и др. в Biochem. 26:7767-7774 (1987) относится к удлиненным аналогам тридекапептидного -фактора от Saccharomyces cerevisiae. Эти синтезированные аналоги представляют собой удлиненные -факторы, которые имеют последовательности природного про--фактора, кодированного структурным геном MPI.

В статье Kriel и др. в Eur. J. Biochem. III: 49-58 (1980) описывается постадийное отщепление N-концевой части предшественника мелиттина (промелиттина) дипептидилпептидазой IV. Промелиттин является основной составной частью пчелиного яда. В аминокислотной последовательности N-концевой части предшественника каждый второй остаток является либо пролином, либо аланином. Подвергая промелиттин воздействию DPP IV, выделенной из почки свиньи, постадийно осуществляют отщепление N-концевой области предшественника, получая таким образом зрелый белок. В отличие от гибридных белков настоящего изобретения промелиттин является натуральным белком.

Статья Julius, D. и др. в Cell, т. 32:838-852 (март 1983) относится к роли связанной с мембраной DPP IV в процессинге дрожжевого -фактора из более крупного полипептида-предшественника. В отличие от гибридных белков настоящего изобретения дрожжевой -фактор является натуральным белком.

Mollay, C. и др. в Eur. J. Biochem. 160:31-35 (1986) описывает выделение DPP IV из кожного серкета Xenopus laevis. Обсуждается также активность DPP IV.

В статье Mentlein, R. в FEB т. 234, 2, с. 251-256 (июль 1988) обсуждаются пролиновые остатки при созревании и деградации пептидных гормонов и нейропептидов. Сообщается, что у млекопитающих пролин-специфические протеазы, такие как DPP IV, не участвуют в биосинтезе регуляторных пептидов, но могут играть важную роль в их расщеплении. Так, например, делается вывод, что хотя у позвоночных и низших позвоночных конверсия белков-предшественников в зрелые формы происходит в основном с помощью DPP IV, однако в процессинге регуляторных белков у млекопитающих DPP IV в основном используются в качестве протеолитических ферментов, осуществляющих деградацию белка.

Frohman L. A. и др. в J.Clin. Invest. 78:906-913 (1986) указывают, что фактор высвобождения гормона роста человека (hGRF) и их аналоги быстро разлагаются in vivo в организме человека и in vitro под воздействием DPP IV плазмы.

Frohman L.A. и др. в J. Clin. Invest. 83:1533-1540 (1989) указывают, что фактор высвобождения гормона роста человека (hGRF) и их аналоги быстро разлагаются in vivo в организме человека и in vitro под действием DPP IV плазмы.

Статья Kubiak Т.М. и др. Drug Metabolism and Disposition, т.17, N 4, с. 393-397 (1989) относится к метаболическому разложению аналога фактора высвобождения бычьего гормона роста в бычьей и свиной плазме и к корреляции этого разложения посредством DPP IV-активности в плазме. Рассматриваемые bGRF-аналоги имели AIa-остаток в 2-положении N-конца. При этом указывается, что метаболическое разложение bGRF в плазме происходит благодаря присутствию в плазме DPP IV.

Hong W. и др. Biochemistry, 28:8474-8479 (1989) описывают экспрессию ферментно активной DPP IV в клетках яичника китайского хомячка после трансфекции.

Kreil G., TIBS 15:23-26 (январь 1990) описывает постадийное расщепление дипептидов с помощью DPP при конверсии предшественников до конечных продуктов. Предшественники, описанные Kreil, являются натуральными белками. Гибридные белки настоящего изобретения являются ненатуральными гибридными белками.

Boman и др. J. Biol. Chem. 264:5852-5860 (1989) показали, что дипептидилпептидаза, выделенная из cecropia pupae с аналогичной специфичностью к DPP IV, обладает способностью к отщеплению натуральных N-концевых последовательностей Ala-Pro-GIu-Pro от N-концевых синтетических копий натуральных предшественников cecropia A и B. Препрокекропин, раскрытый Boman, является натуральным белком.

Dalboge H. , и др. Bio/technology, 5:161-164 (February 1987) раскрывают превращение E. coIi - продуцируемого предшественника гормона роста человека (hGH) в аутентичный hGH in vitro. N-концевой удлиняющий сегмент предшественника удаляют с помощью дипептидилпептидазы I.

Dalboge H и др. FEBS, Vol. 246 (1,2):89-93 (март 1989) раскрывают клонирование и экспрессию IL-I -предшественника и его конверсию в IL-I путем удаления N-концевого сегмента указанного предшественника с помощью дипептидилпептидазы I.

Dalboge H. и др. FEBS, Vol. 266 (1,2):1-3 (июнь 1990) описывают in vivo - процессинг N-концевого метионина в E. coli. При этом указывается, что удаление N-концевого метионина на удлиненного гормона роста человека зависит от того, какая аминокислота является соседней с метионином.

Hopp T. P. и др. Bio/Technol. 6:1204-1210 (октябрь 1988) раскрывают добавление пептида из восьми аминокислот к N-концу нужного рекомбинатного лимфокина в целях сообщения ему антигенного N-конца, который может быть использован при иммуногенной очистке. Эта публикация относится к патенту США N 4782137, описанному выше.

Smith M.C. и др. J. Biol. Chem. Vol. 263, 15:7211-7215 (1988) раскрывают экспериментальные результаты, подтверждающие гипотезу относительно того, что пептиды, образующие специфические хелатные комплексы с металлами на NH₂-конце небольшого пептида, могут быть использованы для очистки белка с помощью аффинной хроматографии на ионах металлов. В этой работе представлены конкретные данные, относящиеся к примерам в вышеописанном патенте США N 4569794. В частности, использование хелатного комплекса металла с пептидом His-Trp, связанным либо с гормоном высвобождения лютеинизирующего гормона, либо с проинсулином, позволяет осуществлять очистку этого химерного пептида с помощью IMAC, тогда как контрольные молекулы, не содержащие His-Trp-линкер, не могли быть выделены аналогичным способом.

Hochuli E. и др. J. Chromat. 411:177-184 (1987) раскрывают абсорбент на основе нитрилотриуксусной кислоты, используемый для аффинной хроматографии металло-хелатного комплекса. При этом указывается, что раскрываемый абсорбент, заряженный ионом Ni²⁺, может быть использован для связывания пептидов и белков, содержащих соседние гистидиновые остатки.

Ljungquist C. и др. Eur. J.Biochem. 186:563-569 (1989) раскрывают использование пептида Ala-His-Gly-His-Arg-Pro, образующего хелатный комплекс с металлом в ряде колонок, состоящем из двух, четырех и восьми колонок, содержащий иммобилизованные ионы Zn²⁺. Согласно Ljungquist C., использование этого пептида, образующего хелатный комплекс с цинком в колонках, дает неожиданно хорошие результаты при очистке гибридных белков.

Используемые в настоящем описании термины "ненатуральный слитый белок", "ненатуральный слитый полипептид", "слитые полипептиды" и "слитые белки" относятся соответственно к белкам и полипептидам, которые обычно не встречаются в природе и которые включают в себя центральный фрагмент белка и его удлиняющий фрагмент (или удлиняющую часть белка).

Используемые в настоящем описании термины "сердцевина белка", "центральный фрагмент белка" и "полипептидный фрагмент" относятся к области гибридного полипептида, которая расположена у C-конца молекулы и не включает в себя удлиняющую часть и которая является нужным полипептидом и/или биологически активным белком, включая натуральные биологические активные белки и полипептиды, а также их аналоги и мутанты.

Используемый в настоящем описании термин "N-концевой удлиняющий сегмент" относится к первым от N-конца приблизительно 45 аминокислотам, которые не являются частью центральной области белка.

Используемый в настоящем описании термин "пролекарство" относится к гибридным белкам, где нужной частью является биологически активный белок, используемый в качестве лекарственного средства.

Используемые в настоящем описании термины "биологически активный белок" и "биологически активные полипептиды" относятся соответственно к белкам и полипептидам, обладающим биологической активностью.

Используемые в настоящем описании термины "нужный белок" и "желательный белок" относятся к белкам или полипептидам, которые необходимо получить в чистом виде.

Используемый в настоящем описании термин "удлиняющий фрагмент" относится к той части гибридного белка, которая является N-концевым удлиняющим сегментом и которая не является частью биологически нужной области белка.

Используемый в настоящем описании термин "DPP IV-отщепляемая N-концевая удлиняющая часть" относится к удлиняющей части гибридного белка, имеющей аминокислотную последовательность, которая может быть удалена постадийным отщеплением с помощью DPP IV.

В списке последовательностей, представленном в конце настоящего описания, некоторые аминокислотные остатки последовательностей SegID обозначены Xaa. Это обозначение означает следующее.

В SegID N 3 Xaa²⁹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 4 Xaa²⁹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 5 Xaa²⁹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 14 Xaa²⁹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 18 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 19 Xaa³³ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 20 Xaa³⁹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 21 Xaa⁴⁵ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 24 Xaa²⁷ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 25 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 26 Xaa³³ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 27 Xaa³⁵ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 28 Xaa³⁷ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 29 Xaa³³ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 30 Xaa³⁵ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 31 Xaa³⁷ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 32 Xaa³⁹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 33 Xaa⁴⁵ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 34 Xaa⁴³ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 35 Xaa⁴⁵ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 36 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 37 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 38 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 39 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 40 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 41 Xaa³³ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 43 Xaa³¹ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

В SegID N 43 Xaa³³ означает C-терминально амидированный аргининиловый остаток.

Изобретение относится к улучшенным белкам и полипептидам. Согласно настоящему изобретению биологически активные полипептиды сначала получают в виде гибридных белков, содержащих две части: первую часть, которая представляет собой центральную часть белка; и вторую часть, которая представляет собой N-концевой удлиняющий фрагмент, который у своего карбокси-конца является ковалентно связанным с амино-концом первой части. N-концевая удлиняющая часть гибридного полипептида имеет аминокислотную последовательность, которая затем подвергается отщеплению дипептидилпептидазой IV (DPP IV).

Слитой белок настоящего изобретения имеет следующую формулу: Удлиняющая часть - Центральная часть белка где "Удлиняющая часть" представляет собой DPP IV-отщепляемую N-концевую удлиняющую часть"; "-" представляет собой ковалентную пептидную связь; а "центральная часть белка" представляет собой любой нужный белок, который отделяется от "удлиняющей части" в результате процессинга с помощью DPP IV.

Удлиняющий фрагмент имеет аминокислотную последовательность формулы A-X-Y-(X'-Y)_n, где A является необязательным, а если он присутствует, то является метионином; n представляет собой число последовательно связанных X' - Y - групп, количество которых составляет от 0 до 20, а предпочтительно от 0 до 10; X выбирают из группы, включающей в себя все природные аминокислоты; Y выбирают из группы, включающей в себя пролин, аланин, серин и треонин, за исключением того, что если n = 0, то Y выбирают из группы, включающей в себя аланин, серин и треонин; X выбирают из группы, включающей в себя все природные аминокислоты за исключением пролина и гидроксипролина.

Согласно вышеуказанной формуле если n = 1, то имеются два остатка Y. Кроме того, возможно присутствие до двадцати одного остатка Y и двадцати остатков X' в одном варианте осуществления изобретения. Отдельные Y-остатки и X'-остатки могут быть соответственно любыми остатками группы, из которой они выбираются. То есть, все отдельные остатки Y не должны быть одинаковыми в данном варианте осуществления изобретения. Аналогично в каком-либо варианте с более чем одним остатком X': каждый отдельный присутствующий остаток X' может быть любым аминокислотным остатком за исключением пролина и гидроксипролина независимо от того, каким остатком будет другой X'-остаток. Каждый отдельный Y и X' - остаток, соответственно, должен удовлетворять правилам для данной конкретной группы, то есть различные отдельные остатки в конкретных положениях должны подчиняться правилам, определенным выше.

Слитые белки, в которых (A) присутствует в виде метионина (Met), представляют собой последовательности, используемые для продуцирования биологически активных белков в E.coli с помощью техники рекомбинантных ДНК. Met-последовательность, присутствующая в этих предшественниках, обычно процессируется ферментной системой E.coli или каким-либо другим способом, который может быть осуществлен любым специалистом. Синтез белка в E.coli в нормальных условиях начинается с кодона инициации трансляции AUG, кодирующего Met. В результате этого вновь синтезированные полипептиды имеют метиониновый остаток в своей N-концевой аминокислоте. E.coli обладает ферментной активностью, способной к эффективному удалению N-концевого Met, если метиониновый N-концевой остаток является смежным с аминокислотой, имеющей относительно небольшую боковую цепь, такой как Gly, Ala или Ser, а также Pro. Высокоспецифичное удаление N-концевого Met может быть осуществлено путем бромциан-опосредованного отщепления Met. Однако для успешного осуществления этой процедуры необходимо, чтобы N-концевой Met был лишь одним Met во всей последовательности белка; в противном случае отщепление будет происходить после каждого Met в последовательности. В соответствии с этим в гибридных белках, содержащих внутренние Met-последовательности, второй аминокислотой от N-конца должна быть Pro, Gly или Ser, если необходимо, чтобы Met был удален ферментной системой E.coli.

Помимо слитых полипептидов, настоящее изобретение относится к рекомбинантным ДНК-молекулам, содержащим ДНК-последовательности, кодирующие гибридные полипептиды; к способам использования рекомбинантных ДНК-молекул; к способам использования гибридных полипептидов, включая способы очистки нужных полипептидов, и к способам доставки в организм лекарственного средства, которые заключаются во введении пациенту предшественника указанного лекарственного средства, который превращается в биологически активную форму под действием последовательного протеолитического отщепления in vivo N-концевой удлиняющей части.

Продуцирование слитых полипептидов может быть осуществлено с помощью стандартного пептидного синтеза или с помощью техники рекомбинантных ДНК, хорошо известной любому специалисту. Пептидный синтез является предпочтительным способом продуцирования полипептидов, которые состоят приблизительно из 50 аминокислот или менее. Для более крупных молекул предпочтительней проводить продуцирование в хозяйских клетках с использованием техники рекомбинантных ДНК.

Слитые полипептиды, содержащие N-концевые части, которые являются распознаваемыми и отщепляемыми DPP IV, обладают большими преимуществами, чем немодифицированные полипептиды, содержащие только одну центральную часть белка. В настоящем изобретении описываются две области применения указанных полипептидов. Одно из таких применений относится к гибридным полипептидам, так называемым "пролекарствам", которые включают в себя биологически активные полипептиды, представляющие собой нужное лекарственное средство и являющиеся ковалентно связанными с DPP IV - отщепляемыми N-концевыми удлиняющими сегментами. Эти пролекарства, т.е. предшественники лекарственного средства, могут быть превращены в биологически активные формы посредством расщепления DPP IV в организме человека или другого животного, которому было введено указанное пролекарство. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к гибридным полипептидам, используемым в качестве пролекарства; к использованию гибридных полипептидов в изготовлении лекарственных препаратов и к способу доставки биологически активных полипептидов в организм пациента. Вторым применением гибридных полипептидов настоящего изобретения является способ очистки белка, в котором N-концевая удлиняющая часть, являющаяся компонентом полипептида, благодаря своей способности к отщеплению посредством DPP IV способствует эффективной очистке нужного полипептида. В соответствии с этим настоящее изобретение относится к гибридным полипептидам, используемым в процедурах очистки, и к способам очистки нужных полипептидов. Указанные примеры применения настоящего изобретения приведены лишь в целях иллюстрации и не должны рассматриваться как некое ограничение настоящего изобретения.

В двух указанных вариантах применения настоящего изобретения центральная часть белка отделяется от удлиняющей части посредством DPP IV-активности. В том случае, когда гибридные белки используются в способах очистки, нежелательно, чтобы центральная часть белка служила субстратом для DPP IV-расщепления. То есть предпочтительно, чтобы DPP IV не обладала способностью расщеплять центральную часть белка после того, как будет удалена удлиняющая часть. Часто бывает более предпочтительно, в том случае, когда центральная часть белка является субстратом для DPP IV, использовать слитой белок в качестве пролекарства. В этом случае указанный предшественник лекарственного средства может способствовать продолжительному присутствию сердцевины белка в организме, поскольку DPP IV, присутствующая in vivo (например, в плазме, тканях почки и печени), будет использована для процессинга N-концевых удлиняющих участков, и тем самым способствовать задержке разложения центральной части белка. То есть удлиняющая часть гибридного белка может действовать в качестве субстрата для DPP IV и конкурентного ингибитора, замедляющего воздействие DPP IV на центральную часть белка, тем самым одновременно защищая указанную центральную часть белка.

Используемый в настоящем описании термин "пролекарство" означает гибридный белок, содержащий DPP IV-отщепляемую N-концевую удлиняющую часть, ковалентно связанную с центральной частью белка, которая является биологически активным полипептидом, используемым в качестве лекарственного средства. Согласно настоящему изобретению пролекарство может быть введено как отдельная предшествующая форма лекарственного средства либо в сочетании с другими соединениями. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют отдельную форму в качестве пролекарства. В любом случае указанная предшествующая форма лекарственного средства подвергается процессингу посредством природной DPP IV, обычно присутствующей в организме пациента.

Преимущество введения лекарственного препарата, содержащего предшествующую лекарственную форму, заключается в том, что этот препарат способствует задержке активности и/или обеспечивает присутствие в организме биологически активного белка в более продолжительный период времени. Указанный предшественник лекарственного средства может оставаться активным дольше, чем немодифицированные молекулы. Пролекарство может существовать в неактивном состоянии в течение определенного промежутка времени, пока не будет отщеплена удлиняющая часть, после чего молекула становится активной. Следовательно, пролекарство может служить системой доставки лекарственного средства с пролонгированным высвобождением. Кроме того, различные N-концевые удлиняющие сегменты отщепляются с различными скоростями в зависимости от их длины и конкретных остатков, присутствующих в их аминокислотной последовательности. Могут быть также использованы различные формы предшественников лекарственного средства, имеющих различные N-концевые удлиняющие сегменты, которые могут обеспечивать продолжительный постоянный уровень активного лекарственного средства в течение определенного промежутка времени в организме пациента. Следовательно, пролекарство может служить системой доставки лекарственного средства с пролонгированным высвобождением.

Как указывалось выше, DPP IV отщепляет дипептид от N-конца полипептида при условии, что определенные остатки занимают определенные положения. Используемый в настоящем описании термин "положение один" относится к положению аминокислотного остатка в N-конце. Термин "положение два" относится к положению аминокислотного остатка, который является непосредственно смежным с аминокислотным остатком в положении один, т.е. является вторым остатком от N-конца. Термин "положение три" относится к положению аминокислотного остатка, который является непосредственно смежным с аминокислотным остатком в положении два, т.е. третьим остатком от N-конца. Отщепление N-концевого пептида происходит между положением два и положением три при условии, что аминокислота в положении три не является пролином или гидроксипролином, а аминокислота в положении два является одной из следующих пяти аминокислот: пролин (Pro), гидроксипролин (Hyp), аланин (Ala), серин (Ser) или треонин (Thr).

DPP IV отщепляет N-концевые остатки с различной скоростью в зависимости от того, какой из этих четырех аминокислотных остатков присутствует в положении 2. В большинстве случаев наибольшая эффективность расщепления DPP IV достигается, когда во 2-положении находится Pro, а после него наибольшая эффективность достигается, когда положение два занимает Ala. Если положение один занимает тирозин, фенилаланин или гистидин, то DPP IV действует почти с такой же скоростью, как и в случае, когда в положении два находится Pro или Ala. Затем в отношении наибольшей эффективности идет случай, когда положение два занимает Ser. И уже наименее эффективным является случай, когда во 2-положении находится Thr.

С учетом указанной информации может быть сконструирован ряд N-концевых удлиняющих сегментов, которые подвергаются процессингу с различными скоростями. Так, например, может быть введен препарат, который состоит либо из конкретного предшественника лекарственного средства, либо из комбинации предшественников. Эти предшественники с подобранными соответствующим образом N-концевыми удлиняющими сегментами будут, каждый из них, процессироваться со с