Иммуномодулирующий агент

Иммуномодулирующий агент

Реферат

 

Изобретение относится к медицине и касается иммуномодулирующего агента. Иммуномодулирующий агент, представляющий собой искомовую матрицу, не содержащую намеренных антигенов или антигенных детерминат, содержащий по крайней мере один липид и один сапонин, предпочтительно квил A, при этом в качестве сапонинов применяют сапонины из типа бета Амирина с 8-11 фрагментами карбогидрата с молекулярными весами 1988, 2150 и 1862. Технический результат заключается в разработке новых адъювантов. 5 з.п. ф-лы, 5 табл., 14 ил.

Изобретение касается матрицы, включающей по меньшей мере один липид и по меньшей мере один сапонин с иммуномодулирующим действием, способа получения этой основы, вакцины и медицинского комплекта, содержащего их и новые сапонины для ввода в основу (матрицу), и способа получения этих новых сапонинов.

В настоящее время современными технологическими методами могут быть получены многие микробные и вирусные антигены. Однако, их полные возможности в вакцине не могут реализоваться, если они не вводятся вместе с эффективным адъювантом, средством, которое не увеличивает реакцию антитела и/или связанную с клетками иммунную реакцию.

Единственными адъювантами, которые в настоящее время разрешены для использования для человека в большинстве стран, являются гидрат окиси алюминия и фосфат алюминия, которые в течение многих лет использовались для повышения реакций антитела, например, на токсоиды дифтерии и столбняка. Хотя эти адъюванты подходящи для многих вакцин, исследования показали, что на экспериментальных животных часто более эффективны для проявления реакции антитела и передаваемого клетками иммунитета полный адъювант Фрейда (FCA) и Квил А. Практически они часто требуются для защиты. Однако, FCA вызывает образование гранулемы в точках инъекции, ввиду чего он непригоден для приготовления вакцин для человека и для ветеринарного использования. Фактически, даже гидроокись алюминия может привести к реакциям в форме гранулемы в точках инъекции. По этим причинам сделано много попыток разработки адъювантов с эффективностью FCA, но без нежелательных побочных эффектов.

В патентных заявках EPC NN 83850273.0 и 85850326.1, описываются иммуногенные комплексы между антигенными детерминантами с гидрофобными участками и гликозидами, и среди них тритерпенсапонины и особенно Квил А, так называемые искомовые комплексы. В таком искоме количество Квил А может быть примерно в 10 - 100 раз меньше, и создается такой же антигенный эффект, как в том случае, когда Квил А в свободной форме смешивается с антигеном.

В европейской патентной заявке 87200035.1 говорится, что присутствие антигена необязательно для формирования основной искомовой структуры, она может быть образована из стерола, такого как холестерол, фосфолипида, такого как фосфатидилэтаноламин, и гликозида, такого как Квил А.

Было установлено, что фосфолипид необязателен для получения основной искомовой структуры, не содержащей антигена. Вместо него, стерол, такой как холестерол, в сочетании с гликозидом, таким как Квил А, являются основными структурными компонентами, собранными в комплекс, воспроизводящий типичную клеткообразную искомовую структуру, так называемую основу. Было также определено, что основа имеет иммуномодулирующие действия, такие как адъювантный или иммунноподовляющий эффект.

Настоящее изобретение касается комплекса, образованного между по меньшей мере одним липидом, таким как стерол, предпочтительно холестерол, и одним или несколькими сапонинами, такими как тритерпенсапонины, особенно Квил А или их субкомпоненты, не являющиеся липидной везикулой, без направленных антигенов или антигенных детерминант, для использования в качестве иммуномодулирующего агента. Таким образом, в данном случае не осуществляется интеграция какого-либо антигенного компонента, как это осуществляется в искоме. Эта основа имеет адъювантный эффект и может использоваться в смеси с одним или несколькими антигенами, предпочтительно в многомерной форме.

В данной искомой основе (матрице) возможна также интеграция других адъювантов с гидрофобными участками. Ввод других липид может быть необходим для ускорения инклюзии других адъювантов. Таким образом, настоящее изобретение охватывает также комплекс, включающий липиды и адъюванты иные чем холестерол и сапонины. Такие комплексы содержат матрицу, состоящую из холестерола и сапонина, предпочтительно Квила А и его субкомпонентов, один или несколько других адъювантов и один или несколько липидов иных чем холестерол. Они предпочтительно не являются липидными ведикулами или липосомами и имеют очень специфическую структуру при изучении с помощью электронного микроскопа.

Липосомы были описаны в литературе, и их общая структура хорошо известна для исследователей-биологов. Липосомы представляют собой ведикулы, включающие одну или несколько последовательных рядов липидных слоев, образующих луковичную структуру, отделенных друг от друга водным веществом.

Эта основа может быть введена путем инъекции в организм животного или человека в виде смеси с антигеном в многомерной форме. Как возможный вариант, основа и антиген могут быть инъекционно введены по отдельности. В этом случае наилучшие результаты получаются, если основа и антиген вводятся в тех участках, которые дренируются в одну и ту же лимфатическую железу. Когда адъювант находится в основе в многомерной форме согласно данному изобретению, то доза адъюванта может снижаться по сравнению с тем случаем, когда адъювант инъекционно вводится отдельно в одномерной форме или в неопределенной форме. Это означает, что токсические побочные эффекты, вызванные адъювантами при обычном использовании, например когда они вводятся инъекционно как таковые, могут быть снижены или исключены. Однако, доза адъюванта не может быть снижена в такой же мере, как в искомовых комплексах согласно указанным выше патентным заявкам.

При использовании адьюванта в основе согласно настоящему изобретению антиген не интегрируется в той же частице, что и адъювант, как это происходит в искомовой частице согласно указанным выше патентным заявкам EPC. Это означает, что можно использовать антиген без амфифатических свойств или антигенн, которые не вызывают воздействия на гидрофобные участки. Как пример, можно указать, что некоторые вирусы не имеют амфифатических белков, например пикорнавирус, аденовирус или парвовирус, но они имеют форму субмикроскопической частицы с антигеном, представляющим несколько копий (i), то есть мультимеры. Такие вирусы более практично вводить вместе с новым адъювантным комплексом, чем соединять с ними гидрофобные группы или создавать гидрофобные группы другими средствами (например частичной денатурацией) и интегрировать их в искомовую частицу.

Обычно данная основа содержит стерол, предпочтительно холестерол, и один или несколько сапонинов в малярном отношении примерно 1 и 1 или в весовом отношении примерно 1 к 5. Эти комплексы имеют открытую сферическую структуру, состоящую из круглых элементов или фрагментов сферической структуры, наблюдаемых с помощью электронного микроскопа. Их коэффициент седиментации составляет примерно 20S.

При интеграции других адюъвантов липидо-адъювантная основа обычно содержит стерол и сапонин в молярном отношении примерно 1:1 и другие адъюванты и липиды вместе друг с другом составляют примерно 1 мол. В случае такой основы молярное отношение стерол-сапонин: другой адъювант и липиды составляет примерно 1: 1. Так, молярное отношение стерол: сапонин, другие адъюванты и другие липиды составляет 1:1:0,1-1, то есть дополнительные липид или адъювант могут присутствовать в основе до тех пор, пока их молярное отношение (или сумма их молярных отношений) не составит половину от молярного отношения присутствующих сапонина и стерола.

Структура, определяемая посредством электронного микроскопа, такая же, как и у искома и основы (см. фиг. 1). Коэффициент седиментации, который зависит от плотности материала, вводимого в основу, составляет примерно 12-22 S для основ, содержащих холестерол, сапонин, другие адъюванты и липиды.

Сапонины могут представлять собой любой сапонин с гидрофобными участками, такой как, например, описан в публикации R.Tshesche и Welf. Chemie und Biologie der Saponin in Fortschkitte der Chemie Organis cher Naturstoffe, опубликовано W. Herz, H. Grisebach, G.W.Kirby, том 30, 1973 г., особенно сильно полярные сапонины, главным образом полярные тритерпенсапонины, такие как полярные кислотные бисдесмозиды, например сапониновый экстракт из Кваллажабарк Аралозида А, Чикосетсусапонин IY, Календула-Гликозид С. Чикосет-сусапонин У, Ачирантес-Сапонин В, Календула-Гликозид А, Аралозид В, Аралозид С, Путранжиа-Сапонин III, Берсама-сапонизид, Путражиа-Сапонин IV, Трихозид А, Трихозид В, Сапоназид А, Трихозид С, Гипсозид, Нутанозид, Диантозид С, Сапоназид D, предпочтительно аэсцин из Аэскулус хиппокастанум (T. Patt и Winkler Das therapeutisch wiersame Reinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum), Arzneimittelforchung 10(4), 273-275(1960), или сапоалбин из Гипософилла струтиум (R.Vochten, P. Joos, R. Ruyssen: физико-химические свойства сапоалбина и их связь со стабильностью пены. J. Pharm/ Belg, 42, 213- 226, 1968 г., особенно сапониновый экстракт из Квиллажа сапонариа Молина, главным образом DQ - экстракт, который получается согласно K. Dalsgaakd: Сапониновые Адъюванты. Bull off Jnt. Epiz 77(7-8), 1289-1295 (1972) и Квил А, который получается согласно K.Dalsgaard: Сапониновые адъюванты III, Archiv fur die Gesamte Virusforschung 44, 243-254, 1974 г. Предпочтительны Квил А и его субфрагменты, особенно фрагменты В2, В3 и В4В, описанные ниже.

Настоящее изобретение охватывает также новые гликозилированные тритерпеноидные сапонины, образованные из Квиллажа Сапонариа Моллина типа Бета Амирин с группами карбогидрата 8-11, которые имеют следующие характеристики: а) Вещество В2 имеет молекулярную массу 1988. Спектр ¹³С ЯМР как показано на фиг. 5A и 6A, и ¹H ЯМР как показано на фиг. 11А и 12А.

b) Вещество В3 имеет молекулярную массу 2150 и имеет спектр ¹³C ЯМР как показано на фиг. 5B и 6B и спектр ¹H ЯМР как показано на фиг. 11B и 12B.

с) Вещество B4B имеет молекулярную массу 1862, спектр ¹³C ЯМР как показано на фиг. 5C и 6C, и спектр ¹H ЯМР как показано на фиг. 11C и 12C.

Соединения B2 и B3 имеют достаточно высокую адъювантную активность. Таким образом, настоящее изобретение охватывает также использование этих соединений в качестве адъювантов. Соединение B4B применяется для приготовления искомовой основы. В эту основу могут быть включены соединения B2 и B3, имеющие адъювантную активность.

Основа может быть приготовлена из стерола, такого как холестерол, и сапонина B4B. Такая основа не обнаруживает сильной адъювантной активности. Для того, чтобы придать адъювантную активность данной основе, можно или даже желательно интегрировать сапонин B2 и/или B3 и/или любое другое вещество с адъювантным эффектом и с гидрофобными группами. Если адъюванты не содержат никаких гидрофобных групп, такие группы могут быть связаны с ними известными химическими методами. При интеграции иных адъювантов, чем B2 или B3, они предпочтительно заключают в себе другие липиды, приведенные на стр. 13, последний абзац и на стр. 14, абз. 1-3.

В стероло-B4B основе также возможно интегрировать иммуносуппрессивные вещества, содержащие гидрофобные группы или с которыми такие группы были сопряжено связаны.

Можно также использовать стероло-B4B основу как иммуномодулирующий агент в смеси с адъювантами, иммуносупрессивные вещества или антигены или их смеси.

В качестве иммунномодулирующих агентов могут использоваться вещества, которые усиливают, подавляют или изменяют иммунную систему, такую как адъюванты, подавители, интерлейкины, интерфероны и другие цитокины.

Настоящее изобретение касается предпочтительно основы, содержащей стерол, особенно холестерол, B4B и любой из B2 и B3 или оба. Когда основа приготавливается из холестерола и Квила А, она включает B2, B3 и B4B.

Основы могут быть получены путем солюбилизации по меньшей мере одного стерола в растворителе, ввода сапонина или сапонинов и возможно других адъювантов и липидов, после чего растворитель должен быть удален и основа трансформируется в раствор, в котором ее компоненты нерастворимы, например в водный раствор. Это может осуществляться путем гель-фильтрации, ультрафильтрации, диализа или электрофореза. Затем основы должны быть освобождены от избытка стерола и Квила A путем, например центрифугирования через градиент плотности, или путем гель-фильтрации. В качестве растворителя могут быть использованы вода, солюбилизирующие агенты или моющие средства, описанные ниже.

Единственным ограничивающим фактором, который имеет место при изготовлении основы, является время, необходимое в различных физико-химических условиях, причем основным ограничивающим скорость фактором является слабая растворимость стерола, например холестерола, в воде, в которой легко растворимы образующие основу сапонины.

Так, было показано, что в случае Квил A и холестерола даже в твердой фазе имеет место образование основы по прошествии относительно длительного периода времени, например примерно 1 месяца. Холестерол должен быть приведен в контакт с Квилом A или с его очищенными компонентами. Если холестерол переводится в коллоидную водную суспензию путем обработки ультрапрозвучиванием и путем обработки ультра-турракс, то образуется основа вместе с Квилом A по прошествии примерно 12 часов.

Таким образом, любое другое вещество, например моющее средство, вводимое в воду, которое увеличивает растворимость холестерола в водной среде, будет снижать время, необходимое для образования основы. Таким образом, возможно получение основы из холестерола, воды и Квила A или его компонентов, если холестерол переводится в коллоидальную форму. Однако, более практично добавлять моющее вещество или растворитель.

Сапонины используются предпочтительно в концентрации не менее, чем в концентрации их критического минеллообразования (СМС). Для Квила A это означает концентрацию не менее, чем 0,03 мас.%.

В качестве столюбилизирующего агента могут использоваться моющие средства такие, как неионные, ионные, то есть катионные или анионные или Цвиттер-ионные моющие средства, такие как Цвиттергенты или моющие средства на основе галлиевой кислоты, которая применяется в избытке. Типичными примерами подходящих неионных моющих средств являются N-алканоил-N-алкил-глюкамины, сложные и простые эфиры многоатомных спиртов с алифатическими или аралифатическими кислотами и спирты. Примерами их являются алкилполиоксиэтиленовые простые эфиры общей формулы C_nH_2n+1(OCH₂CH₂)_xOH, сокращенно называемые C_лE_x; алкилфенилполиоксиэтиленовые простые эфиры, содержащие фенильное кольцо между алкильной группой и полиоксиэтиленовой цепью, кратко называемые C_лФE_х, например Тритон X-100-трет-G₈E_9,6 (октилфенольный простой эфир или полиэтиленоксид), ацилполиоксиэтиленовые сложные эфиры; ацилполиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры, кратко называемые C_n сорбитаном E_х, например Твин 20, Твин 80, -D-алкилглюкозиды, например -D-октилглюкозид. Типичными примерами подходящих ионных моющих средств являются галлиевая кислота, например холевая кислота, дезоксихолат, холат и СТАВ (цетилтриаммонийбромид). Могут использоваться даже сопряженно связанные моющие средства, такие как тауродеоксихолат, гликодеоксихолат и гликохолат. Другими возможными солюбилизирующими агентами являются лизолектин и искусственные лизофосфолипиды. Могут использоваться даже смеси указанных выше моющих средств. При осуществлении метода диализа моющие средства должны диализироваться в течение не слишком длительного периода времени.

Некоторые поверхностно-активные вещества значительно ускоряют образование основы. Они включают липиды внутренней биологической мембраны с полярной основной группой и неполярной алифатической цепью, например фосфатидилхолин (с отрицательным зарядом) и фосфатидилэтаноламин (с положительным зарядом).

Солюбилизация может также осуществляться спиртами, органическими растворителями или небольшими алифатическими молекулами, такими как гептан-1,2,3-триол, гексан-1.2,3-триол или кастрофическими веществами, уксусной кислотой, такими как трифер торуксусной кислотой, трихлоруксусной кислотой, мочевиной или гуанидинхлоргидратом.

Предпочтительными для данного использования являются этиловый спирт, диоксан, простой эфир, хлороформ, ацетон, бензол, уксусная кислота, дисульфид углерода, MEGA-10 (N-деканоил-N-метилглюкамин) и -октилглюкозид.

При использовании этих веществ могут быть получены различные выходы основы, и общая картина такова, что чем больше образуется основы, выше концентрация моющего средства в системе.

Имеется техническая возможность получения, очистки и стерилизации основы в любой описанной системе. Следовательно, адъювантно активные технические препараты могут содержать солюбилизирующие агенты, если их химическая природа и их концентрация допустимы в конечном продукте, например для целей вактинации. Однако, во многих случаях необходимо удалять солюбилизирующий агент из основы путем диализа, ультрафильтрации или хроматографии в колонке. Возможно даже разбавление препарата до тех пор, пока не будет достигнута допускаемая концентрация данного солюбилизирующего агента или моющего средства. Этот препарат разбавляется в воде или в физиологически приемлемом растворе предпочтительно до концентрации ниже СМС для солюбилизирующего агента или моющего средства в данной используемой системе (препарате).

Солюбилизирующий агент может вводиться в основу при молярном отношении стерол : сапонин : дополнительные липидные адъюванты или солюбилизирующий агент как 1:1:1, то есть при молярном отношении суммы липида, адъювантов и солюбилизирующего агента, составляющем половину от молярного отношения сапонина и стерола.

Кроме того, солюбилизирующий агент может оставаться смешанным с искомовой основой.

Для интеграции солюбилизирующего агента и других иммуномодулирующих компонентов должна быть по меньшей мере одна гидрофобная зона. Если их нет, то такие гидрофобные зоны должны быть сопряжены с данными компонентами до приготовления основы.

Примерами адъювантов, которые могут вводится в искомовую основу, являются любые адъюванты, естественные или искусственные, с желаемым иммуномодулирующим действием, например производные мурамилдипептида (MDP), такие как жирная кислота, замещенный MDP, треониловые аналоги MDP, амфипатические сополимеры, алифатические амины, такие как авридин или DDA, полианионы, такие как Декстрансульфат, липополисахариды, такие как сапонины (иные, чем Квил A). ("Будущие перспективы для вакциновых адъювантов" Warren H.S., 1988 г., CRC Crif. Rev. Jmmunol., 8; 2; 83-101; Определение характеристик нетоксичного монофосфорилолипида A" 1987 г., Johnson A.G. и др., Rev. Jnfect. Dis. 9: 5, 5512-5516: "Разрабатывающееся положение об искусственных иммуномодуляторах", Berendt M.J. и др., 1985 г., Jear Jmmunol. 193-201; "Иммунопотенциирующие коньюгаты", Steworf-Tull D.E. Vaccine, 85, 3:1, 40-44).

Эти четыре публикации приводятся здесь как ссылочный библиографический материал.

Указанные ниже цвиттерионные, нейтральные, положительные и отрицательные моющие средства являются примерами моющих средств, которые имеют иммуномодулирующее, особенно адъювантное, действие.

Неонные блок-полимерные поверхностно-активные вещества, включающие гидрофильный полиоксиэтилен (POE) и гидрофобный полиоксипропилен (POP), которые различаются по молярному весовому проценту POE и типу связывания POP с POE (фирма BASF Wyandotle Corp.), такие как L 72, L 81, L 92, плюронические L 101, L 121, 2531 и 31R1; октаблоки T1501; B-D-октилглюкозид, катионные поверхностно-активные вещества, такие как диметилдиоктадециламмонийбромид (DDA), октадециламин (OCT) и цетилтриметиламмонийбромид (CTAB); мальтозотетрапальмитат, трегалозомономикаолат, трегалозодибегенилбегенат: ивиттергентные моющие средства (N-алкил-N,N-диметиламмонио-3-пропансульфонат) Z 3-8, Z 3-10, Z 3-12, Z 3-14, Z 3-16, получаемые фирмой Calbiochem (La Jolla, CA, США); Z 3-18, получаемые фирмой Serva (Гейдельберг, ФРГ), Myry 45, Brij 52, Brij 58 (также получаемые фирмой Serva), и диоктилсульфосукцинат и Твин 20, Твин 80, Тритон X-100 и натрий/деоксихолат.

Эти моющие средства могут использоваться и как моющие средства и как адъюванты, и они могут вводиться в искомовую основу.

Ниже даются примеры иммуносуппрессивных агентов, которые могут вводиться в стерольную (предпочтительно холестерольную) B4B основу: циклоспорин A, диодецилдиметиламмонийбромид, катионные одноцепные амфифилы с более, чем 10 атомами углерода, предпочтительно более, чем с 15 атомами углерода, двухцепные амфифилы с содержанием вплоть до 14 атомов углерода, предпочтительно вплоть до 12 атомов углерода.

В случае, когда желаемый адъювант или иммунносуппрессивный агент не обладает желаемыми гидрофобными свойствами, он должен быть модифицирован таким образом, чтобы включать гидрофобный участок для ввода в основу.

Гидрофобные группы, которые могут быть сопряженно связаны с негидрофобными адъювантами, представляют собой прямые, разветвленные, насыщенные или ненасыщенные алифатические углеродные цепи, содержащие 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 25 атомов углерода, такие как липиды, предпочтительно содержащие 6,7 и 8 атомов углерода; небольшие пептиды с содержанием 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, предпочтительно 2, 3, 4 аминокислоты, выбранные из числа Trp, Ile, Phe, Pro, Tyr, Leu, Var, особенно Tyr; холиновая кислота, урсодезоксихолиновая кислота или холестерольные производные.

Эти гидрофобные группы должны быть связаны с группой, которая может сопряженно связываться с негидрофобным белком, например такой как карбоксильная, амино, дисульфидная, гидроксильная, сульфгидрильная и карбонильная группа, например альдегидными группами.

В качестве гидрофобных групп, которые могут сопряженно связываться, выбираются предпочтительно карбоксильные, альдегидные, амино, гидроксильные и дисульфидные производные метана, этана, пропана, бутана, гексана, гептана, октана, и пептиды, содержащие Cys, Asp, Glu, Lys, предпочтительно октанал и Tyr, Tyr, Tyr-Cys. - Asp или Glu. Гидрофобные группы с группами, которые могут сопряженно связываться, должны растворяться в воде с помощью, например, солюбилизирующих агентов и моющих средств, указанных выше, или соляной кислоты, уксусной кислоты, 67 об.% уксусной кислоты, жидкого каустика, аммиака, в зависимости от того, какое вещество должно быть растворено. Величина pH в таком случае доводится до нейтральной без предварительного осаждения вещества; при этом должна быть гарантия, что не получается такая величина pH, которая денатурирует белок, с которым должна сопряженно связываться гидрофобная группа.

Гидрофобные группы с карбоксильной группой как сопрягающей молекулой могут сопряженно связываться с адъювантами посредством водорастворимых карбодиимидов или смешанных ангидридов. В первом случае карбоксильная группа активируется при величине pH, равной 5 карбодиимидом и смешивается с белком, растворенным в буфере с pH 8 с высоким содержанием фосфата. В последнем случае карбоксильное соединение реагирует с изобутилхлорформатом в присутствии триэтиламина в диоксане или ацетонитриле, и полученный ангидрид вводится в белок при величине pH, равной 8 и 9. Можно также превращать карбоксильную группу с гидразином в гидразид, который вместе с альдегидами и кетонами в окисленных периодатом сахарных молекулярных звеньях в белке дает гидразоновые связи.

Аминогруппы с азотистой кислотой при низкой температуре могут быть превращены в диазониевые соли, которые дают азо связи с Tyr, His и Lys.

Гидроксильные группы с ангидридом янтарной кислоты могут быть превращены в полусукцинатные производные, которые могут сопряженно связываться как карбоксильные группы.

Альдегидные группы могут реагировать с аминогруппами в белке до основания Шиффа.

Некоторые сопрягаются группы и способы сопряжения описываются в публикации Journal of Jmmunological Methods, 59 (1983), 129-143, 289-299, Methods in Enzymolog, том 93, стр. 380-33, и в Analitical Biochemistry, 116, 402-407, 1981 г., которые приводятся здесь как библиографический ссылочный материал.

Липиды иные, чем стирол, могут быть жирами или веществами, похожими на жиры, такими как триглицериды или смешанные триглинериды, содержащие жирные кислоты, включающие до 50 атомов углерода, например насыщенные жирные кислоты, включающие 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и 30 атомов углерода, например масляная кислота, капроновая кислота, каприловая кислота, каприновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота, бегеновая кислота, лигноцеривная кислота, или ненасыщенные жирные кислоты с содержанием вплоть до 30 атомов углерода, такие как гексадеценовая кислота, олеиновая кислота, линолевая кислота, линоленовая кислота, арахидоновая кислота; оксижирные кислоты, такие как 9,10-диоксистеариновая кислота, ненасыщенные оксижирные кислоты, такие как касторовое масло, жирные кислоты с разветвленной цепью; простые эфиры глицерина, парафины, например сложные эфиры высших жирных кислот и одноосновных спиртов; фосфолипиды, такие как производные глицеринфталатов, например производные фосфатидных кислот, например лектицин, цефалин, инозитолфосфатиды, спингозиновые производные, содержащие 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20 атомов углерода; гликолипидоизопреноиды, сульфолипиды, каротеноиды, стероиды, стеролы, холестанол, капростанол, фитостеролы, например стигмастерол, ситостерол, микостеролы, например эргостерол, желчные кислоты, например холевая кислота, деоксихолевая кислота, хенодеоксихолевая кислота, литохолевая кислота, гликозиды стероида, сложные эфиры витамина A или их смеси.

Эти и другие полезно используемые липиды описываются в публикации: "Lipid Biochemistery and introduction", Ред. M.J.Gurr, A.J.James, 1980 г., Charman and Hall, Лондон, Нью Йорк, University Rress Cambridge, которая приводится здесь как ссылочный материал.

Используются предпочтительно холестеролфосфатидилхолин, липосомы или интралипид (фракция Oleum Soga 200 г., фракция Lechitinum vitello Ovi 12 г, глицерин 22,5 г., и H₂O до общего объема 1 литр).

Липиды могут вводиться на любой стадии в данном процессе, предпочтительно до ввода сапонина, но могут вводиться также и после ввода сапонина.

Основа наилучшим образом получается путем диализа, как описано ниже.

Холестерол, растворенный в 20% MEGA-10 или любом другом подходящем моющем средстве, предпочтительно в моющем средстве, которое может быть удалено путем диализа, например в -октилглюкозиде (в H₂O или подходящем буфере) смешивается с пятикратным количеством Квил A (твердым или растворенным в воде или подходящем буфере, например PBS). Эта смесь широко диализируется через PBS сначала в течение ночи при комнатной температуре (поскольку MEGA-10 осаждается при +4^oC), затем при +4^oC. Смеси очищаются от избытка Увил A и холестерола путем осаждения, например, в 30% (мас/мас) сахарозы (например ротор TST 41.13, 18 часов, 39000 об/мин, 10^oC). Осажденные смеси растворяются в PBS (или любом другом подходящем буфере) и концентрация доводится до 1 мг/мл).

Данная основа может использоваться как иммуномодулирующее вещество. Она может использоваться как потенцирующий агент для иммуносуппрессивного вещества или адъюванта, либо смешиваемого с основой либо интерованного в основу.

Основа, содержащая стерол, такой как холестерол, сапонины, адъюванты и при желании другие липиды, может быть использована как адъювант. Она может быть использована для потенциирования антигенного эффекта любого антигена или антигенных детерминант от патогенного организма или любых их фрагментов или субъединин или образованных от них фрагментов или субъединин. Так, она может быть использована как адъювант для тех антигенов, которые интегрируются в искому. Такие антигены описывались в патентных заявках EPC NN 83850273.0 и 85850326.1, рассматриваемых здесь как ссылочные материалы. Так, данная основа может использоваться как адъюванты вместе с антигенами или антигенными детерминантами, образованными от вирусов с оболочкой или без нее, бактерий, протозойных организмов, микоплазм, моллюсков или вместе с такими полными организмами. Кроме того, антигены или антигенные детерминанты могут быть гормонами, ферментами, карбогидратами и содержащими карбогидрат структурами, такими как липополисахариды, пептиды или белки или их рекомбинанты.

Настоящее изобретение охватывает также лечебные препараты для лечения людей или для ветеринарного применения, отличающиеся тем, что содержат по меньшей мере одну основу и один или несколько антигенных или иммуносуппрессивных веществ, и фармацевтически пригодный носитель в смеси или в отдельных отсеках.

Настоящее изобретение охватывает также вакцины, включающие основу, один или несколько антигенов и фармацевтически пригодный носитель.

Далее, настоящее изобретение охватывает набор средств, включающий указанный лечебный препарат или вакцину.

В некоторых лечебных препаратах или вакцинах может присутствовать моющее средство, используемое при приготовлении основы, если это моющее средство приемлемо для данного продукта.

Далее при описании экспериментов иммуностимуляции будет иллюстрироваться действие нового адъювантного комплекса, отвечающего настоящему изобретению.

1. Сравнение иммуногенных эффектов от антигенов, представленных как искомы, минеллы или мицеллы плюс новая основа.

Мыши подвергались иммуннизации белком оболочки от вируса гриппа в форме искомового комплекса, минелл или минеллы вместе с новым комплексом согласно данному изобретению (так называемой основой). Иммунная реакция оценивалась по определению антител методом иммуноферментного твердофазного анализа (EL ISA) через 15, 30, 44 и 50 дней после инъекции. Осуществлялись следующие инъекции: 1. 5 мкг Мицелл + 0,1 мкг основы смешивались и вводились путем инъекции в левую переднюю ногу.

2. 5 мкг Минелл + 0,1 мкг основы вводились путем инъекции по отдельности в правую и в левую передние ноги, соответственно.

3. 5 мкг минелл 4. 5 мкг искомы приготавливали согласно ЕРС 83850273.0 (см. табл. 1).

Никаких побочных эффектов в форме локальных реакций не обнаружено.

На основании данного эксперимента можно сделать вывод, что белок оболочки от вируса гриппа в форме искома или мицелл плюс основа дает наибольшие титры антитела. Основа может присутствовать в очень низких дозах, и все же будет иметь адъювантный эффект. Для того, чтобы достигался адъювантный эффект у мышей, необходим Квил A в свободной форме дозой в 100 раз превышающей дозу основы, то есть 10 мкг. При такой дозе Квил A начинает давать локальные побочные реакции. Для того, чтобы основа имела явный адъювантный эффект, антиген в многомерной форме должен быть инъекционно введен в то же место, например в ногу, что и основа, то есть инъекционно вводимые комплекс адъювантной основы и антиген должны находиться в одном месте, иначе говоря они должны вводиться в одну и ту же лимфатическую железу.

2. Сравнение иммуногенных эффектов от белка оболочки от вируса гриппа в форме искомы или мицеллы с основой или дифтеритоксоидом (DT) или без них.

В организм мышей инъекционно вводили белок оболочки в следующих формах: 1. 5 мкг искомы + 5 мкг DT 2. 5 мкг искомы 3. 5 мкг мицелл 4. 5 мкг мицелл + 0,01 мкг основы.

Реакция антитела в белках оболочки определялась в сыворотке методом иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Получены нижеследующие результаты (см. табл. 2).

Никаких видимых побочных эффектов в форме локальных реакций не обнаружено.

Можно сделать вывод, что белок оболочки от вируса гриппа в форме искомы или мицелл плюс адъювантный комплекс (основа) согласно настоящему изобретению, дает наибольшие титры антитела. Доза основы может поддерживаться очень низкой, например 0,1 мкг и все же она будет иметь значительный адьювантный эффект.

3. Сравнение иммуногенных эффектов от дифтеритного токсоида DT в одномерной форме, одномерного DT + искомы с содержанием белка оболочки от вируса гриппа, одномерного DT в смеси с Квил А, и от холестерола и одновременно DT плюс адъювантного комплекса (основа) согласно настоящему изобретению.

В данном эксперименте дифтеритные токсоиды используются как модельный антиген в одномерной форме.

В организм мышей инъекционно вводится дифтеритный токсоид в нижеследующих формах: 1. 5 мкг DT (дифтеритный токсоид).

2. 5 мкг DT + 5 мкг искомы.

3. 5 мкг DT +0,5 мкг Квил А + 0,1 мкг CL (холестерол).

4. 5 мкг DT + 0,1 мкг основы (см. табл.3).

Иммуногенная реакция на DT очень низкая во всех группах. Наилучший результат получается на мышах, иммунизированных дифтеритным токсоидом плюс основой согласно данному изобретению.

Из проведенных как описано выше экспериментов можно сделать заключением, что наилучшие результаты получаются, когда основа, отвечающая настоящему изобретению, используется вместе с антигеном в многомерной форме. Таким образом, основа, отвечающая данному изобретению, дает очень хорошие результаты как адъювант по сравнению, например, с Квил А в свободной форме. Так например, следует отметить, что Квил А эффективен как адъювант в свободной форме в дозах, например, 10 мкг для мышей, 50 мкг для морских свинок и 1 мтг для крупного рогатого скота. Практический объем для инъекции вакцины составляет 1 мл для небольших животных и 2 - 5 или 10 мл для больших животных. Когда СМС (критическая концентрация мицелл) для Квил А составляет 0,03%, 1 мл будет давать количество 300 мкг при инъекции 1 миллилитра. Однако, после инъекции, за счет эффекта разбавления концентрация будет становиться ниже, чем СМС, и мицелла будет становиться неустойчивой.

Однако, согласно настоящему изобретению молекулы сапонина и особенно Квил А будут связываться вместе с молекулами холестерола таким образом, что будет образовываться относительно устойчивый комплекс в очень низких концентрациях. Этот комплекс эффективен как адъювант в дозе, которая соответствует 0,1 мкг Квила А, то есть в 100 раз меньше, чем когда Квил А присутствует в свободной форме.

Фигуры иллюстрируют: Фиг. 1. Изображение электронномикроскопической картины типичной основы.

Фиг. 2. Линии ультрафиолетового спектра для субфракций Квила А.

Фиг. 3. Разделение Квила А и его субфракций методом тонкослойной хроматографии высокого разрешения (HPTLC).

Фиг. 4. FAB-масс-спектры новых веществ, отвечающих данному изобретению.

Фиг. 5 и 6. Спектры ¹³С ЯМР (2 зоны) новых веществ.

Фиг. 7, 8 и 9. Полные ¹³С-ЯМР спектры соответственно B2, B3 и B4B.

Фиг. 10. -амириновый скелет.

Фиг. 11 и 12. ¹Н ЯМР спектры новых веществ.

Фиг. 13. Части спектра, показанного на фиг. 7 и 8; и Фиг. 14. Двухмерный ЯМР-спектр для вещества B3.

Далее настоящее изобретение описывается со ссылкой на нижеследующий пример.

Пример 1.

Основа (комплекс Холестерол-Квил А).

1 мг холестерола, растворенного в 20% MEGA-10 (в H₂O) смешивали с 5 мг твердого Квила А. Квил А растворялся, и смесь широко диализировалась через PBS, сначала в течение ночи при комнатной температуре, затем при +4^oC. Искомовые основы очищались от избытка Квила А и холестерола путем осаждения в 30% (вес/вес) сахарозе (ротор TST 41.13, 18 час, 39000 об/мин, 10^oC). Осажденные основы растворялись в PBS, и концентрация доводилась до значения 1 мг/мл (оцениваемая по небольшому количеству ³H-холестерола).

Пример 2.

MDP (мурамилдипептид, Сигма, адьювантный пептид) коньюгировался с фосфатидилэтаноламином (PEA), с использованием N-этил-N'-(диметиламинопропил)карбодиимидхлоргидрата, как описано Lefrancier и др., 1977 г. (Lefrancier P., Choay J., Derrien M., Lederman I. 1977 г., Int. J. peptide Protein Res, 9, 249-257).

В 1 мг холестерола (в 20% MEGA-10 в H₂O) вводили равномолярное количество MDP-PEA (в MEGA-10 или диметилсульфоксиде или каком-либо другом смешиваемом с водой растворителе), равномолярное количество фосфатидилхолина и 7 мг Квила А (небольшой избыток по сравнению с 5 мг, которые требуются для образования 1М). После короткого инкубационного периода при комнатной температуре (15-30 минут) смесь широко диализировалась с использованием PBS (комнатная температура 4-12 часов, затем +4^oC).

После прекращения диализа комплексы основы с ин