Способ получения глюкозоспецифического лектина из растительного сырья

Способ получения глюкозоспецифического лектина из растительного сырья

Реферат

 

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для получения глюкозоспецифичного лектина, применяемого для исследований в биологии и медицине. Сущность изобретения: растительное сырье, преимущественно бобовые, подвергают кислотно-солевой экстракции, защелачиванию, высаливанию и афинной хроматографии с использованием в качестве сорбента растворимого крахмала, предварительно гидролизованного в течение 15-25 мин и поперечносшитого. Технический результат: увеличение выхода продукта и сокращение времени процесса получения. 1 табл.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для получения глюкозоспецифичного лектина, применяемого для исследований в биологии и медицине.

Известен способ получения фитопреципитина (авт.св. СССР N 1671889, МКИ: A 61 K 23/00) путем экстракции гороховой муки раствором хлорида натрия, осаждения белка и его очистки. Белок осаждают сульфатом аммония в кислой среде, адсорбируют на декстрановом геле из фосфатного буфера, содержащего 1% хлористого натрия, pH 7,5, элюируют тем же буфером с добавкой 0,5 моль глюкозы с последующим переосаждением и кристаллизацией из спиртоводного раствора при pH 5,6 и температуре 4 - 5^oC.

Однако осуществление способа занимает длительное время.

Известен также способ получения водорастворимого субпротеина /патент Великобритании N 51885/74, МКИ: C 07 G 7/022/ из растения Canavalia ensiformis, Abrus praecatoris или Ricinus communis, содержащих водорастворимые агглютинины и/или токсины. Окончательную очистку осуществляют электрофорезом, диафильтрованием мембраны или хроматографией на Сефадексе C-50.

Однако данный способ характеризуется невысоким выходом конечного продукта.

Известен также способ получения глюкозоспецифичного лектина (О.А.Хомутовский, М.Д.Луцик, О.Ф.Передерей. Электронная гистохимия рецепторов клеточных мембран. - Киев: Наукова думка, 1986, с. 27), включающий кислотно-солевую экстракцию, защелачивание, высаливание и афинную хроматографию с использованием в качестве сорбента сефадекса.

Однако для осуществления данного способа необходимо длительное время.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения глюкозоспецифичного лектина из растительного сырья, /В.О.Антонюк. Синтез сорбента на основе поперечносшитого крахмала для афинного очищения глюкозо (маннозо-) специфичных лектинов. - Украинский биохимический журнал. 1991. N 6. с. 97-100/, включающий кислотно-солевую экстракцию, защелачивание, высаливание и афинную хроматографию с использованием в качестве сорбента картофельного крахмала, гидролизированного предварительно в течение часа.

Однако данный способ характеризуется невысоким выходом продукта и требует значительного времени для осуществления.

Задачей изобретения является сокращение длительности процесса при увеличении выхода продукта.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения глюкозоспецифичного лектина из растительного сырья, преимущественно бобовых, включающем кислотно-солевую экстракцию, защелачивание, высаливание и афинную хроматографию с использованием в качестве сорбента поперечносшитого крахмала, предварительно гидролизированного, используют крахмал, растворимый, а гидролизирование его проводят в течение 15-25 мин.

В известной авторам научно-технической и патентной литературе решений с данной совокупностью признаков не обнаружено. Свойства, проявляющиеся у данного решения и обусловленные совокупностью этих признаков, не совпадают со свойствами известных решений. Таким образом, можно сделать вывод о нетривиальности заявляемого решения.

Способ осуществляют следующим образом. В качестве растительного сырья, из которого получают глюкозоспецифичный лектин, может быть использован ячмень (семейство злаковых), картофель (семейство пасленовых), чечевица Lens culinaris (семейство бобовых) и др.

Проводят кислотно-солевую экстракцию следующим образом. К 15 г растворимого крахмала добавляют холодной воды, хорошо перемешивают и нагревают до кипения. Затем к образовавшемуся крахмальному клейстеру прибавляют 1 мл концентрированного HCl, тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 70^oC. Через 20 мин гель быстро охлаждают до 40^oC, приливают 3 мл 8 N KOH и 1,5 мл эпихлоргидрина. Затем застывший гель протирают через сито с размером ячеек примерно 300 мкм, заливают 1% раствором триса, отмывают рабочим буфером и после удаления мелких частиц (или после отмучивания) загружают в рабочие колонки. Затем к 1 г муки растительного сырья добавляют 10 г 0,9% раствора NaCl, закисляют 0,1 N HCl до pH 4,0 и проводят экстракцию в течение двух часов на магнитной мешалке. После центрифугирования (30 мин при 10000 об/мин) экстракт защелачивают, добавляя 0,1 N NaOH до pH 7,0. Вновь центрифугируют и проводят высаливание лектина, доводя концентрацию (NH₄)₂SO₄ в растворе до насыщения. Осадок после центрифугирования растворяют в минимальном количестве 0,9% NaCl и ставят на диализ против дистиллированной H₂O на ночь (примерно 12 ч). Подготовленный таким образом материал загружают на колонку и проводят афинную хроматографию. Затем отмывают колонку от несвязавшихся с сорбентом белков и проводят десорбцию лектина 0,05 М раствором глюкозы в 0,15 М растворе NaCl. На выходе колонки собирают фракции по 10 мл и в каждой определяют белок и активность.

Примеры практической реализации заявляемого способа.

Пример 1. В качестве растительного сырья, из которого получают лектин, берут 1 кг чечевицы /семейство бобовых/. Из 7,5 г растворимого крахмала приготавливают гель, который в набухшем состоянии занимает объем, равный 200 мл. По методике, описанной выше, из этого количестве геля за один цикл получают 150 мг лектина из чечевицы. Время, в течение которого проводили гидролиз крахмала, составило 20 минут.

Пример 2. Лектин получают из чечевицы по способу, описанному выше, аналогично прим.1. Из такого же количества крахмала (7,5 г) и исходного сырья - чечевицы (1 кг) при увеличении времени гидролиза до 45 мин получают 100 мл геля, достаточного для получения 70 мг целевого продукта.

Таким образом, при использовании в качестве исходного материала для синтеза сорбента из растворимого крахмала достаточно 15-25 мин гидролиза. Дальнейшее увеличение времени гидролиза приводит к увеличению растворимой фракции и уменьшению выхода конечного продукта.

Попытки уменьшить время гидролиза крахмала оказались безуспешными. Очевидно, что уменьшение времени гидролиза недостаточно для формирования геля с высокими афинными свойствами.

Пример 3. В качестве растительного сырья используют вику (1 кг). Лектин получают описанным выше способом. Время гидролиза - 20 мин. Выход целевого продукта - 1,0 - 1,5 г.

Пример 4. В качестве растительного сырья используют горох (1 кг). Лектин получают описанным выше способом. Время гидролиза - 20 мин. Выход целевого продукта - 0,7 г.

Пример 5. В приведенной ниже таблице представлены данные по влиянию времени гидролиза на выход конечного продукта (на примере выделения лектина из чечевицы).

Таким образом, выход целевого продукта резко снижается за счет падения афинной емкости сорбента (в случае снижения времени гидролиза) или за счет сокращения объема синтезированного носителя (в случае повышения времени гидролиза).

Формула изобретения

Способ получения глюкозоспецифического лектина из растительного сырья - бобовых, включающий кислотно-солевую экстракцию, защелачивание, высаливание и афинную хромотографию с использованием в качестве сорбента крахмала, предварительно гидролизованного и поперечносшитого, отличающийся тем, что используют растворимый крахмал и гидролизуют его в течение 15 - 25 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1