Способ, средство, тест-система для колориметрического определения аналита и нитрозоанилиновые соединения

Способ, средство, тест-система для колориметрического определения аналита и нитрозоанилиновые соединения

Реферат

 

Изобретение может быть использовано для обнаружения и определения веществ в различных испытуемых материалах. Способ определения аналита включает ферментативное окисление аналита с помощью PQQ-зависимой дегидрогеназы в присутствии акцептора электронов. Акцептор электронов - обогащенные электронами ароматические нитрозосоединения, которые восстанавливают до иминосоединения при окислении аналита. Восстановленный акцептор обнаруживают путем цветового проявления. В случае, если акцептор не способен к цветовому проявлению, обнаружение проводят в присутствии неокислительного окрашивающего индикатора для иминосоединений или в присутствии лейкокрасителя. При этом лейкокраситель окисляется в присутствии иминосоединений до красителя. Средство для способа содержит PQQ-зависимую дегидрогеназу и прямой акцептор электронов - обогащенные электронами ароматические нитрозосоединения, неокислительный окрашивающий индикатор для иминосоединений или лейкокраситель. Тест-система для способа представляет собой инертный носитель, содержащий реагенты предлагаемого средства. Нитрозоанилиновые соединения (новые) формулы где R¹ - Н, ОН, галоген, C₁-C₆-алкил, С₁-C₆-алкоксил, Х - У - N=СR⁶, R⁶ - Н, А - насыщенная или ненасыщенная трехчленная цепь с одним атомом N или S и двумя атомами углерода, или с двумя атомами азота и одним атомом углерода, атомы углерода могут быть замещены или образуют алкиленовую цепь. Эти соединения могут быть использованы в качестве хромогенных акцепторов электронов при определении аналита. Изобретение делает возможным обнаружение и определение веществ в самых различных испытуемых материалах. Способ отличается простотой. Он одностадиен, имеет меньше помех, высокочувствителен. 4 с. и 18 з.п. ф-лы, 4 табл., 7 ил.

Изобретение относится к способу колориметрического определения аналита посредством ферментативного окисления с помощью PQQ-зависимой дегидрогеназы (PQQ - пирролохинолинхинон) в присутствии акцептора электронов из группы обогащенных электронами ароматических нитрозосоединений и определения восстановленного акцептора электронов за счет появления окраски как меры количества аналита. Далее, изобретение относится к средству для колориметрического определения аналита путем ферментативного окисления, содержащему PQQ-зависимую дегидрогеназу, обогащенное электронами ароматическое нитрозосоединение, а также цветообразующий неокислительный индикатор для иминосоединения, образующегося из обогащенного электронами, ароматического нитрозосоединения при восстановлении. Далее, изобретение относится к новым нитрозоанилиновым соединениям, их получению, а также к их применению для колориметрического определения аналита.

Ферментативное окисление в аналитике делает возможным обнаружение и определение веществ в самых различных испытуемых материалах. При этом окисляющий фермент в присутствии принимающего электроны реакции окисления акцептора воздействует на соответствующий ферментативный субстрат. Восстановление акцептора электронов указывает на наличие ферментативного субстрата. При этом до сих пор как особенно предпочтительное оказывалось, что восстановленный акцептор электронов можно обнаруживать за счет образования окраски, так как это возможно не только при необходимости использования дорогостоящих измерительных приборов, но и в случае необходимости можно осуществлять также визуально.

В известных методах колориметрического определения веществ посредством окисляюще действующих ферментов применяют оксидазы или дегидрогеназы. Обе группы ферментов относятся к основной группе оксидоредуктаз (Rmpps Chemielexikon, Francksche Verlagsbuchhandlund, Штутгард, 8-е изд., 1985, т.4, с. 2952; Lexikon Biochemie, Herausgeber H.D. Jakubke, Verlag Chemie, Вайнхайм, 2-е изд. , 1981, с.194), члены которой могут различаться своими природными акцепторами электронов.

Природным акцептором электронов для оксидов является молекулярный кислород (Rmpps Chemielexikon, Francksche Verlagsbuchhandlung, Штутгард, 8-е изд., 1985, т.4, с.2946). В случае определений аналитов при этом аналит окисляется оксидазой и O₂. Образующийся пероксид водорода с помощью пероксидазы используется для окисления лейкокрасителя. Об уровне техники в отношении использования оксидаз для колориметрического определения аналитов следует цитировать A. Kunst и др. в "Methods of enzymatic analysis", Hrsg.H.U.Bergmeyer, Verlag Chemie, Вайнхайм, 3-е изд., 1984, т.6, с.178-185. Там определяют глюкозу в сыворотке, плазме или депротеинизированной крови путем введения во взаимодействие с глюкозооксидазой и кислородом воздуха тем, что образующийся при этой реакции за счет восстановления кислорода пероксид водорода восстанавливается в присутствии пероксидазы и тем самым вызывает окрашивание также имеющегося в реакционной смеси фенола и 4-аминофеназона. Высокий редокспотенциал (окислительно-восстановительный потенциал) перекиси водорода и неселективность и нестабильность пероксидазы чаще всего приводят к ограничениям такого теста. Мешающе действуют, например, ионы переходных металлов или гем или гемопротеины, которые легко могут попадать в получаемые из крови пробы, так как они разлагают перекись водорода. Ингредиенты проб, как например билирубин, или также медикаменты, как например метилдиоксифенилаланин, которые встречаются в получаемых из крови пробах или в моче, могут приводить к окрашиванию с перекисью водорода и пероксидазой, и, таким образом, к ошибочным результатам, однако также они могут снова восстанавливать уже образовавшийся краситель и таким образом обесцвечивать.

В особенности при осуществлении вышеуказанных методов определения на твердых носителях, в так называемом сухом тесте, дополнительно потребность в кислороде оксидаз оказалась отрицательно сказывающейся. Прежде всего тогда, когда требуется много кислорода для окисления высоких концентраций ферментативного субстрата, диффузия кислорода из воздуха в реакционную среду может становиться определяющей скорость стадией и приводить к длительным реакционным временам или в особенности при кинетических методах определения - к ошибочным результатам.

Дегидрогеназы в общем можно подразделять на такие, которые необходимы для окисления ферментативных субстратов никотинамид-аденин-динуклеотид (NAD) или никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфат (NADP) в качестве прямых природных акцепторов электронов, и на такие, которые независимы от NAD или NADP и которые также используют другие вещества, чем природные прямые акцепторы электронов, при ферментативных реакциях окисления. Под группу независимых от NAD или NADP дегидрогеназ подпадают в особенности PQQ- и флавин-зависимые дегидрогеназы.

Использование NAD-зависимых дегидрогеназ для колориметрических измерений известно, например, из патента ФРГ А-2147466. Там описывается, что лактат при катализе лактатдегидрогеназой с никотинамин-аденин-динуклеотидом превращается в пируват и восстановленный никотинамид-аденин-динуклеотид. Образовавшийся NADH реагирует затем, например в присутствии фермента диафоразы, с солями тетразолия при образовании NAD и окрашенных формазанов, концентрацию которых можно определять фотометрически. Вместо диафоразы также можно назвать N-метилфеназиний-метосульфат в качестве катализатора восстановления для переноса электронов от NADH к соли тетразолия.

Недостатки этого способа следует видеть в том, что вместо NADH также другие, возможно присутствующие в биологических пробах, как например кровь, сыворотка, плазма или моча, восстанавливающе действующие вещества, как глутатион, или медикаменты, как метилдиоксифенилаланин или добезилат, в присутствии неспецифических катализаторов восстановления, как диафораза или N-метилфеназиний-метосульфат, переводят соли тетразолия в соответствующие формазаны и таким образом приводят к ошибочным положительным результатам, хотя они не так быстро реагируют с солями тетразолия в отсутствие катализаторов восстановления.

Из европейского патента EP-A-0354441 известно окислительное, ферментативное обнаружение аналитов посредством флавин-зависимых оксидаз или NAD-независимых дегидрогеназ, как PQQ-зависимые дегидрогеназы, с помощью обогащенных электронами, ароматических нитрозосоединений. В случае этих методов обнаружения, ароматическое нитрозосоединение ферментативно восстанавливается до соответствующего, обогащенного электронами, ароматического амина, который либо обнаруживается с помощью осаждающейся, труднорастворимой гетерополикислоты за счет образования гетерополи-синего, либо в присутствии окислителя вводится в реакцию сочетания с цветообразующим реагентом с образованием красителя. Сине-серые градации цвета при образовании гетерополи-синего, правда, мало пригодны для точной визуальной оценки. Для колориметрического обнаружения в общем неокрашенных или только очень слабо окрашенных ароматических аминов с помощью цветообразующего реагента отрицательным является то, что дополнительно требуется окислитель. Так как такой окислитель мешает ферментативному восстановлению ароматического нитрозосоединения до ароматического амина, то реакцию обнаружения нужно проводить в две отдельные стадии; в первой стадии ароматическое нитрозосоединение ферментативно восстанавливается до ароматического амина и в отдельной от нее второй стадии добавляется окислитель для окислительного сочетания ароматического амина с цветообразующим реагентом.

Другой недостаток этого способа обнаружения заключается в том, что для восстановления каждого эквивалента ароматического нитрозосоединения до ароматического амина нужно окислять два эквивалента аналита. Это в особенности в случае незначительных концентраций аналита может приводить к неудовлетворительной чувствительности такого способа обнаружения.

Поэтому задачей изобретения являлось устранение вышеуказанных недостатков уровня техники и разработка более простого, с меньшим количеством помех, чувствительного и визуально лучше оцениваемого способа и нахождения средства для окислительного обнаружения аналитов, который в особенности можно осуществлять в одну стадию и который дает во всей видимой области длин волн визуально хорошо оценниваемые окраски (цвета).

Задача решается благодаря изобретению, которое охарактеризовано в формуле изобретения.

Соответственно этому найден способ колориметрического определения аналита посредством ферментативного окисления аналита с помощью оксидоредуктазы в присутствии прямого акцептора электронов из группы обогащенных электронами ароматических нитрозосоединений, при котором определение восстановленного акцептора электронов осуществляют за счет появления окраски как меры количества аналита, отличающийся тем, что обогащенное электронами ароматическое нитрозосоединение при окислении аналита в присутствии PQQ-зависимой дегидрогеназы восстанавливается до иминосоединения и оно без дальнейшего ферментативного восстановления до ароматического амина обнаруживается за счет появления окраски.

Предметом изобретения, в частности, является способ колориметрического определения аналита с помощью оксидоредуктазы в присутствии прямого акцептора электронов из группы обогащенных электронами, ароматических нитрозосоединений, при котором определение восстановленного акцептора электронов осуществляют за счет появления окраски как меры количества аналита, который отличается тем, что обогащенное электронами ароматическое нитрозосоединение при окислении аналита в присутствии PQQ-зависимой дегидрогеназы восстанавливается до иминосоединения и оно, вместо ферментативного дальнейшего восстановления до ароматического амина, путем взаимодействия с неокислительным цветообразующим индикатором определяется колориметрически.

Кроме того, найдено средство для колориметрического определения аналита путем ферментативного окисления аналита, содержащее PQQ-зависимую дегидрогеназу и прямой акцептор электронов из группы обогащенных электронами, ароматических нитрозосоединений, которое отличается тем, что оно либо содержит обогащенное электронами ароматическое нитросоединение, которое при ферментативном восстановлении образует окрашенное иминосоединение, либо оно, далее, содержит неокислительный цветообразующий реагент (индикатор) для иминосоединения, образующегося из обогащенного электронами ароматического нитрозосоединения путем восстановления.

Согласно изобретению под термином "аналит" понимают такое вещество, которое ферментативно окисляется. Во многих случаях аналитом является такое вещество, которое нужно обнаружить прямо или определить количественно в исследуемой пробе. Например, глюкозу можно окислять прямо с помощью PQQ-зависимой глюкозодегидроредуктазы (глюкозо-краситель-оксидоредуктаза) и колориметрически определять. Однако также возможно, что аналит образуется лишь путем одной или нескольких предварительных реакций из другого вещества, так что путем колориметрического определения аналита косвенно можно делать вывод о концентрации исходного вещества.

Аналит в изобретении представляет собой такое вещество, которое акцептуется (признается) в качестве субстрата используемой PQQ-зависимой дегидрогеназы.

PQQ-зависимые дегидрогеназы содержат в качестве кофактора пирролхинолинхинон. Обзор таких "хинопротеинов" представлен J.A. Jongejahn и др. в "PQQ и хинопротеины", Kluver Academic Publ. Dordrecht, Нидерланды, 1989. Примерами используемых согласно изобретению ферментов являются PQQ-зависимая глюкозодегидрогеназа [глюкозо-краситель-оксидоредуктаза, Е.С. 1.1.1.50/1.1.1.91/1.1.1.97], спиртодегидрогеназа или лактат-дегидрогеназа. В предлагаемом в изобретении способе в особенности можно использовать PQQ-зависимую глюкозодегидрогеназу предпочтительно для колориметического определения глюкозы.

В качестве прямых акцепторов электронов, которые принимают электроны от системы фермент /система кофактор дегидрогеназа/ PQQ, используют обогащенные электронами ароматические нитрозосоединения, которые известны в качестве акцепторов электронов для оксидаз и NADH-независимых дегидрогеназ из европейского патента A-0-354441 и европейского патента EP-A-0441222 и в случае которых нитрозогруппа непосредственно связана с обогащенным электронами ароматическим ядром. Термин "прямые" акцепторы электронов означает, что электроны прямо катализируемые ферментами, без необходимости в катализаторе восстановления, принимаются системой фермент/ кофактор.

В смысле изобретения, используемые в качестве восстанавливаемых, обогащенных электронами ароматических нитрозосоединений соединения представляют собой таковые, которые принимают электроны, получающиеся при окислении соответствующего используемой PQQ-зависимой дегидрогеназе субстрата, от фермента и при этом образуют иминосоединения. Соответствующее иминосоединение содержит иминогруппу = NH, которая через свою двойную связь связана с первоначальным ароматическим ядром и сопряжена с его электронами двойной связи. Обогащенные электронами ароматические нитрозосоединения содержат один или несколько электронодонорных остатков или групп, на или в ароматическом ядре, которые благоприятствуют образованию иминосоединения тем, что они вступают в сопряжение с иминогруппой за счет отдачи электронов через первоначальное ароматическое ядро.

Это относится к заместителям, которые оказывают +M-эффект на ароматическое ядро. Например, Примерами связанных с ароматическим ядром остатков R c +M-эффектом являются такие заместители, как гидроксильный, алкоксильный, арилокси-, алкилтио-, арилтио-, амино-, моноалкиламино-, моноариламино-, диалкиламино- и диариламиноостатки.

В случае производных нитрозобензола эти заместители, например, особенно проявляют свое действие тогда, когда они находятся в орто- и/или параположении к нитрозогруппе.

Группы с электронодонорным и благоприятствующим иминоструктуре эффектом также могут быть составной частью гетероароматической циклической системы.

Примерами являются гетероциклические ароматические нитрозосоединения с избытком -электронов, в которых ароматическая циклическая система настолько обогащена электронами, что внешний +M-заместитель является лишним для образования стабилизированной за счет мезомерии иминогруппы после восстановления. Избыток -электронов образуется вследствие того, что имеется больше ароматических -электронов, чем дают атомы кольца, через которые могут распределяться -электроны. Такого рода гетероциклы известны специалисту.

Примерами таких ароматических гетероциклов являются антипирин, пиразольные гетероциклы и пиразолы.

Избыток электронов, используемых согласно изобретению, обогащенных электронами ароматических нитрозосоединений имеет дополнительный эффект, заключающийся в том, что эти нитрозосоединения в известной мере через кето-енольную таутомерию находятся в равновесии с эквивалентной оксимной предельной структурой R-Ar-N=O ____ R= Ar = N-OH Обе таутомерные предельные структуры в рамках изобретения должны охватываться понятием "ароматические нитрозосоединения" в качестве используемых согласно изобретению веществ.

В случае вышеуказанных +M-заместителей имеются в виду алкоксильные, алкилтио-, моноалкиламино- и диалкиламиноостатки, в которых алкил представляет собой углеводородный остаток с 1-6 C-атомами, который, со своей стороны, может быть замещен гидроксильной группой, в случае необходимости замещенной одно- или многократно алкилом с 1-6 C-атомами аминогруппой, PO₃H₂, SO₃H или CO₂H. Кислотные остатки PO₃H₂, SO₃H и CO₂H могут быть как таковые или находиться в солевой форме, как соли аммония, щелочных или щелочно-земельных металлов.

Арилокси- и арилтиоостатки содержат ароматические остатки с 6-10 C-атомами, причем особенно предпочтительны фенокси- и фенилтиоостатки.

Аммониевыми солями являются таковые, которые содержат ион аммония, или таковые, которые содержат катионы аммония, одно- или многократно замещенные алкильными, арильными или аралкильными остатками. Алкил в алкильных или арилкильных остатках, обозначает углеводородный остаток с 1-6 C-атомами. Арил в арильных и аралкильных остатках представляет собой с 6-10-ю C-атомами ароматическую циклическую систему, причем предпочтителен фенил. Предпочтительным аралкильным остатком является бензил.

Солями щелочных металлов предпочтительно являются соли лития, натрия или калия. Соли щелочно-земельных металлов предпочтительно представляют собой соли магния или кальция.

Вышеуказанные примеры +M-заместителей не нужно понимать как полный перечень. Специалисту в каждом отдельном случае известно, является ли данный остаток +M-заместителем и в каком месте он оказывает это действие на ароматическую систему, или какие ароматические гетероциклы в циклической системе содержат соответствующую группировку и насколько все эти остатки могут быть возможными заместителями в ароматических нитрозосоединениях, которые могут использоваться согласно настоящему изобретению.

Ароматическая основная структура используемого ароматического нитрозосоединения предпочтительно представляет собой обогащенное электронами ароматическое кольцо с 5-7, особенно предпочтительно с 5-6, атомами углерода или гетероатомами, которое может быть анеллировано с одним или двумя ароматическими и/или алициклическими кольцами. Для ароматических анеллированных колец при этом принимают во внимание как углеродные ароматические системы, так и также гетероароматические системы с количеством атомов углерода или гетероатомов по 5-7, предпочтительно 5-6.

Под алициклическими кольцами понимают насыщенные или ненасыщенные циклоалифатические соединения с 5-7 C-атомами или гетероатомами, предпочтительно с 5- или 6-ю атомами углерода. Под гетероатомами понимают азот, кислород или серу.

Предпочтительными, используемыми согласно изобретению нитрозосоединениями, являются производные нитрозобензола.

Под производными нитрозобензола понимают также нитрозобензол, который анеллирован с одним или несколькими ароматическими и/или алициклическими кольцами. В качестве ароматических колец при этом принимают во внимание как углеродные ароматические системы, так и также гетероароматические соединения с количеством в цикле по 5-7, предпочтительно 5 или 6. Примерами являются анеллированные бензольные или нафталиновые циклы или анеллированное пиридиновое кольцо.

Особенно предпочтительны нитрозобензольные производные общей формулы I где R¹ - водород, гидроксил; алкил, в случае необходимости замещенный гидроксилом, COOH, PO₃H₂, или SO₃H; алкоксил, алкилтио, арилокси, арилтио, галоген, или аминогруппа, которая в случае необходимости одно- или многократно замещена алкилом, в случае необходимости замещенным гидроксилом, PO₃H₂, диалкилфосфинилом, SO₃H или CO₂H; и R² - гидроксильная группа, алкоксильная, арилокси-, арилтио- или алкилтиогруппа, причем алкильный остаток в случае необходимости со своей стороны замещен гидроксильной группой, алкоксильной группой, в случае необходимости одно- или многократно замещенной алкилом аминогруппой, PO₃H₂, SO₃H или CO₂H как таковыми или в солевой форме в виде солей аммония, щелочных или щелочно-земельных металлов, или аминогруппа NR³R⁴, в которой R³ и R⁴ могут быть одинаковыми или разными и обозначают водород, арильную или алкильную группу, которая со своей стороны может быть замещена гидроксилом, алкоксилом, гидроксиалкоксилом, в случае необходимости замещенной гидроксилом полиалкоксильной группой, PO₃H₂, SO₃H, COOH как таковыми или в солевой форме или в случае необходимости одно- или многократно замещенной алкилом аминогруппой; или в которой R³ и R⁴ могут представлять собой алкиленовый остаток, который в случае необходимости прерывается кислородом, серой или азотом, причем азот замещен алкильным, гидроксиалкильным, гидроксиалкоксиалкильным, алкоксигидроксилалкильным, алкоксикарбонилалкильным, диоксанилилалкильным или полиалкоксиалкильным остатком, который, со своей стороны, смотря по обстоятельствам, в алкильной части может быть замещен гидроксильным остатком; или, когда R¹ находится в ортоположении к NR³R⁴, то R³ или R⁴ также вместе с R¹ может представлять собой алкиленовый остаток.

При этом галоген обозначает фтор, хлор, бром или иод. Особенно предпочтительны фтор и хлор.

Алкил в алкильном, алкоксильном или алкилтиоостатке обозначает углеводородный остаток с 1-6 C-атомами, причем особенно предпочтительны остатки с 1-3 C-атомами. Вышеуказанное определение для алкила также относится к алкильной части в гидроксиалкильном, диалкиламиноалкильном, гидроксиалкоксиалкильном, алкоксиалкильном, полиалкоксиалкильном, алкоксигидроксиалкильном и диоксанилилалкильном остатках. Диоксанилильный остаток представляет собой остаток, в случае которого диоксановая циклическая система связана с алкильным остатком. Предпочтительно речь идет о 1,4-диоксановой циклической системе Полиалкоксиалкильным остатком является остаток -алкил-(алкокси)_n-алкокси, в котором n = 1-10. Предпочтительно n = 1-4. Особенно предпочтительно n 1-3. Алкиленовый остаток представляет собой линейную или разветвленную, предпочтительно линейную, насыщенную или ненасыщенную, предпочтительно насыщенную, углеводородную цепь из 2-5, предпочтительно 2-4 C-атомов, с двумя свободными местами связывания.

Арил в арильном и аралкильном остатках представляет собой содержащую 6-10 C-атомов ароматическую циклическую систему, причем предпочтителен фенил.

Аммониевыми солями являются такие, которые содержат ион аммония NH⁺₄ , или такие, которые содержат катионы аммония, одно- или многократно замещенные алкильными, арильными или аралкильными остатками.

Солями щелочных металлов предпочтительно являются соли лития, натрия или калия. Солями щелочно-земельных металлов предпочтительно являются соли магния или кальция.

Предпочтительными остатками R¹ являются водород и алкил, предпочтительно водород.

Предпочтительными остатками R² являются алкоксильные остатки и аминогруппа NR³R⁴.

В значении образованного R¹ и R³, прерываемого кислородом, серой или азотом алкиленового остатка предпочтителен образованный путем включения атома азота согласно общей формуле I морфолиновый, соответственно тиоморфолиновый, соответственно пиперазиновый остаток. Особенно предпочтителен пиперазиновый остаток.

В значении образованного R¹ и R³ алкиленового остатка предпочтителен образованный путем включения ароматического кольца согласно общей формуле I индолиновый или 1,2,3,4-тетрагидрохинолиновый остаток.

Для получения соли предлагаемого согласно изобретению нитрозоанилинового производного общей формулы I предпочтительны в особенности такие сильные кислоты, в особенности неорганические кислоты, как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота. Особенно предпочтительны гидрохлориды, которые являются солями соляной кислоты.

Предпочтительными нитрозосоединениями общей формулы I являются: N,N'-бис-/2-гидроксиэтил/-n-нитрозоанилин, N, N'-диметил-n-нитрозоанилин, N,N'-диэтил-n-нитрзоанилин, N-метил-N'-/4-нитрозофенил/-пиперазин, N-/2-гидроксиэтил/5-нитрозоиндолин, 2,4-диметокси-нитрозобензол, N,N'-бис-/2-метоксиэтил/-4-нитрозоанилин, N-/4-нитрозофенил/-морфолин, N-/2,2-диэтокси-этил/-N'-/4-нитрозофенил/-пиперазин, n-нитрозофенол, 3-метокси-4-нитрозофенол.

Из обогащенных электронами гетероароматических нитрозосоединений, ароматическая циклическая система которых настолько обогащена электронами, что излишним является внешний +M-заместитель для нитрозо-/оксимтаутомерии и для образования имина, в предлагаемом согласно изобретению способе особенно пригодны замещенные нитрозогруппой пиразолоны, пиразолы и в особенности нитрозозамещенные пиразольные соединения, которые, например, описаны в Ullmann's Enzyclopedia of Industrial Chemistry, 5-е изд., т. А 20, с. 72-74. При этом предпочтительны 3-нитрозопиразольные соединения общей формулы II Эти соединения большей частью известны, в качестве предстадий для препаративного синтеза соответствующих 3-аминопиразольных соединений, из европейской патентной заявки EP-A-0433854.

В формуле II X-Y - NR⁵CO или N = CR⁶; R⁵ - водород; алкил, в случае необходимости замещенный гидроксилом, карбоксилом, SO₃H, PO₃H₂, диалкилфосфинилом; R⁶ - водород, алкил, алкенил, алкоксил, алкилтио, арил, арилтио, аралкил, в случае необходимости, смотря по обстоятельствам, замещенный гидроксилом, карбоксилом, SO₃H, PO₃H₂, солью одного из этих кислотных остатков и/или алкоксикарбонилом; или аминогруппа, которая в случае необходимости замещена одним или двумя, содержащими в случае необходимости один или несколько гидроксильных, карбоксильных и/или алкоксикарбонильных остатков алкильными остатками, причем когда аминогруппа замещена двумя алкильными остатками, то эти остатки также могут быть циклизованы до кольца, которое, кроме N-атома аминогруппы, в случае необходимости может прерываться также кислородом, серой или другим атомом азота; или аминогруппа, которая в случае необходимости замещена одной или двумя ацильными группами, алкокси- и/или аралкоксикарбонильными группами, H₂N-CO, алкил-, аралкил- и/или арилкарбамоильными группами; или карбоксил, алкоксикарбонил, карбоксамидогруппа или галоген; и R⁷ - алкил, тиоалкил или аралкил, в случае необходимости замещенный гидроксилом, карбоксилом, SO₃H или PO₃H₂, или аминогруппа, которая в случае необходимости замещена одной или двумя алкильными группами, которые со своей стороны опять могут быть замещены гидроксилом, карбоксилом, SO₃H, диалкилфосфинилом или PO₃H₂; причем по меньшей мере R⁶ и/или R⁷ представляет собой аминогруппу; и R⁸ - алкильная или аралкильная группа, которая в случае необходимости может быть замещена гидроксилом, карбоксилом, SO₃H или PO₃H₂; или R⁷ и R⁸ вместе образуют насыщенную или ненасыщенную 3- или 4-членную цепь из атомов азота или атомов углерода и в случае необходимости одного или нескольких атомов азота или серы, причем атомы углерода в случае необходимости замещены алкилом, алкоксилом, алкилтио, гидроксилом, аралкилом, арилом, карбоксилом, карбоксамидо, алкоксикарбонилом, цианогруппой, галогеном, аминогруппой, которая в случае необходимости замещена одним или двумя, в случае необходимости содержащими один или несколько гидроксильных, карбоксильных и/или алкоксикарбонильных остатков, алкильными остатками; и причем атомы азота, которые не связаны через двойную связь, замещены алкилом или аралкилом, в случае необходимости замещенным гидроксилом, SO₃H, PO₃H₂, карбоксилом или диалкилфосфинилом; или два соседних заместителя цепи в случае необходимости образуют алкиленовую группу, которая со своей стороны в случае необходимости замещена арилом или анеллирована с ним; а также в случае необходимости соответствующие таутомерные формы и их соли.

При этом "алкил" - также в алкилтио-, диалкилфосфинильном, алкилкарбамоильном и аралкильном остатках - обозначает линейный или разветвленный алкильный остаток с 1-6, предпочтительно 1-4 C-атомами. Примерами являются метильная, этильная, пропильная, изобутильная или трет-бутильная группы.

Если аминогруппа замещена двумя алкильными остатками, то эти остатки также могут быть циклизованы в кольцо так, что в целом они представляют собой прерываемое атомом азота кольцо. При этом предпочтительны такие аминогруппы, которые представляют собой в целом 5- или 6-членное кольцо и которое со своей стороны в случае необходимости прерывается кислородом, серой или азотом. Особенно предпочтителен морфолиновый остаток.

"Алкокси" - также в алкокси- и аралкоксикарбонильных остатках - обозначает линейный или разветвленный алкоксильный остаток с 1-6, предпочтительно 1-4 C-атомами. Примерами являются метокси-, этокси-, пропилокси-, изо-бутилокси- или трет-бутилоксигруппы.

"Арил" - также в арилкарбамоильных группах - обозначает углеродный ароматический или гетероароматический остаток, предпочтительно таковой с 6-10 атомами в кольце, в особенности фенильную или нафтильную группу, которые дополнительно могут быть еще замещены алкилом, алкоксилом и/или галогеном. Особенно предпочтителен фенильный остаток.

"Аралкильный остаток" - также в аралкилкарбамоильной группе - обозначает остаток, в котором вышеуказанная алкильная группа замещена вышеохарактеризованным арильным остатком. Предпочтительна бензильная группа.

"Аралкоксильный" остаток, например в аралкоксикарбонильных группах, обозначает остаток, в котором вышеуказанная алкоксильная группа замещена вышеохарактеризованным арильным остатком. Предпочтительна бензилоксигруппа.

"Галоген" обозначает остатки: фтор, хлор, бром и йод. Предпочтительны фтор и хлор, "Ацильная группа" обозначает остаток карбоновой кислоты, который может содержать алкильные, аралкильные или арильные остатки. Предпочтительны ацетильные, фенилацетильные или бензоильные остатки.

Под алкиленовой группой понимают линейную или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную углеводородную цепь из 3-5, предпочтительно 3-х или 4-х C-атомов с двумя свободными местами связывания.

Примерами являются: -CH₂-CH= CH-, -(CH₂)₄- или -CH=CH-CH=CH-.

Предпочтительны бутадиендиильный остаток (-CH=CH-CH=CH-) и тетраметиленовый остаток [-(CH₂)₄-].

Алкенильный остаток представляет собой линейный или разветвленный углеводородный остаток из 2-5 C-атомов по меньшей мере с одной двойной связью. Предпочтителен, например, винильный остаток. Под диалкилфосфинильной группой понимают остаток причем "алкил" имеет указанное ранее значение.

Предпочтителен диметилфосфинильный остаток.

В качестве солей SO₃H-, PO₃H₂- и карбоксильных остатков можно использовать соли щелочных или щелочно-земельных металлов или аммония. Под солями щелочных металлов понимают соли лития, натрия, калия, рубидия и цезия, причем предпочтительны соли лития, натрия и калия, прежде всего, однако, соли натрия и калия. Солями щелочно-земельных металлов являются соли бериллия, магния, кальция, стронция или бария. Предпочтительны соли магния и кальция, причем особенно предпочтительны кальциевые соли. В качестве солей аммония могут найти применение таковые незамещенного иона аммония, NH⁺₄. Однако также можно использовать такие аммониевые соли, в которых ион аммония замещен 1-4-мя алкильными, арильными или аралкильными остатками. Для этих остатков имеют значение вышеуказанные определения, причем в качестве алкильного остатка особенно предпочтительны метил, этил и н-пропил, а в качестве арильного остатка особенно предпочтительна фенильная группа и в качестве аралкильного остатка особенно предпочтительна бензильная группа.

В качестве карбоксамидного остатка понимают остаток CONH₂, однако также такие остатки, в которых аминогруппа замещена в случае необходимости одним или двумя содержащими в случае необходимости один или несколько гидроксильных, карбоксильных и/или алкоксикарбонильных остатка алкильными остатками.

Из используемых согласно изобретению нитрозосоединений общей формулы II предпочтительны такие соединения, в которых R⁷ и R⁸ образуют насыщенную или ненасыщенную цепь, как описано выше. Особенно предпочтительно при этом, когда эта цепь ненасыщена и электроны двойной связи и свободная электронная пара азота ненасыщенной цепи сопряжены с двойной связью или мостичным N-атомом общей формулы II так, что в результате образуется анеллированное ароматическое кольцо.

В случае необходимости для вещества общей формулы II также возможны таутомерные формы. Они также должны охватываться общей формулой II.

Согласно изобретению предпочтительны нитрозосоединения общих формул III - XII При этом X-Y имеет такое же значение, как указывалось раньше. R⁹, R¹⁰, R¹¹ и R¹², которые являются одинаковыми или разными, обозначают водород, гидроксил, алкил, алкоксил, алкилтио, арилкил, арил, карбоксил, алкоксикарбонил, карбоксамидогруппу, цианогруппу, аминогруппу, которая в случае необходимости замещена одним или двумя, в случае необходимости содержащими один или несколько гидроксильных, карбоксильных и/или алкоксикарбонильных остатков, алкильными остатками, или галоген, причем два соседних остатка в случае необходимости образуют алкиленовую группу, которая со своей стороны в случае необходимости замещена арилом или анеллирована с ним, и R¹³ представляет собой алкил или аралкил, который в случае необходимости может быть замещен гидроксилом, карбоксилом, SO₃H, PO₃H₂ или диалкилфосфинилом. Определения остатков соответствуют указанным для соединений общей формулы II.

Для предлагаемого согласно изобретению применения особенно предпочтительны вещества общих формул III, IV, V, VII, VIII и IX, в случае необходимости соответствующие таутомерные формы и их соли. Особенно предпочтительны такие вещества, в которых X-Y имеет значение N=CR⁶, причем R⁶ может иметь значение, как указанное для общей формулы II.

В качестве исключительно пригодных для применения согласно изобретению оказались в особенности такие соединения, как 3-нитрозо-2-метил-пиразол-(1,5а)-пиридин, 3-нитрозо-пиразоло(1,5-а)-пиридин и 3-нитрозо-пиразоло(3.2-с)-S-триазол и их соли, в особенности гидрохлорид.

Как указано выше, согласно предлагаемому в изобретении