Рекомбинантный вектор клонирования (варианты)

Рекомбинантный вектор клонирования (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к рекомбинантным векторам клонирования, и может быть использовано при манипулировании регуляцией Т-клеточного роста, для модификации онкогенного фенотипа, а также для локализации метастатических очагов опухолей. Рекомбинантный вектор клонирования состоит из Hind III - Bam H I фрагмента плазмиды pT7T3 и фрагмента ДНК, кодирующего белок T-лимфы, и имеет определенную нуклеотидную последовательность. 4 с.п. ф-лы, 38 ил., 8 табл.

Изобретение относится к новым ДНК-последовательностям, рекомбинантным ДНК-молекулам, способам получения новых трансмембранных белков, экспрессированных в процессе развития Т-клеток, и к новым трансмембранным белкам, в основном, в чистом виде. В частности, настоящее изобретение относится к новым ДНК-последовательностям, экспрессированным в соответствующих хозяевах, и к новым белкам, два из которых являются интегральными мембранными белками, продуцированными в этих хозяевах. ДНК-последовательности и рекомбинантные ДНК-молекулы настоящего изобретения отличаются тем, что каждая из них кодирует новый белок, обладающий, по крайней мере, двумя из нижеперечисленных свойств, а именно: этот белок является /1/ экспрессированным Т-клетками лимфомы; /2/ экспрессированным в нормальной ткани тимуса, активированных клетках селезенки; или в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани; /3/ экспрессированным в ткани яичника, нормальных клетках печени или иммортализированных или раковых клеточных линиях; /4/ экспрессированным при эмбрионном росте; и/или /5/ этот белок имеет множество мембранных промежуточных доластей. Как можно видеть из последующего раскрытия изобретения, ДНК-последовательности, рекомбинантные ДНК-молекулы и способы продуцирования новых белков, экспрессируемых при развитии Т-клеток, и новых, в основном, чистых Т-клеточных белков могут быть использованы при манипулировании регуляцией Т-клеточного роста, для модификации онкогенного фенотипа, а также для локализации метастатических очагов опухолей. Настоящее изобретение также относится к новым антителам, которые связываются с эпитопами белков настоящего изобретения, и к использованию этих антител для идентификации и доставки лекарственных средств или других агентов к типоспецифическим клеткам, экспрессирующим новые белки.

В процессе развития иммунной системы Т-лимфоциты образуются из стволовых клеток предшественников, которые поступают в тимус, где происходит их дифференцировка и созревание. По мере происхождения Т-клетки через различные стадии развития в тимусе, многие гены либо активируются, либо подавляются. Например, в течение этого периода клетки приобретают IL-2-рецептор, CD4 и/или CD8 на своей поверхности. Эти маркеры дифференцировки являются важными для развития и/или функции Т-клеток. При развитии Т-лимфоцитов уровень экспрессии многих генных продуктов возрастает. Такими генными продуктами являются Т-клеточный рецептор для антигена, а также маркеры CD4 и CD8. В качестве Т-клеточных маркеров служили много других антигенов, прежде чем была установлена их точная функция. Лишь недавно было обнаружено, что Т-клеточный антиген Pgp1 "помогает" тимоцитам в их "хоминге" в тимус, а Т200 /CD45/ служит в качестве компонента для межклеточной передачи сигнала. Что касается другого Т-клеточного маркера Thy1, то его функция еще не выяснена.

Клетки SL 12. 4 обнаруживают CD4 CD8-двойной негативный фенотип, а поэтому являются схожими с тимоцитами на относительно ранней стадии развития. К тому же, они не экспрессируют -субъединицу Т-клеточного рецептора. Однако, клетки SL 12.4 могут быть индуцированы для стабильной экспрессии CD4 и CD8 на их поверхности после совместного культивирования на тимусных эпителиальных монослоях. После таких обработок также индуцируется TCR-альфа мРНК. Таким образом, очевидно, что клетки SL12,4 обладают способностью к дифференцировке и созреванию. Эта уникальная in vitro биологическая система, до некоторой степени, имитирует микроокружение тимуса.

Был идентифицирован ряд генов, которые первыми экспрессируются в процессе развития тимоцитов. Многие из этих генов кодируют белки, которые должны быть экспрессированы для Т-клеток-предшественников для того, чтобы стать функциональными в иммунной системе, например, 1/ TCR для антигена, который необходим для распознавания антигена; 2/ CD25 /IL2-рецептор/, который должен быть экспрессирован в клетке, чтобы сообщить ей способность к ответу на цитокин IL2; 3/ генные продукты, играющие важную роль для трансдукции сигнала при распознавании антигена, такие, как CD3, CD4, CD45; 4/ некоторые из генных продуктов, участвующих в "хоминге" тимоцитов и обеспечивающих доставку к органам-мишеням; и 5/ генные продукты, участвующие в активации Т-клеток /Fowlkes и Pardoll, Advances in Immunology 44:207-264 /1989/; Hood и др., /1985/ Cell 40, 225-229; Rothenberg и Lugo, Develop. Biol 112, 1-17 /1985/; Adkins и др. , Ann. Rev. Immuol. 5:325-365 /1987/; Crabtree, Science 243: 343-355 /1989/; Kwon и Weissman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1963-1967 /1989/.

Была отмечена гетерогенность в субпопуляциях тимоцитов, которые экспрессируют различные комбинации экспрессированных генов. Экспрессию генов детально анализировали во многих /но не во всех/ различных классах тимоцитов, и возможно, что остались неидентифицированные гены, которые кодируют продукты, способствующие Т развитию и "хомингу" Т-клеток, в частности, те продукты, которые экспрессируются в численно редких, переходных претимоцитах.

Благодаря экстенсивной гетерогенности тимоцитов практически невозможно получить фракционированные претимоциты в достаточных количествах или достаточной чистоты для полной характеризации каскада генной экспрессии, происходящей в процессе развития. По этим причинам клеточные линии лимфомы и лейкоза широко использовали для исследования экспрессии генов при развитии лимфоидных клеток /Greaves, Science 234: 697-704 /1986/; Hanley-Hyde и Lynch Ann. Rev. Immunol. 4: 621-649 /1986/. В значительной части литературных источников указывается, что редкие по своему числу, переходные клетки-предшественники являются мишенью для трансформации в злокачественные опухоли; и кроме того, в литературе указывается, что некоторые свойства трансформированных клеток-мишеней сохраняются в опухолевых клетках. Неожиданная экспрессия генов в опухолевых клетках часто не рассматривается как отклонение в трансформации. Однако, тщательный анализ "аберантной" генной экспрессии в гематопоэтических опухолевых клетках обнаружил редкие субпопуляции нормальных клеток-предшественников, которые экспрессируют указанные гены /Greaves, Science 234: 697-704 /1986/; Hanley-Hyde и Lynch Ann. Rev. Immunol. 4: 621-649 /1986/; Pierce и Speers Cancer Res., 48: 1996-2004 /1988/.

Гетерогенность клеточных линий лимфомы мыши и человека, происходящих от одного индивидуума, может быть следствием различной степени созревания отдельных клеток. Гетерогенность известных клеточных линий лимфомы была использована для получения близких по средству клеточных клонов, которые отличаются ограниченным количеством признаков. Hedrick и др., /Hedrick и др., Nature 308: 149-153 /1984/, используя субтрактивную технику клонирования, установили, что T- и B-клетки различаются в экспрессии около 100 генов. Возможно, что близкие по сродству T-клетки лимфомы могут различаться в экспрессии даже меньшего количества генов. Такие клеточные клоны являются удобными для работы с чистыми популяциями клеток с определенными и стабильными фенотипами, которые отличаются ограниченным числом признаков. В настоящей заявке, для получения такой близкой по сродству клеточной популяции разработали и использовали систему T-клеточной модели лимфомы, SL12. /Hays и др., Int.J.Cancer 30:597-601 /1986/; Macleod и др., Cancer Pesearch 44: 1784-1790 /1984/; Macleod и др., J.Nat. Cancer Inst. 74: 875-882 /1985/; Macleod и др. , Proc. Natl. Acad. Sci. VS A 83: 6989-6993 /1986/; Siegal и др., J. Exp. Med. 166: 1702-1715 /1987/.

Настоящее изобретение относится к новым ДНК-последовательностям, рекомбинантным ДНК /рРНК/-молекулам, способам получения новых T-клеточных белков, экспрессированных в процессе развития T-клеток; к новым, в основном, чистым T-клеточным белкам; и к антителам, которые связываются с указанными белками. В частности, настоящее изобретение относится к новым ДНК-последовательностям, экспрессированным в соответствующих хозяевах, а также к новым T-клеточным белкам, продуцированным в этих хозяевах. Настоящее изобретение также относится к новым трансмембранным белкам, являющимся, в основном, чистыми; к рДНК-молекулам, кодирующим указанные трансмембранные белки; и к способам продуцирования новых трансмембранных белков. ДНК-последовательности и рекомбинантные ДНК-молекулы настоящего изобретения отличаются тем, что они экспрессируются T-клетками лимфомы и имеют, по крайней мере, один из перечисленных ниже признаков, а именно: /1/ они экспрессируются в нормальном тимусе, в активированных клетках селезенки, или в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани; /2/ они экспрессируются в ткани яичника, нормальной ткани печени и/или эмбриональной ткани на определенной стадии развития; и /3/ они кодируют новые трансмембранные белки, имеющие множество мембранных промежуточных доменов.

В другом своем варианте настоящее изобретение относится к новому гену, 19,5, обозначаемому также Lov, который может быть индуцирован в клетках SL12.4 после совместного культивирования на эпителиальных монослоях тимуса. Настоящее изобретение также относится к поликлональным антителам против олигопептидной конструкции на основе Lov-последовательности кДНК. Индукция Lov, очевидно, является стабильной, поскольку клеточные клоны, выделенные из популяции клеток SL12.4 после сокультивирования, обнаруживают более высокий уровень экспрессии Lov в мРНК, а также более высокий уровень поверхностного белка. Ген Lov был картирован для мышиной хромосомы 16. Lov-генный продукт является эволюционно регулируемым и играет определенную роль в развитии T-клеток.

Была сконструирована кДНК-библиотека SL12.4, из которой были выделены шесть новых кДНК посредством субтрактивной гибридизации против сестринской клеточной линии лимфомы, SL12.3. Клетки SL12. 3 имеют признаки тимоцитов в более незрелой стадии развития, чем SL12. 4. Один из кДНК-клонов, 19. 5, экспрессировался в SL12.4, но не экспрессировался в SL12. 3-клетках. Эта последовательность была названа Lov /лимфоидная и овариально-клеточная экспрессия/. Предсказанный белок оказался в высокой степени гидрофобным, и как было установлено на основе компьютерного анализа, он содержит четыре трансмембранные промежуточные области. Причем, каких-либо значительных гомологий между Lov-кДНК, либо гомологий послеловательности предсказанного белка с другими известными последовательностями обнаружено не было. Lov является консервативным для таких видов млекопитающих, как, например, человек, грызуны, кролики, морские львы, а также для птиц; и в высокой степени экспрессируемым в яичниках и в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани /GALT/, а также в тимусе. В настоящей заявке раскрываются Lov-экспрессия и индуцируемость Lov в био-системе, физические свойства Lov-белка, а также локализация этого гена в мышиной хромосоме.

После получения ДНК-последовательностей и рекомбинантных ДНК-молекул настоящее изобретение также относится к зондам и способам идентификации клеток, содержащих или не содержащих эти последовательности, а также к средствам введения этих последовательностей в клетки, не содержащие данные последовательности. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу ингибирования экспрессии новых последовательностей путем получения антисмысловой РНК-последовательности, которая при введении в клетку, или при введении ДНК, кодирующий указанную антисмысловую РНК в клетку, содержащую указанную ДНК-последовательность, будет продуцировать антисмысловую РНК, которая может связываться, а следовательно и блокировать синтез РНК, кодирующей новые белки настоящего изобретения. Из раскрытия настоящего изобретения каждому специалисту будет понятно, что для блокирования связывания лигандов с белками и для доставки лекарственных средств или других агентов /таких, как метки/ в клетки, экспрессирующих эти белки, могут быть использованы антитела против любых белков настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к кДНК-клону, 20.5, обозначаемому в данной заявке также Tea /SEQ IDN0:5/, который позволяет идентифицировать транскрипты, обнаруживаемые лишь в ограниченном числе тканей. Tea-транскрипты индуцируются в спленоцитах, активированных T-клеточным митогеном КонА. В отличие от других известных генов, экспрессируемых в активированных T-клетках, Tea-ген очевидно кодирует белок, который пересекает мембрану несколько раз, тогда как большинство известных интегральных мембранных белков, индуцируемые при активации T-клеток, являются простыми мембранными белками с одной мембранной областью /Crabtree, 1989, Science, 243:355-361/.

Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования новых трансмембранных белков, являющихся, в основном, чистыми, которые могут быть использованы для регуляции развития T-клеток, для регуляции онкогенного фенотипа, а также для ингибирования активации T-клеток при аутоиммунном заболевании.

Новые кДНК-клоны, которые являются дифференциально экспрессированными между двумя близкими по сродству T-клеточными клонами лимфомы, были выделены с использованием дифференциального скрининга по методу исключения. Клетки SL12. 4, из которых выделяли кДНК, имеют признаки тимоцитов в промежуточной стадии развития и вызывают явно выраженные внеузловые овариальные опухоли у сингенных животных. Сестринский клеточный клон, SL12. 3, происходящий от этой же опухоли, имеет другой фенотип и вызывает более агрессивные, диффузные лимфомы. Четыре из пяти новых генов экспрессируются в нормальном тимусе, в активированных клетках селезенки, или в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани. ДНК-последовательности и предсказанные белковые последовательности для новых кДНК-клонов представлены на фиг. 3, 4, 15 - 18 и 33 - 37. Новые кДНК-клоны 19.5 обнаруживают мРНК в нормальном тимусе, в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани и овариальной ткани. Предсказанный белок имеет четыре предполагаемые трансмембранные промежуточные области. Экспрессия транскрипта подавляется в соматических клеточных гибридах, образованных из клеток SL12. 4, слитых с тремя различными T-клеточными линиями лимфомы, в которых отсутствует обнаруживаемая мРНК, комплементарная новому, кДНК-клону. Эта транс-негативная регуляция свидетельствует о том, что экспрессия гена регулируется по ингибирующему механизму.

На фиг. 1 иллюстрируют экспрессию 5 различных SL12. 4-специфичных кДНК-клонов с помощью Назерн-блоттинга; на фиг. 2 - гибридизацию методом Саузерн-блоттинга четырех различных SL12. 4-специфических кДНК-клонов; на фиг. 3 - 4 - ДНК и предсказанную белковую последовательность кДНК-клона 19.5 /SEQ IDN0: 4/. A, ДНК-последовательность и предсказанную аминокислотную последовательность получали с помощью двухцепочечного секвенирования. Для сборки ДНК-последовательности и получения предсказанной аминокислотной последовательности использовали Microgenie /Beckman/. B, показаны сайты рестрикции в кДНК для субклонирования, и стратегия секвенирования. Открытая рамка считывания показана пунктирной горизонтальной линией. Обе нити были секвенированы от интактной вставки и 4 субклонов с использованием праймеров для T3 и T7-областей плазмиды pT7T3 и одного синтетического олигонуклеотидного праймера. Для оценки физических свойств предсказанного белка и получения схематической структуры, показанной на фиг. 4c, использовали программы системы программного обеспечения PC Gene SOAP, HE LXMEM, NONOTNY и RAOARGOS.

На фиг. 5-6 иллюстрируют картины экспрессии кДНК 19. 5 и 20. 2 в гибридах соматических клеток, и 19. 5 в нормальной мышиной ткани; на фиг. 7 - с помощью метода "нозерн"-блоттинга, и с использованием последовательностей, комплементарных 19. 5, тот факт, что кДНК содержится в клеточных линиях карциномы яичника человека; на фиг. 8 - посредством Саузерн-блоттинга тот факт, что последовательности, комплементарные 19. 5, присутствуют во многих видах млекопитающих и являются, таким образом, консервативными в процессе развития; на фиг. 9 иллюстрируют посредством "нозерн"-блоттинга тот факт, что оба транскрипта Lov индуцируются в ответ на совместное культивирование; на фиг. 10 - анализ клеток SL12. 4 на поверхностную экспрессию Lov с использованием флуоресцентного антитела; на фиг. 11 - специфичность антитела 19. 5 для иммунизации антигена; на фиг. 12 - способность к индуцированию Lov-белка тимусными эпителиальными клетками; на фиг. 13 - стабильность Lov-экспрессии при "нозерн" блот- и FACS-анализах; на фиг. 14 иллюстрируют локализацию Lov в хромосоме 16; на фиг. 15 - 18 иллюстрируют ДНК и последовательность предсказанного белка клона кДНК 20. 5 /SEQ IDN0:5/; на фиг. 19 - экспрессию Tea-гена; на фиг. 20 - кинетику индукции Tea-гена в активированных спленоцитах; на фиг. 21 - 25 - сравнительный анализ кДНК-последовательностей 20. 5 и EPP; на фиг. 26 - 28 иллюстрируют сравнительный анализ Tea-последовательности предсказанного белка и рецепторной последовательности мышиного экотропного ретровируса.

На фиг. 29 - 30 иллюстрируют физические свойства предсказанных белковых продуктов Tea- и Rec-1-генов; на фиг. 31 - 32 иллюстрируют Саузерн-анализ ДНК от различных видов и анализ рекомбинантной инбредной ДНК на положение гена Tea на хромосоме 8; на фиг. 33 - ДНК и предсказанную белковую последовательность кДНК-клона 19. 1 /SEQ ID N0:1/; на фиг. 34 - ДНК и предсказанную белковую последовательность кДНК-клона 19. 2 /SEQ ID N0:2/; на фиг. 35 - 36 - ДНК- и предсказанную белковую последовательность кДНК-клона 19. 4 /SEQ ID N0: 3/; на фиг. 37 изображают схематическое представление pNEO/TfR-NC; на фиг. 38 изображают схематическое представление pMAMneoBlue.

В данном описании используется следующие термины: термин "хозяин" включает в себя не только прокариоты, но также и эукариоты, такие как дрожжи и нитевидные организмы, а также растительные и животные клетки; термин "прокариот" включает в себя все бактерии, которые могут быть трансформированы с помощью ДНК в целях экспрессии трансмембранных или рекомбинантных трансмембранных T-клеточных белков /ртТСР/ настоящего изобретения; термин "эукариот" включает в себя все дрожжи, грибки, животные и растительные клетки, которые могут быть трансформированы с помощью ДНК в целях экспрессии трансмембранных или рекомбинантных трансмембранных T-клеточных белков настоящего изобретения; ДНК для T-клеточных белков настоящего изобретения могут происходить от любых видов млекопитающих. При этом необходимо только, чтобы генетическая последовательность для T-клеточных белков /TCP/ экспрессировалась в прокариотическом или эукариотическом организме. Предпочтительной является T-клеточная ДНК, которая экспрессирует TCP-белки, происходящие от мыши. Особенно предпочтительной является последовательность T-клеточной ДНК, которая является иммунологически перекрестно реактивной между несколькими видами животных /например, таких как человек, мышь, кролик или морской лев/; рекомбинантная ДНК-молекула, кодирующая любой T-клеточный белок настоящего изобретения, может быть использована для трансформации хозяина с помощью стандартной техники, хорошо известной специалистам. Особенно предпочтительно использовать вектор, содержащий последовательность, кодирующую T-клеточные белки настоящего изобретения, в целях трансформации прокариота; рекомбинантный T-клеточный белок /pTCT/ настоящего изобретения может иметь больше или меньше аминокислот на фланкирующих концах по сравнению с аминокислотной последовательностью нативных T-клеточных белков; термин "в основном, чистый", используемый в отношении трансмембранного T-клеточного белка настоящего изобретения, означает, что полипептид, в основном, не содержит других белков, обычно ассоциированных с T-клеточным белком в его натуральном виде, и обнаруживает постоянный и репродуцируемый электрофоретический или хроматографический ответы, профили элюции, и антигенную активность. Термин "в основном, чистый" не включает в себя искусственные или синтетические смеси T-клеточного протеина с другими соединениями.

Способы получения слитых, правильно присоединенных генов, и их экспрессии в бактериях хорошо известны специалистам и описаны, например, в патенте США 4 366 246, который вводится в настоящее описание посредством ссылки. Генетические конструкции и методы, описанные в этом патенте, могут быть использованы для экспрессии трансмембранного T-клеточного белка в прокариотических или эукариотических хозяевах.

Прокариотическими хозяевами могут быть Грам-отрицательные а также Грам-положительные бактерии, такие как E. coli, S. tymphimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis.

Эукариотическими хозяевами могут быть дрожжи, такие как Pichia pastoris или клетки млекопитающих.

В основном, векторы экспрессии, содержащие промоторные последовательности для облегчения эффективной транскрипции вставленного ДНК-фрагмента, используются в соответствии с используемым хозяином. Вектор экспрессии обычно содержит начало репликации, промотор /промоторы/, терминатор /терминаторы/, а также специфические гены, обладающие способностью к фенотипической селекции в трансформированной клетке. Трансформированные хозяева могут быть подвергнуты ферментации или культивированию известными способами, обычно используемыми для достижения оптимального клеточного роста.

Примерами промоторов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении /при этом указанные примеры не ограничивают настоящее изобретение/, являются: rec A, trp, lac, tac, бактериофаг лямбда pR, или pL, MMTV, SV40. Примеры некоторых плазмид или бактериофагов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, приводятся в Molecular Cloning Maniatis и др., Cold Spring Harbor laboratories, 1982, и в других хорошо известных литературных источниках, и могут быть легко подобраны любым специалистом.

Настоящее изобретение относится к любому хозяину, модифицированному в соответствии с описанными способами, или модифицированному любым другим способом, обычно применяемым специалистами в таких случаях, например, путем переноса генетического материала с использованием лизогенного фага, и способствующим экспрессии гена, кодирующего трансмембранный T-клеточный белок, в прокариотах или эукариотах.

Ген представляет собой ДНК-последовательность, которая кодирует, посредством ее матрицы или матричной РНК, последовательность аминокислот специфического пептида. Термин кДНК включает в себя гены, из которых удалены интроны. Термин рДНК включает в себя молекулу, подвергнутую рекомбинации путем сплайсинга кДНК- или геномной ДНК-последовательностей in vitro.

Клонирующей системой является плазмидная или фаговая ДНК или другая ДНК-последовательность, которая способна к репликации в хозяйской клетке; которая содержит один или небольшое число сайтов, узнаваемых эндонуклеазой, в которых указанная ДНК-последовательность может быть разрезана без потери ее основной биологической функции; и которая содержит маркер, подходящий для использования в идентификации трансформированных клеток. Такими маркерами могут быть, например, устойчивость к тетрациклину, неомицину или ампициллину. Слово "вектор" иногда используется для обозначения системы клонирования.

Система экспрессии является аналогичной системе клонирования, но при этом она обладает способностью к экспрессии данного структурного гена в хозяине, обычно под контролем определенных регуляторных последовательностей.

Хозяева, трансформированные трансмембранными T-клеточным геномом для трансмембранных T-клеточных белков, являются особенно подходящими для продуцирования трансмембранных T-клеточных полипептидов и белков.

Рекомбинантный T-клеточный белок может содержать полную аминокислотную последовательность T-клеточного белка, или он может содержать лишь специфическую детерминанту. Животное, иммунизированное T-клеточным рекомбинантным белком, будет продуцировать антитела, которые будут связываться с детерминантами, присутствующими на рекомбинантном или натуральном полипептидах. Таким образом, может быть осуществлено промышленное производство T-клеточных рекомбинантных белков.

Термин "индивидуум", используемый в настоящем описании, подразумевает любое животное, предпочтительно, млекопитающее, а наиболее предпочтительно, такие как грызуны, кошки, собаки, коровы или человек.

Обнаруживаемыми метками могут быть любые обнаруживаемые молекулы. Обычно используются радиоактивные метки, примерами которых могут служить /однако, эти примеры не ограничивают настоящего изобретения/ ³²P, ³⁴C, ¹²⁵I, ³H, и ³⁵S. Биотин-меченные нуклеотиды могут быть введены в ДНК или РНК путем "ник"-трансляции, или с помощью ферментных или химических средств. Биотилированные зонды могут быть обнаружены после гибридизации с использованием авидин/стрептавидинового, флуоресцентного, ферментного конъюгатов или конъюгатов с коллоидальным золотом. Нуклеиновые кислоты могут быть также мечены другими флуоресцентными соединениями, иммунодетектируемыми флуоресцентными производными, или аналогами биотина. Нуклеиновые кислоты могут быть также меченными путем связывания белка. Могут быть также использованы нуклеиновые кислоты, сшитые с радиоактивным или флуоресцентным гистоном H1, ферментами /щелочной фосфатазой и пероксидазой/, или с белком путем однонитевого связывания /SSB/.

Таким образом, в настоящем изобретении антитело против трансмембранного T-клеточного белка используется в качестве зонда для трансмембранных белков настоящего изобретения, и в качестве ингибиторов связывания натуральных лигандов трансмембранных T-клеточных белков настоящего изобретения, а также в качестве системы, обеспечивающей доставку лекарственного препарата или метки к органу-мишени.

Два клеточных клона, происходящие от T-клеточной линии лимфомы SL12, выбирали для выделения новых дифференциально экспрессированных генов, исходя из известных различий в экспрессии генов и их различной способности вызывать образование опухолей у сингенных животных-хозяев /Hays и др., Int.J. Cancer 38: 597-601 /1986/; Macleod и др., Cancer Research 44: 1784-/1790/ 1784-1790 /1984/; Macleiod и др., J. Nat. Cancer Inst 74: 875-882 /1985/; Macleiod и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6989-6993; /1986/; Siegel и др., J. Exp. Med. 166: 1702-1715 /1987/; Weinzoth и др., Cancer Pesearch 45: 4804-4809 /1985/; Wilkinson и др., EMBO J. 7: 101-109 /1988/ и табл. 1, где систематизированы фенотипы/. Клеточная линия SL12. 3 экспрессирует очень небольшое количество генов, необходимых для функции T-клеток; при этом, эта линия клеток вызывает у сингенных животных образование в высокой степени злокачественных, диффузных, агрессивных опухолей. В противоположность этому, клетки SL12.4 экспрессируют мРНК для всех компонентов TCR/CD3-комплекса, за исключением TCP-альфа, и в некоторых отношениях, эти клетки аналогичны тимоцитам в промежуточной стадии развития указанных тимоцитов. Клетки SL12. 4 являются гораздо менее онкогенными и индуцируют истиные экстранодальные опухоли. У самок животных-хозяев, местом образования опухолей в первую очередь является яичник. Новые трансмембранные белки могут принимать участие в доставке опухолевых клеток к яичнику.

Новые кДНК-клоны выделяли из двух клеточных линий, отличающихся своей онкогенной способностью, способностью к "хомингу" и состоянием созревания. Эти кДНК-клоны представляют гены, которые кодируют продукты, связанные с различной способностью двух клеточных линий образовывать опухоли и/или гены, которые участвуют в развитии T-клеток. В настоящем изобретении раскрывается выделение и характеризация пяти новых кДНК-клонов, представляющих гены, которые предпочтительно экспрессируются в T-клеточном клоне SL12. 4, и не экспрессируются или очень незначительно экспрессируются в сестринском клеточном клоне SL12. 3. кДНК-клоны были получены путем комбинирования субтрактивной гибридизации обогащенных зондов и классического дифференциального скрининга. В настоящей заявке раскрываются новые кДНК-клоны, представляющие гены, дифференциально экспрессированные в двух клеточных клонах. Все из указанных генов экспрессируются в ограниченном количестве субпопулляций тканей. Некоторые транскрипты не находятся лишь исключительно в лимфоидных клетках, но указывают на порядок экспрессии. Последовательности двух кДНК /19. 5 и 20. 5/ /SEQ ID N: 4 и 5 соответственно/, свидетельствуют о том, что генными продуктами являются новые мембранные белки с несколькими промежуточными областями, экспрессирующиеся в нормальной ткани мышиного яичника, в тимусе, кишечной лимфоидной ткани, в селезенке и печени. Одна последовательность была также гибридизирована с клетками карциномы яичника человека и с нормальной тканью.

Для более ясного понимания настоящего изобретения ниже представлены примеры его осуществления. Эти примеры имеют лишь иллюстративный характер и ни в коем случае не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения, если, разумеется, это не оговорено особо.

Пример 1. Выделение, характеризация и культивирование клеток.

A. Клеточные линии лимфомы. Требования к выделению, характеризации и культивированию T-клеточных линий лимфомы SL12.1, SL12.3, SL12.4 и гибридов соматических клеток, образованных между ними, подробно описаны в следующих работах Hays и др., Int. J Cancer 38: 597-601 (1986); Macleod и др., Cancer Research 44: 1784-1790 (1984); Macleod и др. J. Nat. Cancer Inst. 74: 875-882 (1985); Macleod и др., Proc. Natl Acad, Sci. USA 83: 6989-6993 (1986) и Weinroth и др. , 1985, Cancer Rese arch 45: 4804-4809, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Суммарные данные по фенотипам клеточных клонов SL12.3 и SL12.4 представлены в табл. 1. Экспрессия транскрипта, экспрессия поверхностного белка, онкогенность и тип опухоли определяли с помощью "нозерн"-анализа, проточной цитометрии, и in vivo-инъекции клонированных клеток в сингенных животных, соответственно. 1,0 кв и 1,3 кв TCR - -транскрипты кодируют (D)-T-C- и V-D-T-C-последовательности, соответственно. Глюкокортикоидный ответ определяли посредством культивирования клеток в 1 мМ дексаметазоне.

Клетки SAK8 (Gasson и Bourgeois, T. Cell. Biol. 96, 409-415 (1983) были получены у Dr. Gasson. Клетки лимфомы культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла, дополненной 10% околоплодной сывороткой теленка, глутамином, пенициллином и стрептомицином. Две клеточные линии карциномы яичника человека 2008 (Disaea и др., Am. T. Obst et. Gynecol. 114: 979-989 (1972)) и COLO 316 (Woods и др., Cancer Res. 39: 4449-4459 (1979) культивировали в RPMI-среде 1640, дополненной 5% телячьей сывороткой, глутаминов, и 1% грибковой бактерии (Irvine Scientific, Santa Ana, CA). Когда клетки использовали для получения РНК, то эти клетки собирали в течение экспоненциального роста при плотности, близкой 5-8 10⁵ клеток/мл (Wilkinson, и Macleod, EMBO T. 7: 101-109 (1988). Спленоциты, происходящие от мышей BALB/с, засевали с плотностью 3 10⁶ клеток/мл и активировали 10 мкг/мл КонА в течение двух дней перед сбором РНК.

B. Совместное культивирование клеток SL12.4 и тимусных эпителиальных монослоев Условия совместного культивирования SL12.4-клеток и тимусных эпителиальных слоев, в общих чертах, являются следующими.

Клетки SL12.4 засевали при такой плотности, чтобы их конечная концентрация после 3-х дневного периода совместного культивирования составляла 1 10⁶ клеток/мл. На третий день культивирования, TEL или TEPI были в состоянии сплошности. Клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбенко среде Игла, содержащей 10% плодную сыворотку теленка и дополненной глутамином и пенициллином/стрептомицином, при 37^oC.

C. Клеточные линии для исследования экспрессии 20.5 В исследованиях экспрессии 20.5 были использованы клеточные линии из следующих источников: эмбриональные карциномы F9 и PCC4 (Bernstine и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 70: 3899-3903 (1973), опухоль гипофиза ATt20 (Buonassisi и др. , Proc, Natl. Acad Sci. USA 48: 1184-1192 (1962)), TEPI эпителия (Bearodsley и др. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 6005-6009 (1983)), эпителий млекопитающих (Evans, (1988) Science 240: 889-894) 12,9), 3TC (ATCC N 92), а MEF получали согласно описанию Freshney (Freshney, (1983), Culture of Animal Cells. Alan R. Liss, Inc. стр. 99 - 110). Клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбенко среде Игла, дополненной 10% околоплодной сывороткой теленка, глутамином, пенициллином и стрептомицином. Клетки, использованные для получения РНК, собирали в течение экспоненциального роста при плотности культур 5-8 10⁵ клеток/мл. Спленоциты, полученные от BALB/с мышей, засевали при 3 10⁶ клеток/мл в среду RPMI 1640, дополненную как указано выше, и активировали с помощью 10 мкг/мл КонА в течение 6, 24, 48 или 72 ч. перед сбором РНК.

Пример 2. Стратегия клонирования и скрининга.

Poly (A)⁺ мРНК от клеток SL12.4 использовали в качестве матрицы для получения двухцепочечной (дц) кДНК (Gubler и Hoffman, Gene 25: 263-269 (1983). К предварительно метилицированной дцДНК добавляли EcoRI-линкеры. Дефосфорилированные gt 10-плечи (stratagene) лигировали с кДНК и упаковывали в мябла-фаг с использованием экстракта упаковки Stratagene в соответствии с инструкциями производителей (Huynh и др., IN. D. Glover (изд.), DNA Cloning Techni gues : A Practical Approach. IRL. Press, Oxford. U. K. (1984)).

Субтрактивную гибридизацию осуществляли, в основном, в соответствии с описанием Hedrick и др., Nature 308: 149-153 (1984); Timberlake, Dev. Biol. 78: 497-503 (1980). Одноцепочечную кДНК получали из 10 мг поли (A)⁺РНК SL12.4 с использованием 250 мК³²P dCTP (Anmersham) в присутствии 100 мкг/мл актиномицина D и гибридизировали с Rot 1260 (молекула нуклеотида/литр сек) с 25 мг о (A)⁺РНК от клеток SL12.3 в объеме 8 мл при 68^oC в течение 18 ч. После гибридизации, оцкДНК собирали при помощи хроматографии на колонке с гидроксиапатитом. Из 1 мкг исходной кДНК SL12.4 выделяли приблизительно 120 нг (12% от исходной кДНК, содержащей 3 10⁷ им/мин) и использовали в качестве зонда для гибридизации с двумя 150 мм нитроцеллюлозными фильтрами, содержащими 20000 бляшек gt10 на фильтр. Первый из двух отпечатков дубликатных фильтров из библиотеки gt 10 SL12.4 зондировали с использованием всей кДНК от мРНК SL12.3, а отпечаток второго фильтра зондировали с использованием субтрактивно обогащенный кДНК, полученной, как описано выше. Используемая техника аналогична технике, описанной Filmus и др. Очищенные от бляшек клоны -фага идентифицировали на SL12.4-специфичность с помощью двух скринингов (используя отдельно полученные субтрактивные зонды). Затем проводили "Нозерн"-анализ для подтверждения того, что клоны гибридизировались только с мРНК из клеток SL12.4, а не из клеток SL12.3. Вставки кДНК удаляли из лямбда-ДНК путем переваривания рестриктирующими ферментами Hind III и Bg III, изолирования в легкоплавкой агарозе (Sea Kem) и субклонирования в плазмидный вектор pT7/T3 (Bethesda Research Laboratory), переваренный Hind III и BamHI. Вставки не могли быть вырезаны из фага посредством EcoRI, поскольку EcoRI-сайты были разрушены во всех изолятах Kuziel и др., Nucl.Acid Res 15: 3181 (1987).

Пример 3. "Нозерн" - блот-анализ.

A. Общие процедуры. Полную клеточную РНК выделяли из клеточных линий и тканей методом с использованием гуанидинизотиоцианата (Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harborlaboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк (1983), модифицированным в соответствии с описанием (Wilkinson и др., EMBO T. 7 : 101-109 (1988)). Для "Нозерн"-анализа, 10 мкг РНК подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, содержащем формальдегид, и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Meinkoth, Wahl, Anal, Biochem. 13: 267-284 (1984)).

Равную загрузку и перенос РНК на полосу анализировали путем окрашивания акридиновым оранжевым (Maniatis и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.J. (1983)) и путем гибридизации с актином, CHO-A и/или циклофиллином. "Нозерн" - блоты были гибридизированы со случайно праймированными (Amersham)³²P-меченными кДНК-вставками в присутствии 10% декстрансульфата и 50% формамида в течение 12 - 18 ч. при 42^oC, последовательно промывали с конечной 30-минутной промывкой в 0,1 SSPE, 0,1% ДНС при 42^oC или 50^oC. Для удаления меченного зонда РНК-блоты промывали 0,1 SSPE и 0,1% ДНС при 90^oC, охлаждали до комнатной температуры, осушали воздухом и хранили под вакуумом до следующей гибридизации.

B. "Нозерн"-анализ РНК (Lov (19,5). После совместного культивирования клетки SL12.4 собирали и лизировали в 4 М изотиоцианата гуанидиния, 1 М 2-меркаптоэтанола и 25 мМ ацетата натрия (pH 5,2). Затем лизат по