Моно-, ди- или трисложные эфиры 2-амино-6-(с1 - с5- алкокси-9-(d-арабинофуранозил)-9н-пурина, способ их получения, применение и фармацевтическая композиция

Моно-, ди- или трисложные эфиры 2-амино-6-(с1 - с5- алкокси-9-(d-арабинофуранозил)-9н-пурина, способ их получения, применение и фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к моно-, ди- или три-сложным эфирам 2-амино-6-(C₁-C₅-алкокси)-9-( -D -арабинофуранозил)-9Н-пурина общей формулы (I) где арабинофуранозильный остаток замещен по 2'-, 3'- или 5'-положениям, а сложные эфиры образованы карбоновыми кислотами, в которых некарбонильная часть выбрана из н-пропила, трет-бутила, н-бутила, метоксиметила, бензила, феноксиметила, фенила, метансульфонила и сукцинила. Соединения формулы (I) получают этерификацией 2-амино-6-метокси-9--D-арабинофуранзил-9Н-пурина в присутствии фермента, при этом имеющаяся гидроксильная группа при необходимости защищена. Описаны также фармацевтические формы, содержащие соединения формулы (I) в эффективном количестве и обладающие противоопухолевым действием. 4 с. и 9 з.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к противоопухолевым и иммунорегулирующим способностям некоторых производных арабинофуранозилпирина.

Сообщено (Blood, 61, 1983, 660; J. Clin. Invest., 74, 1984, 951 и Cancer Research, 45, 1985, 1008), что арабинофуранозилгуанин (ara G) селективно ингибирует рост Т-клеток по сравнению с B-клетками и обладает селективной цитотоксичной активностью по отношению к T-лейкозным клеткам. Ara G незначительно разрушается присутствующей в человеке нуклеозидфосфорилазы пурина (PNP), и он был предложен в качестве предлагаемого химиотерапевтического или иммунодепресного средства.

В Европейской патентной заявке N 294 114 описаны inter alia соединения формулы (I) где R₁ представляет собой C_1-5 алкоксигруппу (например, метокси-) или аминогруппу, которая является моно- или би- замещенной C_1-5-алкилом (например, метилом) и физиологически приемлемыми их производными, для лечения или профилактики вирусных инфекций у человека, вызываемых некоторыми вирусами герпеса. Фармацевтически приемлемые сложные эфиры соединений формулы (I), как утверждают, являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают высокие уровни соединения формулы (I) после перорального введения.

Теперь обнаружено, что соединения формулы (I), где R¹ представляет собой C_1-5-алкоксигруппу, и фармацевтически приемлемые их сложные эфиры, являются полезными в качестве противоопухолевых средств и, в частности являются полезными при лечении нарушений роста T-лимфатических клеток. Таким образом, они являются полезными для лечения лимфоцитарного лейкоза, злокачественной лимфомы, заболеваний аутоиммунитета (например, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, системная красная волчанка и тип I или инсулинозависимый сахарный диабет) и в качестве иммунорегуляторов.

Соответственно изобретением является использование соединения формулы (I), где R¹ представляет собой C_1-5-алкоксигруппу, или фармацевтически приемлемого его сложного эфира при производстве лекарств для лечения опухолей.

В другом аспекте настоящим изобретением является способ для регулирования роста опухолей у млекопитающих, который включает введение в млекопитающего эффективного количества соединения формулы (I), в которой R¹ представляет собой C_1-5-алкоксигруппу, или фармацевтически приемлемого его сложного эфира.

В качестве R¹ подходит метокси- или этокси-, но предпочтительной является метоксигруппа.

В другом аспекте изобретением являются новые фармацевтически приемлемые сложные эфиры соединений формулы (I), где R¹ представляет собой C_1-5-алкоксигруппу.

Фармацевтически приемлемые сложные эфиры вышеуказанных соединений являются практически более предпочтительными, поскольку они способны обеспечить высокие уровни ara G в плазме реципиента после перорального введения.

Обнаружено, что соединения по изобретению ферментативно превращаются в ara G в реципиенте. То что ara G и имеет ограниченную растворимость в воде, делая парентеральное введение непрактичным, а также обеспечивая низкую биологическую ценность после перорального применения в приматах, делает использование соединения по изобретению преимущественным для лечения вышеупомянутых нарушений и болезней.

Предпочтительные производные соединений по изобретению включают моно-, ди- или тризамещенные сложные эфиры арабиносахарного остатка, замещенные в позициях 2'-, 3'- и 5'- указанного остатка.

Такие предпочтительные сложные эфиры включают сложные эфиры карбоновой кислоту в которых некарбонильную часть эфирной группы выбирают из прямоцепной или разветвленноцепной группы: алкильной (например, n-пропил, t-бутил), алкоксиалкильной (например, метоксиметил), аралкильной (например, бензил), арилоксиалкильной (например, феноксиметил), арильной (например, фенил) необязательно замещенными галогеном, (C_1-4-алкилом или C_1-4-алкокси, нитро- или аминогруппой; сложные эфиры в виде сульфонатов, таких как алкилсульфонил; или алкиларилсульфонил (например, метансульфонил или тозилсульфонил); сложные эфиры дикарбоновых кислот (например, сукцинил) или их C_1-4-алкильные сложные эфиры; сложные эфиры аминокислот (например, L-валил); и сложные эфиры в виде моно-, ди- или трифосфатов. Фармацевтически приемлемые соли этих сложных эфиров включают соли натрия, калия, NR₄, где R=H или (C_1-6-алкил, галиды и кислотно-аддитивные соли. В вышеуказанных сложноэфирных группах алкильные группы (включая их и в алкоксигруппах) содержат от 1 до 12 атомов углерода, а предпочтительной арильной группой является фенильная группа.

Предпочтительные сложные эфиры по изобретению включают: 1) 2-амино-6-метокси-9-(5-О-пропионил- -D- арабинофуранозил)- -пурин; 2) 2-амино-9-(5-О-бутирил- -D- арабинофуранозил)-6-метокси- -пурин; 3) 2-амино-6-метокси-9-(3-О-пивалоил- -D-арабинофуранозил)- -пурин; 4) 2-амино-6-метокси- 9-(2-О-валерил- -D-арабинофуранозил)- -пурин; 5) 2-амино-9-(3-О- бензоил- -D-арабинофуранозил)-6-метокси- -пурин; 6) 2-амино-6-метокси-9-(2-О-пивалоил- -D-арабинофуранозил)- -пурин; 7) 2-амино-9-(2-О-бензоил- -D-арабинофуранозил)-6-метокси- -пурин; 8) 2-амино-6-метокси-9-(5-О-валерил- -D-арабинофуранозил)- - пурин; 9) (5-О-ацетил- -D-арабинофуранозил)-2-амино-6-метокси- 9- -пурин; 10) 2-амино-6-метокси-9-(5-О-(4-метокси-4-оксобутирил)- -D-арабинофуранозил)- -пурин; 11) 9-(3,5-ди-О-ацетил- -D-арабинофуранозил)-2-амино-6-метокси- -пурин; 12) 9-(2,5-ди-О-ацетил- -D-арабинофуранозил)-2-амино-6-метокси- - пурин; 13) 9-(2-О-асетил- -D-арабинофуранозил)-2-амино-6-метокси- -пурин; 14) 9-(2,3,5-три-О-ацетил- -D-арабинофуранозил)- 2-амино-6-метокси-9Н-пурин; 15) 2-амино-9-(5-О-изобутирил- -D- арабинофуранозил)-6-метокси-9Н-пурин; 16) 9-(2,3-ди-О-ацетил- -D-арабинофуранозил)-2-амино-6-метокси-9H-пурин.

3,5-ди-О-Ацетил сложный эфир (соединение 11), 5-О-(4-метокси-4-оксобутирил) сложный эфир (соединение 10) и 5-О-ацетил сложный эфир (соединение 9) являются особенно предпочтительными сложными эфирами.

Соединения по изобретению являются эффективными ara G пролекарствами, эффективного ингибитора роста Т-клеток. В изобретении поэтому сообщают способ ингибирования репликации и/или функционирования Т-клеток путем введения эффективного количества соединения по настоящему изобретению.

Влияние на рост опухоли с помощью соединения по настоящему изобретению может включать введение одного только соединения или соединения вместе с другими лекарствами в качестве подготовительного режима, предназначенного для того, чтобы удаление костного мозга предшествовало аутогенной или аллогенной пересадке костного мозга при лейкозе, лимфоме, миеломе или других злокачественностях, например, способом, аналогичным введению больших доз бусульфана и циклофосфамида перед пересадкой костного мозга при лейкозе (Santos G.W., Bone Marrow Transplant, 1989 Jan; 4 suppl. 1, 236-9).

Соединения по настоящему изобретению можно также использовать для обработки крови или костного мозга ex vivo для удаления злокачественных клеток способом, аналогичным описанному для случая 4- оксипероксициклофосфамида (Ягер А.М. с сотр.: Yeager, A.M. et al., N. Engl. J. Med., July 17 1986, 315 (3), 141-7).

Т-клетки находятся в ревматоидных суставах и могут вносить вклад в воспалительный процесс. Около 1% всего населения (женщин на 2/3 больше чем мужчин) подвержены ревматоидному артриту, и от 5 до 10% больных ревматоидным артритом теряют трудоспособность из-за болезненных глотательных суставов несмотря на полный курс лечения. Соединение по настоящему изобретению можно использовать для лечения ревматоидного артрита.

Также утверждают, что Т-клетки участвуют в мышечной дистрофии; настоящее изобретение поэтому применяют при использовании соединения по настоящему изобретению при лечении мышечной дистрофии.

Соединения формулы (I), где R¹ представляет собой C_1-5- алкоксигруппу, и фармацевтически приемлемые их сложные эфиры (к которым будем ссылаться как к активным ингредиентам) можно вводить любым подходящим для лечения данного состояния способом, причем подходящими способами введения являются пероральное, назальное, местное (включая трансбуккальное и подъязычное) вагинальное и парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, внутриоболочечное и эпидуральное). Следует понимать, что предпочтительный способ введения будет зависеть, например, от состояния реципиента.

Для каждого из вышеуказанных нарушений, болезней и показаний требуемое количество активного ингредиента (как определено выше) будет зависеть от ряда факторов, включая обостренность состояния, которое следует лечить, и личности реципиента, и будет в конечном счете в описании лечащего врача. Вообще, тем не менее, для каждого из этих использований и показаний подходящая эффективная доза будет в диапазоне от 0,1 до 250,0 мг на 1 кг веса тела реципиенту в день, предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 100,0 мг на 1 кг веса тела в день и более предпочтительно в диапазоне от 1 до 20 мг на 1 кг веса тела в день; оптимальной дозой является доза между 5 и 15 мг на 1 кг веса тела в день (если не оговорено специально, то все веса активного ингредиента вычислены по отношению к первичному соединению формулы (I); для его солей и сложных эфиров цифры возрастут пропорционально). Нужная доза предпочтительно представляет одну, две, три, четыре или более поддозы, вводимых через подходящие интервалы времени в течение дня или недели. Эти поддозы можно вводить в форме единичной дозы, например, содержащей от 5 до 1000 мг, предпочтительно от 20 до 500 мг и более предпочтительно от 100 до 400 мг активного ингредиента на одну дозовую форму.

Следует понимать, что для процесса, который влияет на функцию Т- клеток, что требуется для лечения аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидного артрита), величина доз будет обычно в нижней части вышеуказанного диапазона доз.

Хотя возможно введение одних активных ингредиентов, предпочтительным является представление их в виде фармацевтических форм. Эти формы по настоящему изобретению включают по крайней мере один активный ингредиент, как определено выше, вместе с одним или более подходящими их носителями и необязательно с другими терапевтическими ингредиентами. Носитель (носители) должны быть "приемлемыми" в смысле быть совместимыми с другими ингредиентами формы и не ухудшать их свойства для реципиента.

Лекарственные смеси включают формы, подходящие для перорального, назального, местного (включая трансбуккальное и подъязычное), вагинальное или парентеральное (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикожное, внутриоболочечное и эпидуральное) введения. Лекарственные формы удобно представлять в виде единичных доз и их можно приготавливать любым хорошо известным в области фармакологии методом. Такие методы включают этап соединения активного ингредиента и носителя, который состоит из одного или более вспомогательных ингредиентов. Вообще лекарственные формы получают однородным и основательным связыванием активного ингредиента и жидких носителей или полностью разделенных твердых носителей, или тех и других, и затем, если нужно, формовкой продукта.

Лекарственные формы по настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, можно представлять в виде дискретных единиц, таких как капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, которые содержат определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул, в виде растворов или суспензий в водных или неводных растворах, или в виде жидких эмульсий типа масло в воде или вода в масле. Активные ингредиенты можно также представлять в виде болюсов, электуариев или паст.

Таблетку можно изготовить путем сжатия или формовки, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Сжатые таблетки можно приготовить путем сдавливания в подходящем устройстве активного ингредиента, находящегося в легко сжимаемой форме, такой как порошок, гранулы, необязательно в смеси со связывающим веществом (например, повидоном, желатином, оксипропилметилцеллюлозой), смазкой, инертным растворителем, консервантом, дезинтегрирующим средством (например, натрий-крахмалгликолят, поперечносшитый повидон, поперечносшитая натрий- карбоксиметилцеллюлоза), с поверхностно активным или дисперсным средством. Формованные таблетки можно получить путем формовки в подходящем устройстве смеси соединения в виде порошка, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки можно необязательно покрывать оболочкой или снабжать ядром и приготавливать так, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение активного ингредиента при использовании, например, добавлять оксипропилметилцеллюлозу в различных пропорциях для получения желаемой скорости высвобождения лекарства.

Для лечения внешних тканей, например, рта или кожи, лекарственные формы предпочтительно применять в виде местной мази или крема, содержащих активный ингредиент в количестве, например, от 0,075 до 20 вес.%, предпочтительно от 0,2 до 15 вес.% и более предпочтительно от 0,5 до 10 вес.%. В случае приготовления в виде мази активный ингредиент можно применять либо с парафиновым, либо со смешивающимся в воде основанием. Альтернативно, активные ингредиенты можно приготавливать на основе типа масло в воде.

Если нужно, водная фаза крема может включать, например, по крайней мере 30 вес. % многоатомного спирта, т.е. спирта, имеющего две или более гидроксильные группы, такого как пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, маннитол, сорбитол, глицерол и полиэтиленгликоль и их смесь. Лекарственные формы для местного применения могут желательно включать соединение, которое увеличивает поглощение или проникновение активного ингредиента через кожу или другие подвергаемые обработке области. Примеры подобных соединений, увеличивающих проникновение через кожу, включают диметилсульфоксид и тому подобные аналоги.

Маслянистую фазу эмульсий по изобретению можно составлять из известных ингредиентов известными способами. В то время как такая фаза может включать один только эмульгатор (или эмульгент), желательно все- таки, чтобы она включала смесь по крайней мере одного эмульгатора с жиром или маслом, или и с тем, и с другим. Предпочтительно, чтобы гидрофильный эмульгатор включался в состав совместно с липофильным эмульгатором, который действует в качестве стабилизатора. Также предпочтительно включать и масло, и жир. Вместе с этим эмульгатор (эмульгаторы) совместно или без стабилизатора (стабилизаторов) образует так называемый эмульсионный воск, и воск вместе с маслом и/или жиром образует так называемую эмульсионную основу мази, которая является маслянистой дисперсной фазой кремовых лекарственных форм.

Эмульгенты и эмульсионные стабилизаторы, подходящие для использования в лекарственных формах по настоящему изобретению, включают Tween 60, Span 80, цитостеариловый спирт, миристиловый спирт, глицерил-моностеарат и натрий-лаурил сульфат.

Выбор подходящих масел и жиров для лекарственных форм основан на достижении желательных косметических свойств, поскольку растворимость активного соединения в большинстве масел, которые вероятно применяют в фармацевтических эмульсионных препаратах, очень низка. Таким образом, крем должен предпочтительно быть обезжиренным, не оставляющим пятен и смываемым веществом, в подходящем состоянии для избежания утечки из ампул или других контейнеров. Можно использовать прямоцепные или разветвленноцепные, моно- или диосновные алкиловые сложные эфиры, такие как ди-изоадипат, изоцетилстеарат, пропиленгликолевый диэфир жирных кислот, изопропилмиристат, децилолеат, изопропилпалмитат, бутилстеарат, 2-этилгексилпалмитат или сложные эфиры со смешанными или разветвленными цепями, известные как Crodamol CAP, причем три последних эфира являются предпочтительными. Их можно использовать как в отдельности, так и совместно в зависимости от требуемых свойств. Альтернативно, можно использовать липиды с высокой температурой плавления, такие как белый мягкий парафин и/или жидкий парафин или другие минеральные масла.

Лекарственные формы, подходящие для местного применения в ротовой полости, включают таблетки, содержащие активный ингредиент с ароматизированной основой, обычно сахарозой и акацией или трагакантом; таблетки, содержащие активный ингредиент в инертном основании, таком как желатин и глицерин, или сахароза и акация; и жидкости для полоскания рта, содержащие активный ингредиент в подходящем жидком носителе.

Лекарственные формы для ректального введения могут представлять собой суппозитории с подходящим основанием, содержащим, например, масло-какао или салицилат.

Лекарственные формы, подходящие для назального введения, в которых носитель представляет собой твердую фазу, включают неизмельченный порошок, имеющий размер частиц, например, в диапазоне от 20 до 500 мкм, который вводят путем вдыхания, т.е. путем быстрой ингаляции через носовой проход порошка, находящегося в контейнере, подносимого близко к носу. Подходящие лекарственные формы, в которых носитель представляет собой жидкость, в виде, например, распрыскивателя или носовых капель, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.

Лекарственные формы, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или распрыскивателей, содержащих кроме активного ингредиента такие носители, которые, как известно в области фармакологии, являются подходящими.

Лекарственные формы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические соединения и вещества, придающие данной лекарственной форме изотоническую совместимость с кровью реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие средства и свертывающие средства. Лекарственные формы можно представлять в виде единичных доз или контейнеров, содержащих несколько доз, например, запечатанные ампулы или пробирки, и могут храниться в замороженном сухом (лиофилизированном) состоянии, требующем только непосредственно перед использованием для инъекций добавления стерильного жидкого носителя, например, воды. Неподготовленные растворы для инъекций и суспензии можно получить из стерильного порошка, гранул и таблеток, имеющих вышеописанный вид.

Предпочтительными единичными дозами лекарственных форм являются дозы, содержащие слабую дозу, дневную дозу или единичную дневную поддозу, как рассмотрено выше, или подходящую их часть, активного ингредиента.

Следует понимать, что кроме ингредиентов, частично упомянутых выше, лекарственные формы по этому изобретению могут включать другие средства, обычно применяемые в фармакологии, имеющих отношение к данному типу лекарственных форм, например, средства, подходящие для перорального введения, могут включать ароматизирующие вещества.

Изобретение также дает способ получения фармацевтически приемлемых сложных эфиров соединения формулы (I), в которой R¹ представляет собой C_1-5-алкоксигруппу, включающий эстерификацию соединения формулы (I). Такая эстерификация может иметь место при контактировании соединения формулы (I), в которой незащищенную гидроксигруппу эстерифицируют с помощью ацилирующего средства, обычно ацилгалидом или ангидридом, при неэкстремальной температуре от -30 до +100^oC и более подходяще при температуре от -5 до +30^oC, в полярном растворителе, обычно в ацетонитриле, в присутствии основания, например, триэтиламина, и затем путем удаления защищающих групп обычными способами.

Альтернативно сложные эфиры можно получать путем ферментной эстерификации, например, используя соответствующий трихлорэтиловый эфир и субтилизин в качестве инициатора реакции. Реакцию лучше проводить в растворе с основными свойствами, таком как пиридин, при неэкстремальной температуре, обычно между 10 и 50^oC. Реакцию прекращают путем отфильтровывания фермента и удаления растворителя.

Соединения формулы (I) можно получать способом, описанным в Европейской патентной заявке N 294114 (где R¹ представляет собой C_1-5-алкокси).

Следующие примеры служат для иллюстрации получения сложных эфиров соединений формулы (I) и лекарственных форм, содержащих их.

Пример 1. Ферментативное получение сложных эфиров по настоящему изобретению.

а) 2-Амино-6-метокси-9-(5-О-пропионил- -D- арабинофуранозил)-9Н-пурин. 2-Амино-6-метокси-9-( -D- арабинофуранозил)-9Н-пурин (1,0 г, 3,3 мкмоль) (приготовленный, как описано в Европейской патентной заявке N 294114) суспендировали в 40 мл пиридина, содержащего 300 мкл воды и 2 мл трихлорэтилпропионата (трихлорэтилпропионат синтезировали путем добавления 19 мл пропионилхлорида (Aldrich) в течение 30 мин к 19,1 мл трихлорэтанолу (Aldrich) в 40 мл пиридина при 0^oC). Продукт очищали путем тщательного промывания 2 х 100 мл частями воды, 5% NaHCO₃ и H₂O.

¹H-ЯМР (200 МГц) CDCl₃: 4,74 (s, 2H, Cl₃CH₂); 2,49 (q, 2H, J = 7,6 Гц, CH₃CH₂CO₂); 1,21 (t, 3H, J = 7,6 Гц, CH₃CH₂CO₂).

Реакцию инициировали с помощью 0,100 г субтилизина (корпорации Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, P-5380, лот N 38F - 0356), который был активирован путем растворения 1 г фермента в 20 мл 0,1 моль/л раствора фосфата калия при pH 7,8 и лиофилизировали до сухости. После размешивания в течение 23 ч при 40^oC реакцию прекращали путем отфильтровывания фермента и удаляли растворитель в условиях вакуума. Неочищенный продукт очищали с помощью хроматографии на силикагельной колонке размером 4,5 х 25 см с CH₂Cl₂:CH₃OH (9:1) в качестве элюента. Получившуюся фракцию отстаивали и лиофилизировали от воды с получением 0,76 г нужного продукта в виде белого порошка: т.пл. 124^oC; TLC (значение для тонкослойной хроматографии) R_f = 0,43 (силикагель; CH₂Cl₂: CH₃OH (9:1): УФ _макс ( , (ммоль/л)^-1см^-1) при pH 7,0, 278 нм (9,5).

¹H-ЯМР (200 МГц, DMSO-d₆): 7,83 (s, 1H, H₈, 6,44 (s, 2H, 2-NH₂); 6,14 (s, 1H, H₁); 5,75 (d, 1H, J = 4,3 Гц, 2'-OH); 5,65 (d, 1H, J = 3,5 Гц, 3'-OH); 4,28 (m, 2H, H₂ и H₃); 4,08 (m, 2H, H₅); 3,95 (s, 3H, -OCH₃); 3,91 (m, 1H, H₄'); 2,32 (q, 2H, J = 7,6 Гц, CH₂ H₂CO_2-); 1,01 (t, 3H, J = 7,5 Гц, H₃CH₂CO_2-); MC (ci) 354 (M+I), 280 (M-C₂H₅CO₂).

Аналитический расчет для C₁₄H₁₉N₅O₆0,46H₂O: рассчитано: C 46,49; H 5,55; N 19,36; найдено: C 46,46; H 5,52; N 19,45.

b) 9-(5-О-Ацетил- -D-арабинофуранозил)-2-амино-6-метокси-9Н-пурин.

2-Амино-6-метокси-9- -D-арабинофуранозил-9Н-пурин (1,0 г, 3,3 ммоль) суспендировали в 40 мл пиридина, который содержал 300 мкл воды и 1 мл трихлорэтилацетата (трихлорэтилацетат синтезировали следующим образом: 2,2,2-трихлорэтанол (19,1 мл, 197,1 ммоль) и сухой пиридин (40 мл) помещали в трехгорловую с круглым дном колбу, снабженную краном для впускания аргона, термометром, капельной воронкой, магнитной мешалкой и ванночкой со льдом (H₂O). Ацетилхлорид (14,5 мл, 199,8 ммоль) помещали в капельную воронку и добавляли в течение 10 мин, поддерживая температуру ниже 25^oC и размешивая в атмосфере аргона. Получившийся продукт промывали водой (2 х 100 мл), 5% NaHCO₃ (2 х 100 мл) и H₂O (2 х 100 мл). Органический слой высушивали над MgSO, затем отфильтровывали через ватмановскую бумагу N 1 и дистиллировали в условиях вакуума. Средний срез весом 5,18 г представлял собой требуемое вещество, загрязненное небольшим количеством уксусной кислоты.

¹H-ЯМР (CDCl₃): 4,73 (s, 2H, CH₂O); 2,20 (s, 3H, CH₃CO); MC (Cl, CH₄); m/z 197 (M+H, C₄H₅O₂³⁷Cl₃); 195 (M+H, C₄H₅O₂³⁷Cl₂); 193 (M+H, C₄H₅O₂O³⁵Cl₂³⁷Cl); 191 (M+H, C₄H₅O₂³⁵Cl₃); 159 (195-HCl, C₄H₄O₂³⁷Cl₂); 157 (193-HCl, C₄H₄O₂³⁷Cl³⁵Cl); 155 (191-HCl, C₄H₄O₂³⁵Cl₂); (E1): m/z 195 (M+H); 193 (M+H); 191 (M+H); 157 (193-HCl); 155 (191-HCl).

Анализ для C₄H₅Cl₃O₂ + 0,054 моль CH₃COOH: C 25,35; H 2,70; Cl 54,62.

Найдено: C 25,57; H 2,72; Cl 54,66.

Реакцию инициировали 0,050 г субтилизина (компании Sigma Chemical Co., St. , Mo, P-5380, лот N 38F-0356), который был перед этим активирован путем растворения 1 г фермента в 20 мл 0,1 моль/л раствора фосфата калия с pH 7,8 и лиофилизацией до сухости. После размешивания в течение 23 ч при 40^oC добавляли к реакционной смеси дополнительных 50 мг субтилизина и 2 мл трихлорэтилацетата. После размешивания при 40^oC в течение дополнительных 24 ч реакцию прерывали путем отфильтровывания фермента, и растворитель удаляли в условиях вакуума. Неочищенный продукт очищали хроматографически на силикагельной колонке размером 4,5 х 25 см с CH₂Cl₂:CH₃OH (9:1) в качестве элюента. Получившиеся фракции отстаивали и лиофилизировали из воды с получением 0,28 г нужного продукта в виде белого порошка. TLC R_f = 0,35 (силикагель; CH₂Cl₂: CH₃OH (9: 1)); УФ _макс ( , (ммоль/л)^-1см^-1) при pH 7,0, 279 нм (8,8).

¹H-ЯМР (200 МГц, DMSO-d₆): 7,83 (s, 1H, H₈); 6,45 (s, 2H, 2-NH₂); 6,14 (d, 1H, J = 3,7 Гц, H₁); 5,75 (d, 1H, J = 4,5 Гц, 2'-OH); 5,65 (d, 1H, J = 3,7 Гц, 3'-OH); 4,26 (m, 2H, H₂ и H₃); 4,07 (m, 2H, H₅); 3,94 (s, 3H, -OCH₃); 3,92 (m, 1H, H₄); 2,01 (s, 3H, CH₃CO_2-); MC (Cl) 340 (M+I); 280 (M-CH₃CO₂).

Аналитический расчет для C₁₄H₁₉N₅O₆0,52H₂O: рассчитано: C 44,77; H 5,22; N 20,12; найдено: C 44,79; H 5,21; N 20,09.

Следующие соединения были получены аналогичным способом, исходя из соответствующего трихлорэтилового эфира.

c) 2-Амино-9-(5-О-бутирил- -D-арабинофуранозил)-6-метокси-9Н-пурин.

¹H-ЯМР (200 МГц, DMSO-d₆): 7,83 (s, 1H, H₈); 6,46 (s, 2H, 2-NH₂); 6,14 (d, 1H, J = 3,9 Гц, H₁); 5,76 (d, 1H, J = 4,3 Гц, 2'-OH); 5,66 (d, 1H, J = 3,7 Гц, 3'-OH); 4,28 (m, 2H, H₂ и H₃); 4,07 (m, 2H, H₅); 3,94 (s, 3H, -OCH₃); 3,91 (m, 1H, H₄); 2,28 (t, 2H, J = 7,2 Гц, CH₃CH₂CH₂CO_2-); 1,52 (секстет, 2H, J = 7,4 Гц, CH₃ H₂CH₂CO_2-); 0,85 (t, 3H, J = 7,3 Гц, H₃CH₂CH₂CO_2-); MC (ci) 368 (M+I).

d) 2-Амино-6-метокси-9-(5-О-валерил- -D-арабинофуранозил)-9Н-пурин.

¹H-ЯМР (200 МГц, DMSO-d₆): 7,83 (s, 1H, H₈); 6,46 (s, 2H, 2-NH₂); 6,15 (d, 1H, J = 3,7 Гц, H₁); 5,76 (d, 1H, J = 4,2 Гц, 2'-OH); 5,65 (d, 1H, J = 3,5 Гц, 3'-OH); 4,28 (m, 2H, H₂' и H₃'); 4,08 (m, 2H, H₅); 3,94 (s, 3H, -OCH₃); 3,92 (m, 1H, H₄); 2,29 (t, 2H, J = 7,1 Гц, CH₃CH₂CH₂C CO_2-); 1,49 (m, 2H, CH₃C CH₂CH₂CO_2-); 1,28 (m, 2H, CH₃C CH₂CH₂CO_2-); 0,83 (t, 3Н, J = 7,2 Гц, C CH₂CH₂CH₂CO_2-).

e) 2-Амино-6-метокси-9-(5-О-(4-метокси-4-оксобутирил)- -D- арабинофуранозил)-9Н-пурин (в качестве исходного вещества - трихлорэтилметилсукцинат).

¹H-ЯМР (200 МГц, DMSO-d₆): 7,83 (s, 1H, H₈); 6,45 (s, 2H, 2-NH₂) 6,15 (d, 1H, J = 3,7 Гц, H₁); 5,75 (d, 1H, J = 4,3 Гц, 2'-OH); 5,65 (d, 1H, J = 3,7 Гц, 3'-OH); 4,28 (m, 2H, H₂' и H₃'); 4,08 (m, 2H, H₅'); 3,95 (s, 3H, -OCH₃); 3,91 (m, 1H, H₄'); 3,51 (s, 3H, CH₃CO(O)-): 2,56 (s, 4H, -OC(O)CH₂CH₂C(O)O-); MC (Cl) 412 (M+I); 280 (M-C₅H₇O₄).

Аналитический расчет для C₁₆H₂₁N₅O₈0,40 H₂O: рассчитано: C 45,64; H 5,28; N 16,63; найдено: C 45,62; H 5,21; N 16,67.

Пример 2. Химический синтез сложных эфиров настоящего изобретения.

a(i) 2-Амино-9-(2,5-ди-О-трет-бутилдиметилсилил- -D-арабинофуранозил)-6- метокси-9Н-пурин. 2-Амино-9-( - -D-арабинофуранозил)-6-метокси-9Н-пурин (10 г, 34 ммоль) добавляли в 500 мл круглодонную колбу и высушивали путем совместного выпаривания с пиридином (2 х 50 мл). Добавляли имидазол (11 г, 74 ммоль). Колбу продували аргоном и закрывали перегородкой. Добавляли сухой диметилформамид (ДМФ, 40 мл) и раствор размешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Тонкослойная хроматография на силикагельной колонке с ацетон : CHCl₃ (1:10) выявила, что осталось около 20% исходного вещества (R_f = 0,05) и что появились три сильных особенности R_f при 0,18, 0,41 и 0,75. Добавляли дополнительно трет-бутилдиметилсилилхлорид (1,0 г, 6,6 ммоль), смесь продолжали размешивать в течение 24 ч. Последующая тонкослойная хроматография в том же растворителе показала, что все исходное вещество было израсходовано.

Затем при пониженном давлении удаляли ДМФ, остаток разделяли между этилацетатом (350 мл) и H₂O (100 мл и 3 х 50 мл). Этилацетатом (100 мл) обратно экстрагировали водные слои, объединенные органические слои высушивали (MgSO₄), фильтровали и концентрировали. Неочищенный продукт очищали на силикагельной флеш-колонке (5 х 25 см), элюировали пошаговым градиентом ацетона в CHCl₃ (от 1:20 до 1:2). Три получаемые фракции соответствовали трем особенностям, наблюдаемым с помощью тонкослойной хроматографии. Фракция с R_f = 0,18 давала 4,0 г (23%) белого вещества в твердой фазе, идентифицированного как 2,5-дисилилированное вещество: т. пл. 180-182^oC (неисправленная); УФ _макс (95% EtOH): 248 нм и 280,8 нм; MC (E1): m/z 468 (C₁₉H₃₄N₅O₅Si₂); 450 (C₁₉H₃₂N₅O₄Si₂); 336 (C₁₃H₁₈N₅O₄Si); 322 (C₁₄H₂₄N₅O₂Si); 264 (C₁₀H₁₄N₅O₂Si); 222 (C₈H₈N₅O₃); 208 (C₈H₁₀N₅O₂); 194 (C₇H₈N₅O₂); 166 (C₆H₈N₅O); 133 (C₆H₁₇OSi); 115 (C₆H₁₅Si); 57 (C₄H₉).

¹H-ЯМР (CDCl₃): 7,87 (s, 1H, H-8); 6,29 (d, 1H, H-1', J = 4,6 Гц); 4,82 (br s, 2H, NH₂); 4,39-4,34 (m, 2H, H-2' и 3'); 4,07 (s, 3H, -OCH₃); 3,94-3,82 (m, 3H, H-4' и 5'); 2,40 (br s, 1H, 3'-OH); 0,91 (s, 9H, (CH₃)₃CSi); 0,71 (s, 9H, (CH₃)₃CSi); 0,09 (s, 6H, (CH₃)₂Si); -0,02 (s, 3H, (CH₃)Si); -0,24 (s, 3H, (CH₃)Si).

Аналитический расчет для C₂₃H₄₃N₅O₅Si₂: рассчитано: C 52,54; H 8,24; N 13,32; найдено: C 52,28; H 8,20; N 13,17.

a(ii) 2-Амино-9-(2,5-ди-О-трет-бутилдиметилсилил-3-О-пивалоил- -D-арабинофуранозил)-6-метокси-9Н-пурин.

2-Амино-9-[(2,5-ди-О-трет-бутилдиметилсилил)- -D-арабинофуранозил] - 6-метокси-9Н-пурин (2,5 г, 3,8 ммоль) отвешивали в прокаленную высушенную 250 мл круглодонную колбу. Добавляли 4-N,N-диметиламинопиридин (0,05 г, 0,4 ммоль), колбу продували аргоном и закрывали перегородкой. К реакционной смеси добавляли сухого ацетонитрила (50 мл), триэтиламина (8,0 мл) и пивалинового ангидрида (3 мл, 14,8 ммоль). После 158 ч реакционную смесь концентрировали, остаток смешивали с этилацетатом (250 мл) и экстрагировали водой (3 х 50 мл). Этилацетат высушивали (MgSO₄), фильтровали и концентрировали с получением 3,8 г желтого масла, 300 г этого вещества очищали на хроматотроне (Chromatotron, Harrison Scientific), снабженном 4-мм силикагельным ротором, элюируемого с помощью смеси ацетон:CHCl₃ (1 : 10). Продукт выделяли в виде прозрачной смолы (0,176 г).

MC (E1): m/z 609 (C₂₈H₅₁N₅O₆Si₂); 594 (C₂₇H₄₈N₅O₅Si₂); 552 (C₂₄H₄₂N₅O₆Si₂); 450 (C₁₉H₃₂N₅O₄Si₂); 322 (C₁₄H₂₄N₅O₂Si); 314 (C₁₆H₃₀O₄Si); 194 (C₇H₈N₅O₂); 166 (C₆H₈N₅O); 57 (C₄H₉).

¹H-ЯМР (CDCl₃): 7,93 (s, 1H, H-8); 6,25 (d, 1H, H-1', J = 3,8 Гц); 5,28 (d, 1H, H-3', J = 2,2 Гц); 5,05 (br 3, 2H, NH₂); 4,30 (dd, 1H, H-2', J_2',3' = 1,8 Гц); 4,10 (s, 3H, -OCH₃); 4,04 (dt, 1H, H-4', J = 2,5 Гц, J = 5,9 Гц); 3,19 (d, 2H, H-5', J = 5,5 Гц); 1,27 (s, 9H, -OCOC(CH₃)₃); 0,75 (s, 9H, CSi(CH₃)₃); 0,09 (s, 6H, -Si(CH₃)₂); 0,02 (s, 3H, Si(CH₃)); -033 (s, 3H, Si(CH₃)).

Аналитический расчет для C₂₈H₅₁N₅O₆Si₂ 0,75 C₃H₆O0,05 CHCl₃: рассчитано: C 55,19; H 8,49; N 10,62; найдено: C 55,32; H 8,61; N 10,53.

b) 2-Амино-6-метокси-9-(3-О-пивалоил- -D- арабинофуранозил)-9Н-пурин.

2-Амино-6-метокси-9-[(3-О-пивалоил-2,5-ди-О-трет- бутил-диметисилил)- -D-арабинофуранозил] -9Н-пурин (2,1 г, 3,4 ммоль) брали с ТГФ (40 мл) и охлаждали в ванночке со льдом до 5^oC. Добавляли H₂O (2 мл) и затем фторид тетрабутиламмония (TBAF) в виде 1 моль/л раствора в ТГФ (10 мл, 10 ммоль/л). После выдержки в течение 2 ч при 5^oC добавляли дополнительно 10 мл TBAF. После 2 ч реакционную смесь еще дополнительно обрабатывали 5 мл TBAF и продолжали размешивать в течение еще 18 ч. Затем реакционную смесь разбавляли CHCl₃ (40 мл) и пропускали через слой силикагеля (с зернистостью 230-400, размером 5 х 5 см) с раствором 1 : 1 ацетон : CHCl₃ (500 мл). Фильтрат концентрировали и добавляли к силикагельной колонке (с зернистостью 230-400, размером 5 х 18 см). Колонку элюировали с помощью пошагового градиента ацетона с CHCl₃ (от 1 : 10 до 1 : 1, ацетон : CHCl₃). Из колонки получены две основные фракции, соответствующие веществам с R_f = 0,74 и 0,50 при отношении ацетон : CHCl₃, равным 1 : 1. Вещество с более низким значением R_f выделяли в виде белого порошка весом 0,77 г (53%) и, как показано, оно представляло собой нужную производную 3'-О-пивалоила: т.пл. 241-243^oC (неисправленная); УФ _макс ( ): pH 7,00: 278,9 нм (8700) и 247,7 нм (8900); 0,1 н. раствор HCl: 287,0 (8600) и 243,7 (6800); 0,1 н. раствор NaOH: 279,2 (8900) и 247,7 (8200); MC (E1): m/z 381 (M, C₁₆H₂₃N₅O₆); 366 (C₁₅H₂₀N₅O₆); 296 (C₁₁H₁₄N₅O₅); 280 (C₁₁H₁₄N₅O₄); 250 (C₁₀H₁₂N₅O₃); 232 (C₁₀H₁₀N₅O₂); 208 (C₈H₁₀N₅O₂); 194 (C₇H₈N₅O₂); 165 (C₆H₇N₅O); 136 (C₅H₄N₄O); 85 (C₅H₉O).

ИК (KBr): 1733,6, 1594,7 см^-1.

¹H-ЯМР (Me₂SO-d₆): 7,95 (s, 1H, H-2); 6,45 (br s, 2H, NH₂); 6,10 (d, 1H, H-1', J = 4,3 Гц); 6,10 (d, 1H, 2'-OH, J = 5,5 Гц); 5,16-5,10 (m, 2H, H-3' и 5'-OH); 4,23-4,20 (m, 1H, H-2'): 3,94 (s, 3H, Pur-OCH₃); 3,90-3,86 (m, 1H, H-4'); 3,67-3,60 (m, 2H, 5'); 1,18 (s, 9H, C(CH₃)₃).

Аналитический расчет для C₁₆H₂₃N₅O₆0,40 CHCl₃: рассчитано: C 45,90; H 5,50; N 16,32; найдено: C 45,72; H 5,43; N 16,04.

c(i) 2-Амино-9-(3,5-ди-О-трет-бути