Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты)

Способ получения представляющего интерес полипептида, гибридная днк (варианты), слитый белок (варианты)

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к способам получения рекомбинантных полипептидов через промежуточную форму слитого белка. Предлагаемый способ предусматривает создание гибридной ДНК-конструкции, кодирующей белок, в котором две полипептидные последовательности связаны переходной областью, содержащей сайт распознавания Ig A-протеазой, трансформацию хозяйских клеток рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим названную конструкцию, выделение полученного слитого белка, обработку его Ig A-протеазой при весовом соотношении фермента и субстрата от 1:1 до 100:1 и pH 6,5 - 8,5 и изолирование представляющего интерес полипептида. Получены, охарактеризованы и испытаны конкретные формы гибридных ДНК и слитых белков. Изобретение обеспечивает возможность получения представляющих интерес полипептидов в безметиониновой форме, а также позволяет повысить уровень их экспрессии и степень очистки. 11 с. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к способу для поледовательноспецифического расщепления полученных биотехнологией протеинов с применением IgA-протеаз (называемых также и газами) и особенно к способу для получения рекомбинантных протеинов или пептидов в прокариотах и к последующему удалению N-концевой последовательности.

Получение протеинов методом биотехнологии осуществляют с применением микроорганизмов, которые легко культивируются и позволяют простым путем получать протеин. Подходящими микроорганизмами являются для этого, например, грамотрицательная бактерия Escherichia coli, грамположительная бактерия Streptococcus carnosus и хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Однако экспрессия аутентичных чужеродных генов в таких микроорганизмах часто имеет недостатки. Например в E. coli обусловленный трансляцией аминоконцевой остаток метионина природных протеинов протеза в большинстве случаев эффективно отщепляется. Однако при чужеродных белках это отщепление первого остатка метионина происходит в большинстве случаев параллельно. Поэтому подходящим методом является получение таких протеинов с определенным аминоконцом, их образование сначала в форме слившихся протеинов и затем их отщепление посредством определенной последовательноспецифической протеазы.

Кроме того, в противоположность аутентичным протеинам такие слившиеся протеины имеют то преимущество, что они укрупняются в клетке микроорганизма и образуют плотные осажденные тела ("Inclusion Bodies"), которые с небольшим усилием можно отделять от других частей клетки и тем самым облегчать выделение и очистку желаемого протеина. С другой стороны, протеины-носители, которые при помощи способов генной инженерии прежде всего сливаются с собственно желательным протеином, придают слившемуся партнеру особую устойчивость против неспецифического протеолитического расщепления; проблема расщепления полипептидов, которые считаются чужеродными, относится особенно к биотехнологическому получению меньших пептидов. Другие протеины-носители снова позволяют распределять желательные протеины в определенных отделениях клеток, из которых их можно особенно легко очищать, где они особенно стабильны и/или где они доступны для испытательных целей. Наконец, протеины-носители могут иметь также специальные свойства, которые позволяют проводить эффективную очистку, например хроматографией сродства. Для многих целей применения предпочитают слившиеся протеины, которые несут протеин-носитель на аминоконце и желательный протеин на карбоксильном конце. Но в определенных случаях может быть также желательным обратный вариант или связывание желательного протеина с двумя партнерами слияния. Далее, может быть выгодным обратное повторение желательного протеина в пределах слияния.

Для получения желательного протеина в свободной форме из подобного слияния необходимо отщепление ковалентно связанных партнеров слияния друг от друга. В принципе, этого можно достигнуть при помощи химических или биохимических (ферментативных) способов. Однако при этом в большинстве случаев имеет место ограниченная специфичность имеющихся до сих пор способов; так как для получения желательного протеина важно, чтобы подобное расщепление происходило в последовательности между партнерами слияния, т.е. в переходной области, но ни в коем случае дополнительно внутри самого желательного протеина. Поэтому расщепление партнеров слияния должно быть высокоспецифичным.

Применяемыми до сих пор химическими способами для последовательноспецифического разделения слившихся протеинов являются, например, расщепление бромцианом на аминокислоте метионина внутри протеина и расщепление между аминокислотами Asp.'Pro в кислой среде с применением муравьиной кислоты. Но эти способы пригодны только в том случае, если специфическое место расщепления в желательном протеине, независимо от переходной области к партнеру слияния, не повторяется второй раз. Однако, в общем, биохимические способы расщепления следует предпочитать химическим способам, так как первые в большинстве случаев можно осуществлять при физиологических или по крайней мере при химически мягких условиях реакции, которые не причиняют ущерба желательному протеину.

Биохимические способы для расщепления слившихся протеинов основываются на применении по возможности специфических протеаз. Например, трипсин расщепляют следующие за аминокислотами аргинин или лизин пептидные связи внутри протеинов. Повышение специфичности может быть достигнуто предшествующей химической модификацией аминокислоты LYS, в результате чего специфическое распознавание можно ограничить аминокислотой аргинин. Другой примененной в биотехнологии протеазой является Клострипаин; этот фермент расщепляет пептидные связи между аминокислотой аргинин и любой следующей за ним аминокислотой. Обзор о применяемых до сих пор ферментативных способах для расщепления слившихся протеинов был составлен F.A. О Marston (B [D.M. Clover, E.] : DNA cloning III, JRL PRESS Оксфорд и Вашингтон DC, 1987). Ферментативные способы расщепления ограничивают также в результате того, что специфическая для точки расщепления аминокислота (аминокислоты) может встречаться одновременно также в самом желательном протеине. Поэтому для биохимического расщепления слияний протеинов пригодны особенно ферменты, которые для расщепления распознают не только аминокислоту, но и последовательность аминокислот; так как вероятность того, что определенная последовательность аминокислот кроме в точке расщепления между партнерами слияния встречается еще раз в самом желательном протеине, тем незначительнее, чем больше число аминокислот, необходимых для распознавания и расщепления последовательности расщепления.

Протеазы, которые очень специфически перерезают определенный протеин, известны. Хотя большинство таких селективных протеаз (которые встречаются, например, в комплементарной системе и в системе свертывания крови человека) расщепляет в определенной точке субстрата; однако при переносе соответствующей области расщепления в другой протеин (например, слившийся протеин) подобные протеазы, как правило, больше не способны расщеплять. Причины для этого разнообразные и заключаются, например, в распознавании определенной вторичной или третичной структуры в субстрате протеазой или в недоступности точки расщепления в слившихся протеинах.

Список последовательноспецифических протеаз, которые применяются до сих пор для расщепления слившихся протеинов, содержит в настоящее время фактор X_a. Эта протеаза перерезает специфически последовательность расщепления Ile-Glu-Gly-Arg X, причем . . показывает точку расщепления и X показывает любую аминокислоту. Однако оказывается, что и эту протеазу нельзя применять универсально для расщепления слившихся протеинов, которые несут соответствующую последовательность расщепления в своей переходной области; часто такие субстраты (т.е. слившиеся протеины, которые содержат желательный протеин, ковалентно связанный с протеином-носителем) вообще не расщепляют, расщепляют в очень небольшой степени или только в растворимой форме.

Особенно значительным является эффективное расщепление слившихся протеинов при получении рекомбинантных протеинов в прокарионтных организмах. А именно, там требуется клонирование ДНК-последовательности, которая содержит AUG в качестве начального кодона перед началом собственной ДНК-последовательности. Как результат этого в прокарионтах, как, например, E. coli, экспримируют рекомбинантный протеин, который содержит остаток метионина в положении-1 аминокислоты.

Однако во многих случаях требуется получение не содержащих метионина в положении-1 рекомбинантных протеинов. Получение таких протеинов из прокарионтов можно осуществлять, например, через метионин-специфическую пептидазу, которая отщепляет N-концевой метионин. Однако этот способ связан с очень большими затратами, так как отщепление можно проверить только через последовательность протеинов. Кроме того, разделение содержащего метионин в положении-1 и не содержащего метионин протеина по причине почти идентичного молекулярного веса является очень трудным и тем самым может быть достигнуто только неполностью.

PCT-заявка W084/02351 раскрывает отщепление N-концевых аминокислот от слившегося протеина. При этом многие аминокислоты протеина от N-конца благодаря постепенному отщеплению экзопептидазой, предпочтительно лейцинпептидазой, могут быть удалены до последовательности X - Pro. Последовательность X - Pro отщепляют из этого продукта или в две стадии, или в 1 стадию реакции с применением постпролин-дипептидил-аминопептидазы (EC 3.4.14). Однако этот способ имеет тот недостаток, что обусловленный постепенным отщеплением аминокислот N-конца протеина должен образовываться не единый продукт, в всегда смесь продуктов, которая наряду с желательным продуктом содержит как неполностью, так и в значительном количестве отщепленные протеины.

Другой способ для ферментативного расщепления слившегося протеина известен из европейского патента N 0020290. При этом способе фермент Коллагеназы применяют для отщепления слившейся части протеина с определенной последовательностью распознавания. После этого можно удалять затем другие аминокислоты слившейся части в результате дальнейшей ферментативной обработки. Однако было установлено, что Коллагеназа и также другие эндопептидазы имеют лишь небольшую специфичность (см. Biochim Biophys Acta 271 (1972), 133-144). Кроме того, Коллагеназы активны только при протеинах, которые имеют специфическую пространственную структуру.

Применение уже упомянутого фактора X_a для отщепления N-концевой части слияния протеинов известно. Однако и это способ наряду с уже упомянутыми проблемами эффективности расщепления имеет другие недостатки, а именно такого типа, что, по всей возможности, распознаются и расщепляются также внутренние последовательности протеина. Кроме того, следует выделять фактор X_a из сыворотки крови крупного рогатого скота, вследствие чего при отщеплении применяемых в терапии протеинов требуется связанная с затратами очистка и аналитика, чтобы обнаруживать возможные имеющиеся факторы патогенности или вирусы.

Различные виды патогенных бактерий (например, рода Neissria, как Neisseria gonorrhoea и Neissria meningititis или рода Haemophilus, как Haemophilus influenrae и Haemophilus aegypticus, которые развиваются на слизистой оболочке человека, выделяются между собой своей последовательностью, близкой к родственным протеазам, которые специфичны для IgAl человека и поэтому, резюмируя, обозначаются как IgA - протеазы или игазы. Иммуноглобулин IgAl является важной компонентой секретного иммунного ответа, который должен защищать против инфекций таких патогенных организмов (Обзор: Jornfeld и Plaut, Rev, Jnfect. Dis 3 (1981), 521-534). Наряду с этим IgA - протеаза расщепляет также свой собственный протеин-предшественник в результате аутопротеолиза. Образование и действие IgA-протеазы из Neisseria gonorrhoeal MSll в аутентичном штамме бактерий и в грамотрицательных клетках хозяина уже было подробно описано (патент ФРГ N 3622221.6, EP N 0254090).

IgA-протеаза расщепляет следующие последовательности распознавания, как, например, описано у Pohlner (Nature 325) (1987), 458-462): 1. Pro - Ala - Pro' Ser - Pro 2. Pro - Pro .'. Se - Pro 3. Pro - Pro .'. Ala - Pro 4. Pro - Pro .'. Thr - Pro При этом символ .'. обозначает соответственно точку разреза IgA-протеазой. Клонирование IgA-протеазы описано выше, например, у Pohlner и др., 1987.

Поэтому задачей настоящего изобретения была разработка усовершенствованного способа для биохимического (ферментативного) расщепления слившихся протеинов, чтобы полученные методом генной технологии слившиеся протеины, состоящие из любых партнеров слияния и специфической последовательности расщепления в переходной области, можно было применять как субстрат для получения желательных протеинов по возможности с высоким выходом и со способностью к воспроизведению.

Эту задачу решали методом генной технологии путем введения точки распознавания или последовательности расщепления Pro'X - Pro в переходную область слившихся протеинов и путем специфического расщепления этой последовательности расщепления IgA-протеазой на обозначенной символом .'. точке расщепления, причем X обозначает преимущественно аминокислоты Ser, Thr Ala и особенно предпочтительно Ser или Thr, но может обозначать также другие аминокислоты.

Поэтому предметом настоящего изобретения является способ для ферментативного расщепления слившихся протеинов и для получения желательных частей этих слившихся протеинов, который отличается тем, что (1) переходную область, в которой связаны друг с другом две части слившегося протеина, модифицируют при помощи геннотехнических средств таким образом, что в этой переходной области образуется по меньшей мере одна точка распознавания IgA-протеазы с последовательностью аминокислот Y - Pro .'. X - Pro, причем X может быть любой аминокислотой и Y - одной или несколькими любыми аминокислотами, (2) получающийся из стадии (1) слившийся протеин расщепляют IgA-протеазой на обозначенном символом . ' . положении точки распознавания и (3) после расщепления получают одну часть или несколько желательных частей слившегося протеина.

Под понятие "IgA - протеазы" по настоящему изобретению попадают протеазы, которые специфически расщепляют IgA, которые описаны, например, в Rev. Infekt. Dis. 3(1981 521-534). Но пригодны также и рекомбинантные IgA - протеазы, которые описаны, например, в заявке на патент ФРГ N 3622221, Proc. Natl. Acad Sci США 79 (1982) 7881 - 7885, Proc. Natl. Acad Sci США 80 (1983) 2681 - 2685, Nature 325 (1987) 458 - 462 и ЕМВО Jour 3 (1984) 1595 - 1601.

При способе по изобретению происходит модификация переходной области слившихся протеинов преимущественно таким образом, что в переходную область слившегося протеина встраивают последовательности нуклеотидов, которые кодируют точку распознавания IgA-протеазы или часть ее, причем эти последовательности нуклеотидов встраивают впереди или/и позади одного или нескольких кодирующих желательные части слияния протеинов ДНК - отрезков. Для этой цели применяют преимущественно последовательности нуклеотидов, которые были синтезированы химическим путем.

Неожиданно было установлено, что способ по изобретению особенно пригоден также для расщепления слившихся протеинов, которые первоначально (т.е. перед модификацией переходной области) не имеют никакой природной точки распознавания Iga-протеазы.

Точка распознавания IgA-протеазы для способа изобретения имеет согласованную последовательность аминокислоты Y - Pro .'. X - Pro. При этом X может обозначать любую аминокислоту и Y может обозначать одну или несколько любых аминокислот. Преимущественно X обозначает серин, треонин или аланин, особенно преимущественно серин или треонин. Y обозначает преимущественно многие аминокислоты, которые оканчиваются последовательностью Pro, Pro - Ala, Arg - Pro, Pro - Arg - Pro, Ala - Pro - Arg - Pro или Pro - Ala - Pro - Arg - Pro.

Поэтому способ по изобретению раскрывает, что точку распознавания IgA - протеазы по меньшей мере с согласованной последовательностью расщепления Pro . '. X - Pro можно вводить в переходную область любого слившегося протеина, например, между протеином-носителем и желательным протеином, и использовать для отщепления и получения желательного протеина благодаря IgA-протеазе. При этом в последовательности расщепления Pro .'. X - Pro применяют преимущественно аминокислоты Ser, Ala или Thr в положении X. Для дальнейшей оптимизации расщепления в указанной точке можно предвключать к последовательности расщепления другие специальные аминокислоты, особенно аминокислоту Pro.

Особенно предпочитают последовательность аминокислот a) Pro - Ala - Pro .'. Ses - Pro b) Pro - Pro .'. Ser - Pro, c) Pro - Arg - Pro - Pro .'. Ala - Pro, d) Pro - Pro .'. Thr - Pro, e) AlA - Pro - Arg - Pro - Pro .'. Thr - Pro или f) Pro - AlA - Pro - Arg - Pro - Pro .'. Thr - Pro.

При применении способа по изобретению к расщеплению слившихся протеинов, в которых желательный протеин включен после протеина-носителя, образуется после расщепления IgA-протеазой протеин, аминоконец которого охарактеризован последовательностью X - Pro. Эта последовательность как часть желательного протеина может быть выгодной, невыгодной или же незначительной. Выгодна эта последовательность, в общем, тогда, когда полученный методом генной технологии желательный протеин и в своей природной форме содержит на своем аминоконце обе соответствующие аминокислоты X - Pro. Охарактеризованные аминоконцевым X - Pro протеины, которые имеют важное значение в биотехнологии, встречаются в природе.

Способ по изобретению, в противоположность всем другим известным способам для расщепления слияний протеинов, имеет те преимущества, что его неожиданно можно применять универсально к слившимся протеинам, которые в своей переходной области несут указанную последовательность расщепления и что его можно применять также к нерастворимым, растворимым, соединенным мембранной и связанным клеткой слияниям протеинов. Кроме того, в качестве особого преимущества способ дает возможность расщеплять слившиеся протеины или слияния протеинов в форме осажденных тел такого рода, как они получаются в микроорганизмах и где их как таковые легко обогащать. Другое преимущество способа состоит в том, что примененный расщепляющий фермент, игазу, можно получать с небольшими затратами из питательных сред непатогенных бактерий.

Встраивание последовательности расщепления для Jgas в переходную область слияния протеинов осуществляют средствами генной технологии. Так, например, последовательность нуклеотидов или нуклеотидную последовательность, которая кодирует последовательность расщепления или часть его, можно синтезировать химическим путем и встраивать при помощи известных средств генной технологии между ДНК - отрезками для протеина - носителя и желательного протеина. Соответственно можно встраивать также природную последовательность нуклеотидов, которая кодирует подходящую последовательность расщепления или часть ее. Кодирующий слияние протеинов ген ставится преимущественно под контроль надлежащих (преимущественно индуцируемых) сигналов экспрессии, так что становится возможным соответствующее требованиям производство слившихся протеинов. В качестве клеток-хозяев для производства слияний протеинов можно применять прокарионтные или эукарионтные (как растительные, так и животные) клетки; но возможны также не содержащие клеток системы. Примененные при этом протеины-носители могут иметь любые функции, в зависимости от того, какие свойства они должны придавать слиянию протеинов, как определенные функции переноса, функции, которые улучшают очистку слияния протеинов или их устойчивость и многое другое. Предпочтительные протеины-носители объяснены ниже.

Соответствующее способу по изобретению расщепление слияний протеинов происходит преимущественно при помощи Jgas, которую образуют из сверхпродуцирующего непатогенного штамма бактерий и получают очисткой из надосадочных жидкостей культуры (см., например, патент ФРГ N 3622221).

Способ по изобретению можно использовать как для получения, так и для аналитических целей. Способ служит для получения методом биотехнологии важных протеинов, которые могут находить применение, например, в медицине, при научном исследовании, при защите окружающей среды или при промышленных процессах или продуктах. При аналитическом применении способ в сочетании с подходящими системами экспрессии может служить, например, для стандартного исследования слияний генов.

Предпочтительный вариант осуществления способа по изобретению для ферментативного расщепления слившихся протеинов и для получения желательных частей этих слившихся протеинов отличается тем, что (1) трансформируют клетку с рекомбинантной ДНК или с рекомбинантным носителем, причем ДНК или носитель содержит по меньшей мере копию гена, кодирующего слившийся протеин, которые содержит по меньшей мере точку распознавания IgA-протеазы в переходной области, (2) культивируют трансформированную клетку в подходящей среде, (3) доводят до экспрессии кодирующий слившийся протеин ген в трансформированной клетке, (4) расщепляют слившийся протеин при помощи IgA-протеазы (5) выделяют одну или несколько желательных частей слившегося протеина.

При этом обработку слившегося протеина IgA-протеазой в среде (питательном бульоне) можно проводить после растворения клеток и/или после частичного или полного отделения клеточных протеинов.

Далее, предпочтительно для обработки слившегося протеина, преимущественно прокарионтного продукта экспрессии, иммобилизировать IgA-протеазу известным специалисту методом, например, как описано в европейском патенте B 0141223 или в европейском патенте B 0141224.

Особенно предпочтительным применением способа по изобретению является получение рекомбинантных протеинов или пептидов без N-концевого остатка метионина из слившихся протеинов или пептидов с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro .'. X - Pro - A, где X обозначает любую аминокислоту, преимущественно Thr, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых аминокислот, которая преимущественно, если X обозначает Thr или Ala, оканчивается Pro, или если X обозначает Ser, оканчивается последовательностью Pro - Ala или Pro - Pro, и A обозначает любую последовательность аминокислот. При этом расщепляют слившийся протеин или пептид при помощи Iga-протеазы и получают продукт расщепления с последовательностью аминокислот X - Pro - A. Например, этот способ для получения рекомбинантных протеинов из прокарионтных клеток без N-концевого остатка метионина включает следующие стадии: (1) трансформация прокарионтной клетки с геном, который кодирует протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro. ' . X - Pro - A, где X, Y и A имеют вышеназванные значения.

(2) культивирование трансформированной клетки в подходящей среде и экспимирование трансформированного гена, (3) расщепление продукта экспрессии из трансформированной клетки с последовательностью аминокислот Met - Y - Pro.' . X - Pro - A IgA-протеазой и (4) выделение получающегося продукта расщепления с последовательностью аминокислот X - Pro - A без N-концевого остатка метионина.

Благодаря способу по изобретению неожиданно можно получать с высоким выходом и хорошей специфичностью в одной стадии протеины без N-концевого остатка метионина, которые имеют N-концевую последовательность X - Pro, причем X обозначает преимущественно Thr, Ala или Ser.

Часть носителя Y слившегося протеина обозначает последовательность аминокислот по меньшей мере 1, преимущественно до 100, особенно преимущественно от 1 до 50 аминокислот, которая оканчивается распознанной IgA-протеазой последовательностью расщепления. Если X обозначает аминокислоту серин, то Y оканчивается преимущественно последовательностью Pro - AlA или Pro. Если X обозначает Thr или Ala, то Y оканчивается преимущественно Pro, особенно преимущественно Arg - Aro, Pro - Arg - Pro или Ala - Pro - Arg - Pro.

В особенности предпочтительном варианте осуществления Y обозначает по меньшей мере 5 аминокислот, которые оканчиваются последовательностью Pro - Ala - Pro - Arg - Pro. Однако для способа по изобретению применяются все распознанные IgA - протеазой точки расщепления.

Часть носителя Y может содержать еще другие любые аминокислоты, преимущественно до 100, особенно преимущественно до 50 аминокислот. Однако для этого применяют преимущественно такие последовательности аминокислот, которые на уровне ДНК улучшают экспрессию протеина Met - Y - Pro .'. X - Pro - A или /и на уровне аминокислоты облегчают ее очистку из клетки.

Экспрессию протеина Met - Y- Pro .'. X - Pro- A на уровне ДНК можно улучшать, например, слиянием с фрагментами гена -галактозидазы, т.е. часть носителя Y включает часть -галактозидазы-протеина. Известны специалисту и другие возможности, чтобы повышать экспрессию протеина Met - Y - Pro .'. X - Pro - A. Слиянием с другими полипептидами, особенно с высокозаряженными (например, поли (Lys, Arg)) или со связывающими определенные вещества с высоким сродством (например, стрептавидин) полипептидами или протеинами можно облегчать очистку и отделение продукта экспрессии (см. например европейский патент A 0089626, европейский патент A 0306610).

Далее, предметом настоящего изобретения является слившийся протеин, который содержит много частей полипептида и который, встроенный по меньшей мере в переходной области между различными частями полипептида, имеет одну или несколько точек распознавания IgA- протеазы с последовательностью аминокислот Pro . '. X - Pro, причем X обозначает любую аминокислоту, однако преимущественно Ser, Thr или Ala. Особенно предпочтительно точка распознавания имеет последовательность аминокислот (а) Pro - Ala - Pro .'. Ser - Pro, (b) Pro - Pro .'. Ser - Pro, (c) Pro - Arg - Pro - Pro .'. Ala - Pro, (d) Pro - Pro .'. The - Pro, (e) Ala - Pro - Arg -Pro -Pro .'. Thr - Pro или (f) Pro - Ala - Pro - Arg -Pro - Pro .'. The - Pro, причем .'. показывает точку расщепления.

Настоящее изобретение включает также, в частности, протеин или пептид с последовательностью аминокислот Met - Y -Pro . '. X - Pro - A, где X - обозначает преимущественно Thr, Ala или Ser, Y обозначает одну или несколько любых аминокислот и преимущественно, если X обозначает The или Ala, оканчивается Pro, или, если X обозначает Ser, оканчивается последовательностью Pro - Ala или Pro и А обозначает любую последовательность аминокислот. Подобный протеин или пептид экспримируют по способу изобретения трансформацией прокарионтной клетки с рекомбинантным носителем, который содержит по меньшей мере копию гена, который кодирует подобный протеин или пептид.

Последовательность А может обозначать любую последовательность аминокислот. Однако целесообразно, чтобы внутри этой последовательности аминокислот не было другой точки расщепления для IgA -протеазы.

Далее, предметом настоящего изобретения является рекомбинантная ДНК, которая колирует протеин или пептид по изобретению и где по меньшей мере в переходной области слившегося протеина встроены одна или несколько точек распознавания Iga-протеазы или последовательностей расщепления.

Рекомбинантную ДНК по изобретению можно получать известным специалисту в области молекулярной биологии способом. Обычно для этого носитель, который содержит кодирующую последовательность аминокислот А ДНК-последовательность, расщепляют ограничительным эндонуклеазами в области 5' - конца этого гена и повторно перевязывают олигонуклеотидами, которые содержит желательную последовательность. При этом олигонуклеотид должен содержать последовательность, которая кодирует точку расщепления IgA-протеазы или часть ее.

Далее, предметом изобретения является также рекомбинантный носитель, который содержит по меньшей мере копию рекомбинантной ДНК по изобретению. Подходящие для экспрессии протеина в прокарионтных организмах основные носители известны специалисту. Целесообразным носителем является такой носитель, который обеспечивает высокую экспрессию ренкомбинантной ДНК по изобретению. Рекомбинантная ДНК находится преимущественно под контролем индуцируемого сигнала экспрессии (например, , , tac, Iac или trp промотор).

Носитель по изобретению может быть как внехромосомным (например, плазмид), так и интегрированным (например, бактериофак ламбда) в геноме организма-хозяина.

Преимущественно носитель по изобретению представляет плазмид. Носители, которые пригодны, соответственно, для экспрессии гена в определенном организме-хозяине, известны специалисту в области молекулярной биологии. Речь может идти об эукарионтном, но преимущественно о прокарионтном носителе. Примерами носителей, пригодных для экспрессии ДНК по изобретению в прокарионтах, являются имеющиеся в продаже pUC- и puR - носители.

Другим предметом изобретения является клетка, преимущественно прокарионтная клетка, особенно преимущественно E.coli- клетка, которая трансформирована с рекомбинантной ДНК по изобретению или/и с рекомбинантным носителем по изобретению.

Примерами для протеинов, которые имеют N - концевую последовательность X - Pro, причем X обозначает Thr, Ala или Ser, и которые можно получать по способу изобретения в одной стадии, являются эритропоэтин человека, - цепь Т-клеточного рецептора человека и особенно стимулирующий гранулоциты фактор человека ( G - CSF).

G - CSF синтезируют как лимфокин активированных моноцитов, макрофагов, а также ряда других клеточных линий. Лимфокины участвуют в созревании клеток иммунной системы или системы клеток крови.

Они стимулируют созревание основных клеток костного мозга до раздифференцированных клеток. Так, например, G - CSF индуцирует образование нейтрофилена и гранулоцитов.

Так как G - CSF может значительно повышать популяцию нейтрофильных клеток в течение короткого срока, для G - CSF получаются широкие возможности применения в области терапии. Так, G - CSF можно было бы применять, например, после химиотерапии при раке, при которой разрушаются клетки иммунной системы. Далее, G - CSF можно было бы применять при пересадках костного мозга, при тяжелых ожоговых ранах, при обусловленных слабым иммунитетом враждебных инфекциях и при лейкемии.

G - CSF представляет секторную молекулу протеина. Поэтому первичный продукт трансплантации содержит N-концевую последовательность сигналов, которая при секреции отщепляется, так что последовательность зрелого G-CSF начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2) (положения аминокислот +1 и +2). Про продуцировании G - CSF в прокарионтах этот сигнальный пептид расщепляется только плохо или совсем не расщепляется, так что для получения G - CSF без сигнальной последовательности из прокарионтов необходимо клонировать AUC (Met) в качестве инициирующего кодона перед началом кодирующей зрелой G - CSF последовательности ДНК, которая начинается на уровне протеина с Thr (+1) - Pro (+2). В результате этого в прокарионтах, как E. coli, экспримируют G - CSF, который содержит метионин в 1-положении аминокислоты.

По способу изобретения можно простым путем получать не содержащий метионина в 1-положении аминокислоты G - CSF из прокарионтов, который начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2).

Это происходит в результате того, что получают производное G - CSF не прокарионтов, которое в положении +1 и +2 последовательности аминокислот содержит аминокислоты Thr (+1) - Pro (+2) и перед этим, начиная с положения - 1 последовательности аминокислот, содержит такую последовательность аминокислот, которая распознается IgA-протеазой и может отщепляться от последовательности аминокислот G - CSF, которая начинается с Thr (+1) - Pro (+2).

В предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении -1 и -2 по Pro, в положении -3 до положения -I последовательность аминокислот Arg-Pro-Pro, в положении 4- до -1 последовательность аминокислот Pro - Arg - Pro - Pro или в положении -5 до положения -1 последовательность аминокислот Ala - Pro - Arg - Pro - Pro.

В особенно предпочтительном варианте осуществления производное содержит в положении -6 до положения -1 последовательность аминокислот Под G - CSF в смысле изобретения понимают, конечно, существующий G - CSF, последовательность которого раскрыта, например, в Science 232 (1986) 61, а также образованные от него производные со стимулирующей гранулоциты активностью, у которых последовательности аминокислот начинаются с X (+1) - Pro (+2). X обозначает Thr, Ser или Ala, особенно предпочтительно Thr.

G - CSF производное по изобретению после экспрессии в прокарионтах можно расщеплять обработкой IgA-протеазой между положением +1 и -1 (между Thr (+1) и Pro (-1). Тем самым в результате единственной стадии гидролиза получают не содержащий метионина в положении -1 G - CSF, последовательность аминокислот которого на N-конце начинается с аминокислот Thr (+1) - Pro (+2) встречающегося в природе G - CSF.

При экспрессии G - CSF в прокарионтах образуют труднорастворимые агрегаты (refractie bodies), которые неактивны. Прежде чем применять протеин, например, для терапевтических целей, его следует перевести в его активную форму. При известных специалисту способах (ср. например европейский патент A 0219874, европейский патент A 0114506, WO 84/03711) сначала осуществляют растворение добавкой денатурирующих средств, к которому присоединяются ренатурирование и в случае необходимости дальнейшие стадии очистки. Обработку протеина по изобретению IgA-протеазой можно проводить перед растворением, после растворения или лишь после ренатурирования. В случае, если обработка IgA-протеазой должна проводиться непосредственно после растворения, следует перед добавкой IgA-протеазы отделять растворитель (например гидрохлорид гуанидина или мочевину) диализом. Однако обработку IgA-протеазой проводят преимущественно после ренатурирования, так как в этом случае выходы G - CSF особенно высокие.

Условия для обработки G - CSF или другого отщепляемого протеина IgA-протеазой сами по себе не являются критическими. Однако предпочтительно применять при этом G - CSF (или другой протеин) относительно IgA-протеазы в весовом отношении 1 : 1 до 100 : 1. Превращение происходит предпочтительно в буферном водном растворе с pH от 6,5 до 8,5. Концентрация буферного раствора лежит преимущественно в области между 50 и 300 ммоль/л, в случае необходимости при добавке 20 - 100 ммоль/л хлористого натрия. Преимущественно расщепление происходит при комнатной температуре свыше 20 - 60 мин.

После растворения, ренатурирования и расщепления IgА-протеазой полученный таким путем продукт расщепления очищают преимущественно через ионообменник и крупное фракционирование. Загрязнение полученного таким путем и не содержащего метионина в положении -1 G - CSF другими протеинами составляет ниже 0,1%, преимущественно ниже 10^-3%.

Следовательно, не содержащий метионина в положении -1 G - CSF расщеплением IgA-протеазой можно отделять или очищать практически количественно от содержащего метионин слитого протеина.

По способу изобретения можно получать рекомбинантный G - CSF из прокарионтов, который менее чем на 0,1%, преимущественно менее чем на 10^-3% загрязнен другими протеинами и количественно не содержит G - CSF из прокарионтов, который в положении -1 содержит метионин.

Предметом изобретения является также лекарственное средство на основе полученного по способу изобретения G - CSF из прокарионтов в качестве активного вещества, в случае необходимости вместе с обычными фармацевтическими веществами-носителями, наполнителями и вспомогательными веществами. Такое лекарственное средство особенно пригодно для лечений, при которых следует стимулировать образование гранулоцитов, особенно нейтрофилов.

Фармацевтические препараты по изобретению применяются преимущественно как растворы для инъекций и вливаний. Это можно осуществлять в результате того, что имеется в распоряжении уже готовый для впрыскивания раствор, который содержит состав по изобретению. Однако возможно также использование фармацевтических препаратов в форме лиофилизатов. Последние образуются при помощи известных, подходящих для целей инъекции средств или растворов. В качестве среды для инъекции применяют преимущественно воду, которая содержит обычные в растворах для инъекций добавки, как стабилизаторы, агенты растворения, буферные растворы и изотонические добавки, например физиологический раствор хлористого натрия. Подобными добавками являются, например, маннит, буферный раствор тартрата или цитрата, этанол, комплексообразователь, как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота и ее нетоксичные соли, а также