Фармацевтическая композиция, предназначенная для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток, увеличения содержания интерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования торможения производства цитокина и ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа

Фармацевтическая композиция, предназначенная для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток, увеличения содержания интерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования торможения производства цитокина и ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины. Объектом изобретения является фармацевтическая композиция, предназначенная для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток, увеличения содержания -интерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования торможения производства цитокина и ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа, содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и активное вещество, выбранное из группы, включающей интерлейкин-4, интерлейкин-10, комбинацию интерлейкина-4 и интерлейкина-10 и антитела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10, в эффективном количестве. 5 з.п.ф-лы, 14 табл.

Изобретение относится к области подкрепления иммунной системы млекопитающих, включая человека, в частности к фармацевтической композиции, предназначенной для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток, увеличения содержания -интерферона, лечения воспалительных заболеваний кишечника, потенцирования торможения производства цитокина и ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа.

Предлагаемая фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и активное вещество из группы, включающей интерлейкин-4, интерлейкин-10, комбинацию интерлейкина-4 и интерлейкина-10 и антитела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10, в эффективном количестве.

Для торможения зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток и лечения воспалительных заболеваний кишечника используют композицию, в качестве активного вещества содержащую интерлейкин-10 в эффективном количестве.

Для увеличения содержания -интерферона используют композицию, в качестве активного вещества содержащую антитела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10 в эффективном количестве.

Для потенцирования торможения производства цитокина используют композицию, в качестве активного вещества содержащую интерлейкин-4 и интерлейкин-10 в эффективном количестве.

Для ограничения или торможения аллергической реакции замедленного типа используют композицию, в качестве активного вещества содержащую интерлейкин-10 или комбинацию интерлейкина-4 и интерлейкина-10 в эффективном количестве.

Фармацевтическая композиция согласно изобретению может иметься в виде любого известного препарата, пригодного для любого способа дачи.

Как принято, все указанные последовательности нуклеиновых кислот определяют с 5'-конца до 3'-конца, то есть слева направо. В указанных последовательностях для нуклеотидных оснований использованы стандартные сокращения, каждое состоящее из одной буквы.

Под "интерлейкином-4" в рамках настоящего изобретения подразумевается протеин, а) имеющий аминокислотную последовательность, в основном идентичную последовательности зрелого человеческого интерлейкина-4, приведенного в фиг. 1C международной патентной заявки, опубликованной под N WO 87/02990, и б) обладающий биологической активностью природного интерлейкина-4. Выражение "в основном идентичная аминокислотная последовательность" следует понимать в том смысле, что последовательность другого интерлейкина-4 или идентична приведенной в указанной заявке последовательности, или отличается от нее лишь одним или больше изменениями аминокислот (делецией, добавлением, заменой), не в значительной степени влияющими на биологическую активность.

Интерлейкин-4 можно приобрести у разных фирм, например Genzyme Corporation, г. Cambridge, Массачусетс, США, или его можно получать известными методами, или с использованием естественных источников, или путем рекомбинации ДНК (см., например, Sheehan и др., J. Immunol. 142, с. 884, 1989, и Starnes и др., J. lmmunol. 145, с. 4185, 1990).

Альтернативно для обнаружения кодирующей интерлейкин-4 ДНК в геномных библиотеках или библиотеках кДНК можно использовать смешанные пробы олигонуклеотидов на основе известных нуклеотидных последовательностей интерлейкина-4. Обнаруженную таким образом ДНК можно вырезать из библиотеки путем расщепления эндонуклеазой рестрикции, или ее можно получать с использованием пригодных праймеров и путем метода цепной реакции с помощью полимеразы (см. Saiki и др., Science 239, с. 487, 1988), чередовать и экспримировать в эукариотной экспрессионной системе или, в случае необходимости после делеции интрона известным методом, в прокариотной или эвкариотной экспрессионной системе. Конечно, вместо использования олигонуклеотидных проб или осуществления цепной реакции с помощью полимеразы можно также экранировать библиотеки и кДНК, и геномной ДНК известными методами экспрессионного клонирования. Полученный таким образом интерлейкин-4 можно обнаруживать известным методом, например иммунохимическим способом или путем биоанализа.

В качестве интерлейкина-4 предпочтительно используют человеческий рекомбинантный интерлейкин-4. Можно использовать или гликозилированный интерлейкин-4, например рекомбинантный интерлейкин-4, полученный в эвкариотной экспрессионной системе, или негликозилированный интерлейкин-4, полученный, например, путем химического синтеза или в бактериальной экспрессионной системе.

В рамках настоящего изобретения под "интерлейкином-10" подразумевается протеин, а) имеющий аминокислотную последовательность, в основном идентичную с последовательностью зрелого интерлейкина-10 (то есть интерлейкина-10, не содержащего секреторной лидерной последовательности), приведенного в международной патентной заявке, опубликованной под N WO 91/00349, и б) обладающий биологической активностью природного интерлейкина-10. Можно использовать или гликозилированный интерлейкин-10, полученный, например, в эвкариотных клетках, как например клетках яичника китайского хомячка, или негликозилированный интерлейкин-10, полученный, например, известным методом путем химического синтеза или в E.coli. Охватываются также мутеины и другие аналоги, включая протеин BCRFI (вирусный интерлейкин-10 из вируса Eppstein Ваrr, далее: вирусный интерлейкин-10), обладающий биологической активностью интерлейкина-10. В международной патентной заявке, опубликованной под N WO 91/00349, описан ряд проведенных in vitro опытов, пригодных для определения активности интерлейкина-10. В рамках настоящей заявки описан ряд предпочтительных форм интерлейкина-10.

Пригодный в рамках настоящего изобретения интерлейкин-10 можно получать из разных источников. Например, его можно выделять из культуры активированных Т-клеток, способных к выделению протеина. Кроме того, интерлейкин-10 или его активные фрагменты можно получать известным методом путем химического синтеза (см., например, Merrifield, Science 233, с. 341 - 347, 1986, и Atherton и др., Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach, 1989, издательство I.R.L. Press, г. Oxford).

Рекомбинантный человеческий интерлейкин-10 можно также приобрести на рынке, например, у фирмы PeproTech, Inc., г. Rocky Hill, Нью-Джерси, США.

Альтернативно рекомбинантный интерлейкин-10 можно получать описанным выше для интерлейкина-4 способом с использованием известной информации о последовательностях человеческого или вирусного интерлейкина-10. Методы получения рекомбинантного человеческого интерлейкина-10 описаны, например, в международной патентной заявке, опубликованной под N WO 91/00349. Клоны, содержащие кодирующие человеческий интерлейкин-10 последовательности, были депонированы в Американской коллекции культур, г. Rockville, Мэриленд, США, 20-го декабря 1989 г. под N 68191 и 68192. Клонирование и экспрессия вирусного интерлейкина-10 (протеина BCRFI) из вируса Эпштейна и Барра описаны в источнике Moore и др., Science 248, с. 1230, 1990.

Для лечения человека предпочтительно используют человеческий интерлейкин-10, хотя можно использовать также вирусный интерлейкин-10 или интерлейкин-10, полученный из других млекопитающих. Наиболее предпочтительным является использование рекомбинантного человеческого интерлейкина-10.

Интерлейкин-4 и интерлейкин-10 любого происхождения можно очищать известными методами, например путем осаждения в виде кислоты или соли, ионообменной хроматографии, хроматографии на хелатном соединении металлов, гель-фильтрации, высокопроизводительной жидкостной хроматографии протеинов, жидкостной хроматографии высокого разрешения, гелевого препаративного диск-электрофореза или другого вида электрофореза, изоэлектрического фокусирования, фракционирования в органическом растворителе при низких температурах, противоточного распределения и иммуноаффинной хроматографии.

Антитела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10 можно также получать путем известных методов. В данном контексте понятие "антитело" охватывает и поликлональные, и моноклональные антитела. Оно охватывает и целые иммуноглобулины, и их связывающие антигены фрагменты.

Поликлональные антитела можно получать путем иммунизации животного-хозяина, например зайца, крысы, козы, овцы, мыши и т.п. с использованием интерлейкина-4 или интерлейкина-10. Предпочтительно для повышения титра антител после первичной инъекции дают одну или больше повторных инъекций. После этого у животного берут кровь и получают сыворотку, которую экранируют известным методом, например путем твердофазного иммуноферментного анализа, в качестве антигена используя полипептид. Фракции иммуноглобулина можно получать известным способом.

Предпочтительно иммуногенность интерлейкина-4 или интерлейкина-10 повышается при их комбинации с одним из многочисленных известных стимуляторов, и/или путем превращения в большую форму перед иммунизацией, например путем известной поперечной сшивки.

Сыворотку, полученную из иммунизованных таким образом животных, можно использовать непосредственно без дальнейшей переработки. Альтернативно фракцию иммуноглобулина G можно отделять из сыворотки путем известных методов, например плазмафореза или адсорбционной хроматографии с использованием специфических в отношении иммуноглобулина G адсорбентов, например иммобилизованного протеина А.

Моноклональные антитела, предпочтительно используемые в рамках настоящего изобретения, можно получать известным методом (см., например, Kohler и др., Nature 256, с. 495, 1975, или Eur. J. Immunol. 6, с. 511, 1976). В основном для получения соматических клеток, выделяющих антитело, животное иммунизуют вышеописанным способом. Затем полученные клетки выделяют из иммунизованного животного для слияния с миеломными клетками.

Соматические клетки, способные к производству антител, в частности В-клетки, пригодны для слияния с миеломной клеточной линией. Данные соматические клетки можно получать из лимфатического узла, селезенки и периферической крови подверженных первичному воздействию антигена животных. Часто используют клетки из селезенки крысы, а именно отчасти по той причине, что этими клетками достигают сравнительно большого процента стабильных слияний с миеломными линиями мыши. Однако также было бы возможно использовать клетки человека, мыши, зайца, овцы, козы или других животных.

Получение из лимфоцитических опухолей специализированных миеломных клеточных линий, которые используют для слияния с получением гибридом, описано, например, Kohler и Milstein (Eur. J. Immunol. 6, с. 511, 1976; Shulman и др. , Nature 276, с. 269, 1978; Volk и др., J. Virol. 42, с. 220, 1982). Способы получения гибридов производящих антитела клеток селезенки или лимфатического узла и миеломных клеток обычно включают прием смешивания соматических клеток с миеломными клетками в соотношении 10 : 1 (при этом соотношение может колебаться примерно между 20 : 1 и 1 : 1) в присутствии химического, вирусного или электрического агента способствующего слиянию клеточных мембран. Способы слияния описаны, например, Kohler и Milstein (см. в вышеуказанном источнике), Gefter и др. (Somatic Cell Genet. 3, с. 231, 1977) и Volk и др. (J. Virol. 42, с. 220, 1982). В способах, описанных в данных источниках, в качестве способствующих слиянию агентов использованы вирус Сендай и полиэтиленгликоль.

Так как путем методов слияния получают жизнеспособные гибриды лишь с чрезвычайно низким выходом (например, при применении селезенки в качестве источника соматических клеток получают лишь один гибрид примерно на 1 10⁵ клеток селезенки), требуется способ отделения полученных гибридов от остальных неслитых клеток, в частности неслитых миеломных клеток. Кроме того, требуется способ обнаружения желаемых производящих антитело гибридом среди других полученных клеточных гибридов.

В общем отделение слитых клеточных гибридов осуществляют путем выращивания клеток в среде, поощряющей рост гибридом, а тормозящей рост неслитых миеломных клеток, которые иначе продолжали бы беспредельно размножаться. Соматические клетки, используемые для слияния, недолго сохраняют жизнеспособность в культуре in vitro, почему и они не представляют собой проблему. Можно использовать, например, миеломные клетки, не содержащие гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (отрицательные относительно ГФРТ клетки). Отбор против этих клеток можно осуществлять в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, в которой слитые клеточные гибриды выживают благодаря положительному относительно ГФРТ генотипу клеток селезенки. Можно также использовать миеломные клетки, имеющие разные генетические недостатки, например проявляющие особую чувствительность к воздействию определенных лекарств, причем отбор тогда осуществляют в среде, поощряющей рост генотипически компетентных гибридов.

Для избирательной культивации слитых клеточных гибридов требуется несколько недель. В начале данного периода необходимо идентифицировать гибриды, производящие желаемое антитело с тем, чтобы их могли потом клонировать и размножать. В общем примерно 10% получаемых гибридов производят желаемое антитело, хотя данная величина может колебаться примерно между 1 и 30 %.

Производящие антитело гибриды можно обнаруживать путем любого известного метода, например иммуноферментного анализа или радиоиммуноанализа (см., например, Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, под ред. Kennet и др., с. 376 - 384, издательство Plenum Press, Нью-Йорк, 1980).

После выделения желаемых слитых клеточных гибридов и их клонирования в отдельные производящие антитело клеточные линии каждую клеточную линию можно размножать путем одного из двух стандартных методов. Суспензию гибридомных клеток можно вводить в гистосовместимое животное путем инъекции. В животном затем возникают опухоли, выделяющие специфическое моноклональное антитело, производимое клеточным гибридом. Для получения моноклонального антитела в высокой концентрации можно использовать жидкости тела животного, например сыворотку или асцитную жидкость. Согласно альтернативному методу отдельные клеточные линии можно размножать in vitro в лабораторных сосудах. Культурную среду, содержащую отдельное специфическое моноклональное антитело в высокой концентрации, можно собирать путем декантирования, фильтрации или центрифугирования, после чего его очищают.

После получения гибридомы, производящей желаемое моноклональное антитело, путем пригодных методов можно получать межвидовые моноклональные антитела, в которых связывающая область одного вида комбинирована с несвязывающей областью антитела другого вида (см. Liu и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, с. 3439, 1987). Например, участок CDR моноклонального антитела грызуна можно размещать на решетке человеческого антитела, при этом осуществляя "гуманизацию" антитела грызуна (см. Riechmann и др., Nature 332, с. 323, 1988). В частности, участки CDR можно размещать в вариабельной области человеческого антитела с человеческими константными областями или без них. Такой метод использовали, например, для гуманизации моноклонального антитела мыши против субъединицы р55 (Тас) рецептора человеческого интерлейкина-2 (см. Queen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, с. 10029, 1989).

Альтернативно человеческие моноклональные антитела можно получать с использованием интерлейкина-4 или интерлейкина-10 и по методу, описанному Banchereau и др. (см. Science 251, с. 70, 1991).

Настоящее изобретение также включает связывающие антитело фрагменты, например Fab-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты, Fc-фрагменты и т.п. Использование и получение фрагментов антител известны (см., например, относительно Fab-фрагментов: Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, издательство Elsevier, г. Амстердам, 1985, относительно Fv-фрагментов - Hochmann и др., Biochemistry 12, с. 1130, 1973, Sharon и др., Biochemistry 15, с. 1591, 1976, Ehrlich и др., патент США N 4355023, а относительно полумолекул антител - Auditore-Нагgreaves, патент США N 4470925).

Предпочтительно антитела и их фрагменты, используемые в рамках настоящего изобретения, специфически связываются с интерлейкином-4 и интерлейкином-10, нейтрализуя их биологическую активность, для чего они и образованы.

Торможение зависимой от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток.

Как показано в нижеследующем примере, человеческий и вирусный интерлейкины-10 непосредственно влияют на человеческие Т-клетки. При использовании L-клеток, трансфецированных FcRII (CD32), в комбинации или с моноклональными антителами против CD3, или с митогенной парой моноклональных антител против CD2, пролиферирующая реакция человеческих клеток, подобных Т-клеткам-помощникам 0, 1 и 2, тормозится интерлейкином-10. Кроме того, специфическая относительно антигена пролиферирующая реакция клонов человеческих Т-клеток тормозится интерлейкином-10, если в качестве антигенпредставляющих клеток используют L-клетки мыши, трансфецированные молекулами соответствующего главного комплекса гистосовместимости II-го класса. В данной системе интерлейкин-10 не влияет на экспрессию главного комплекса гистосовместимости II-го класса, так как конструктивная экспрессия трансфецированных генов главного комплекса гистосовместимости управляется промотором SV40.

Тормозящее действие интерлейкина-10 обусловлено прежде всего непосредственным влиянием интерлейкина-10 на клоны Т-клеток путем торможения производства интерлейкина-2 на уровне мРНК. Тормозящее действие является специфическим относительно интерлейкина-2, так как интерлейкин-10 не влияет на производство -интерферона, интерлейкина-4, интерлейкина-5 и GM-CSF (GM = гранулоциты и макрофаги, CSF = колониестимулирующий фактор). Очевидно взаимодействие интерлейкина-10 с рецептором интерлейкина-10 приводит к специфическому торможению синтеза интерлейкина-2.

Для подтверждения действия композиции согласно изобретению можно также использовать другие опыты. Например, можно использовать модели ксенотрансплантата мыши. Такие модели были использованы для исследования большого диапазона химикотерапевтических агентов (см. Howard и др., Cancer Res. 51, с. 3274, 1991 и McLemoer и др., Cancer Res. 47, с. 5132, 1987).

Такая пролиферация клеток может сопровождаться лейкемией, например хроническим лимфолейкозом В-клеток. Млекопитающие, которым дают композицию согласно изобретению, предпочтительно представляют собой люди, страдающие от зависящей от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток.

Фармацевтические композиции, содержащие интерлейкин-10, обычно дают внутривенно. Интерлейкин-10 может также иметься во включенном в липосомы виде.

В рамках настоящего изобретения под "зависящей от интрелейкина-2 пролиферации опухолевых клеток" понимается новый или отклоняющийся от нормы рост ткани, причем рост происходит неконтролируемым прогрессивным способом, а пролиферация зависит от интерлейкина-2. Рост может быть доброкачественным или злокачественным. Злокачественный рост обычно характеризуется большей степенью анаплазии (дедифференцировки) опухолевых клеток. Зависящие от интерлейкина-2 опухолевые клетки обычно получают из лимфоидных или миелоидных линий.

Интерлейкин-2 производится Т-клетками и многообразным образом влияет на разные виды клеток, включая Т-клетки, NK-клетки и В-клетки. Выявилось, что интерлейкин-2 действует в качестве фактора роста Т-клеток и поощряет производство цитокинов Т-клетками, когда последние стимулируют в присутствии интерлейкина-2. Интерлейкин-2 активирует NK-клетки к лизисе целевых клеток неспецифическим к главному комплексу гистосовместимости способом. Кроме того, интерлейкин-2 играет некоторую роль при экспансии коммитированных клеток, таким образом поощряя производство антител этими клетками.

Из-за описанных действий интерлейкина-2 торможение его производства интерлейкином-10 может представлять собой важный вклад при терапии разных болезней. Например, им можно воспользоваться для снижения поощряемой интерлейкином-2 пролиферации Т-клеток в ситуациях, в которых пролиферация и рост Т-клеток являются нежелательными, например при аутоиммунных болезнях, как например аутоиммунном тиреоидите, зависящем от инсулина диабете, ревматическом артрите, системном эритематозе и множественном склерозе.

Кроме того, способностью интерлейкина-10 к снижению поощряемой интерлейкином-2 экспансии Т-клеток можно было воспользоваться при терапии острых заболеваний, вызванных реакцией пациента против трансплантата, и хронических воспалительных болезней, как например воспалительного заболевания кишечника, саркоидного фиброза и фиброза легких. Далее, путем торможения поощряемой интерлейкином-2 пролиферации аллерген-специфических Т-клеток, являющихся сильными производителями интерлейкина-4 и интерлейкина-5, интерлейкин-10 можно использовать для лечения аллергических болезней, как например астмы или атопического дерматита.

К болезням, в которых некоторую роль играет рост опухолевых клеток и которые можно лечить с применением композиций согласно изобретению, относятся также зависящие от интерлейкина-2 лейкозы, как например хронический лимфолейкоз В-клеток или Т-клеточный лейкоз взрослых. Предлагаемые фармацевтические композиции пригодны для дачи в качестве разных препаратов. Разные формы дачи описаны, например, Langer (см. Science 249, с. 1527, 1990). Способы получения пригодных для дачи препаратов известны и более подробно описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Science, 17-е издание, издательство Mack Publishing Company, г. Easton, Пенсильвания, США, 1985.

Интерлейкин-10, используемый в рамках настоящего изобретения, можно получать в качестве препарата в фармацевтически приемлемой среде, например солевом растворе, фосфатсодержащем солевом буфере, растворе Рингера, смеси декстрозы и солевого раствора, растворе Ханка или глюкозе. Композиция может содержать фармацевтически переносимые вспомогательные агенты, требуемые для их приближения к физиологическим условиям, например буферы, тонизирующие агенты, увлажнители, детергенты и т.п. Кроме того, композиция может содержать дальнейшие активные вещества, как например бактерицидные агенты или стабилизаторы. Доза может колебаться в зависимости от вида активного вещества, конкретного состава препарата, цели дачи (профилактика или лечение), состояния пациента, способа дачи и т.д.

Фармацевтические препараты обычно предназначены для трансдермальной или парентеральной дачи, например внутривенной, подкожной или внутримышечной дачи. Путем изменения препарата с тем, чтобы он не разлагался в желудке, его можно также приспосабливать к оральной даче. Как уже указывалось, композицию согласно изобретению можно применять в целях профилактики и/или лечения. Предпочтительно ее дают внутривенно. Так, например, изобретением охватываются композиции, содержащие полипептид интерлейкина-10 в растворенном или суспендированном в приемлемом носителе виде, причем предпочтительно использован водный носитель. Препараты можно стерилизовать известным методом или путем стерильной фильтрации.

Полученные водные растворы можно упаковать как таковые, или их можно подвергать лиофилизации, и полученный препарат перед дачей объединяют с стерильным водным носителем. Интерлейкин-10 можно также дать вместе с другим биологически активным агентом, например известным хемотерапевтическим веществом. К последним относятся, например, винкристин, даунорубицин, L-аспарагиназа, митоксантрон, амсакрин и другие.

В целях лечения фармацевтическую композицию дают пациенту в количестве, достаточном для торможения зависящей от интерлейкина-2 пролиферации опухолевых клеток. Количество, пригодное для достижения желаемого эффекта, называется "терапевтически эффективной дозой". Терапевтически эффективная доза интерлейкина-10 может колебаться в зависимости от того, для какой терапии предназначен конкретный препарат, от способа дачи, здоровья и состояния пациента и усмотрения врача. Например, при постоянной инфузии доза обычно составляет примерно от 500 нг до 800 мкг в сутки при весе тела пациента, составляющем 70 кг, предпочтительно примерно от 10 до 300 мкг. Типичная доза составляет от 700 нг до 16 мкг в сутки на кг веса тела.

Концентрация интерлейкина-10 в фармацевтических композициях может сильно колебаться и составлять примерно от 10 мкг до 5 мг на мл, предпочтительно примерно от 100 мкг до 2 мг на мл. Концентрацию обычно выбирают в соответствии с объемом среды, вязкости и т.д. в зависимости от конкретного способа дачи. Например, типичный препарат, предназначенный для внутривенной инфузии, может содержать 250 мл смеси декстрозы и солевого раствора и 2,5 мг интерлейкина-10.

В случае твердых препаратов можно использовать известные нетоксичные твердые носители, как например фармацевтические формы маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, натриевого сахарина, талька, целлюлозы, глюкозы, сукрозы, карбоната магния и т.п. Предназначенный для оральной дачи фармацевтически приемлемый нетоксичный препарат содержит известный разбавитель, например один из вышеуказанных носителей, и 10-95%, предпочтительно 25-75% активного вещества, то есть полипептида интерлейкина-10 согласно изобретению.

Для дачи в виде аэрозоля интерлейкин-10 предпочтительно имеется в тонкораспределенном виде в комбинации с поверхностно-активным веществом и носителем. В данном случае интерлейкин-10 обычно имеется в количестве 0,01 - 20, предпочтительно 1-10% от веса общего препарата. Конечно поверхностно-активное вещество должно быть нетоксичным и предпочтительно способным к растворению в носителе. В качестве таких веществ можно называть, например, сложные эфиры или неполные сложные эфиры жирных кислот, содержащих 6 - 22 атома углерода, например капроновой кислоты, каприловой кислоты, лауриновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты, линолевой кислоты, линоленовой кислоты или олеиновой кислоты, с алифатическим полугидридным спиртом или его циклическим ангидридом, например этиленгликолем, глицерином, эритритолом, арбитом, маннитом или сорбитом, или гекситным ангидридом сорбита, и полиоксиэтиленовыми и полиоксипропиленовыми производными данных сложных эфиров. Можно также использовать смешанные сложные эфиры, как например смешанные или естественные глицериды.

Поверхностно-активное вещество может иметься в количестве от 0,1 до 20, предпочтительно 0,25-5% от веса препарата. Главным компонентом препарата обычно является носитель. В качестве последнего обычно используют вещество, в нормальных условиях имеющееся в газовом состоянии, в конденсированном под давлением виде. В качестве примеров ожиженных носителей можно называть, например, низшие алканы с числом атомов углерода до 5, как например бутан или пропан и предпочтительно фторированные алканы, или фторхлоралканы или их смеси. В случае аэрозоля резервуар, снабженный пригодным соплом, наполняют пригодным носителем, содержащим тонкораспределенный (тонкораспределенные) пептид(ы) и поверхностно-активное вещество. Таким образом компоненты находятся при повышенном давлении до их выпуска через сопло.

Для продления периода полураспада сыворотки интерлейкин-10 можно заключать в капсулах, вводить в полость липозом, приготовлять в виде коллоида, или можно использовать другие известные методы, продлевающие долговечность пептидов. Так, например, в некоторых случаях интерлейкин-10 можно заключать в липозомах. Известны разные методы получения липозом (см., например, Szoka и др. , Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9, с. 467, 1980, или патенты США N 4235871, 4501728 и 4837028).

После получения липозом их размер можно варьировать желаемым образом с получением липозом со сравнительно узким гранулометрическим составом.

Даже при применении самого эффективного метода заключения в капсулы первичная суспензия липозом может содержать 50% или больше активного вещества в свободном (незаключенном в капсулы) виде. Известны разные методы удаления незаключенного активного вещества из суспензии липозом. Например, согласно одному методу имеющиеся в суспензии липозомы переводят в гранулят путем высокоскоростного центрифугирования, после чего свободное активное вещество и очень мелкие липозомы содержатся в сверхосадочной жидкости. Согласно другому методу суспензию сгущают путем ультрафильтрации с последующим повторным суспендированием концентрированных липозом в замененной среде. Другая альтернатива заключается в гель-фильтрации, причем большие липозомы отделяются от растворенных молекул.

После вышеописанной переработки липозомсодержащую суспензию доводят до желаемой концентрации, пригодной для внутривенной дачи. Если липозомы имеются в концентрированном виде в результате центрифугирования или ультрафильтрации, то для получения пригодного для внутривенной дачи препарата липозомы можно повторно суспендировать в определенном количестве инъекционного раствора, а если объем суспензии большой, то ее можно сгущать. После этого полученную суспензию можно вышеописанным методом стерилизировать путем фильтрации. Липозомы, содержащие пептиды согласно изобретению, можно дать парентерально вышеописанным способом.

Повышение производства -интерферона.

Фармацевтические композиции, предназначенные для увеличения содержания -интерферона, особенно полезны в том случае, если пациент болен инфекционной болезнью, приводящей к торможению производства -интерферона иммунной системой пациента вследствие производства интерлейкина-4 и интерлейкина-10. В качестве таких болезней можно называть, например, индийский висцеральный лейшманиоз, лепроматозную лепру и мукозы, причем к последним относятся, например, кандидамикоз, паракокцидиоидомикоз, бластомикоз и криптоспироидиум.

Определенные инфекционные организмы или непосредственно, или косвенно извлекают пользу при низком содержании -интерферона. Такие инфекции часто являются хроническими, и их типическим признаком является неравновесие реакции Т-клеток-помощников 2 по сравнению с Т-клетками-помощниками 1 на инфекционный агент. В результате данного неравновесия производство -интерферона клетками Th1 тормозится вследствие производства интерлейкина-4 и интерлейкина-10 Т-клетками-помощниками 2.

Антитела, получаемые в рамках настоящего изобретения, предпочтительно являются аутологичными для пациента. Полезны также антитела, представляющие собой не собственные антитела, но получаемые из клеток того же вида. Можно также использовать антитела, полученные из другого вида, но при этом рекомендуется применение методов, снижающих вероятность отрицательной иммунной реакции. Иммунную реакцию человека можно сократить до минимума, например, при использовании гуманизованных антител крысы. Предпочтительно антитела имеют константы связывания, приближенные к сродству интерлейкина-4 и интерлейкина-10 к их естественным рецепторам, или превышающие данное сродство.

Предпочтительными являются антитела, константа связывания до 100 раз превышает константу связывания данных цитокинов к их соответствующим рецепторам. Сравнение связывания можно осуществлять путем известных методов равновесия. Основной подход описан в главе 25 в Immunochemistry, том 1, под ред. D. М. Weir, 4-е издание, 1986, издательство Blackwell Scientific Publ, пункты 25.1 - 25.30. Альтернативно можно исследовать молярный избыток антитела, нейтрализующий определенное количество интерлейкина-4 или интерлейкина-10 в стандартном биологическом опыте in vitro. Такие опыты описаны в Mosmann и др. (см. J. Immunol. Methods 116, с. 151, 1989) (для интерлейкина-4), и Fiorentino и др. (см. J. Exp. Med. 170, с. 2081, 1989). Возможное количество антител, нейтрализующее определенное количество интерлейкина-4 или интерлейкина-10, представляет собой 10 - 1000-кратный избыток.

В контексте настоящего изобретения под "совместной дачей" подразумевается дача антител против интерлейкина-4 и интерлейкина-10 в таком небольшом периоде, что они одновременно находятся в теле пациента. При этом конкретная последовательность дачи не играет никакой роли, антитела можно дать или одновременно, или отдельно, после предварительного смешивания или же путем отдельной дачи.

Антитела обычно дают парентерально, предпочтительно внутривенно. Их можно дать путем инфузии путем известных методов. Антитела сперва суспендируют в стерильной, физиологически приемлемой среде, например фосфатсодержащем солевом буфере, причем вместе с антителами можно также суспендировать фармацевтически приемлемые разбавители, как например лецитин, глюкозу, декстрозу или антибиотики.

При совместной даче антител доза каждого антитела составляет от 1 до 10 мг на кг веса тела. Желательно, чтобы антитела давали в количестве, обеспечивающем концентрацию каждого антитела в сыворотке примерно 1 - 150, предпочтительно 10 - 100 мкг на мл. Обычно период полураспада антител составляет 2 - 7 дней, и рекомендуется повторная дача при снижении содержания антитела под желаемый уровень. Содержание антител в пробах сыворотки можно определять путем известного иммунологического анализа, предпочтительно путем твердофазного иммуноферментного анализа.

Хотя согласно описанному здесь варианту изобретения используют моноклональные антитела против интерлейкина-4 и интерлейкина-10, можно также использовать другие антагонисты, например антитела, специфически связывающиеся с рецепторами интерлейкина-4 и интерлейкина-10, таким образом препятствуя связыванию цитокина. Кроме того, можно использовать способные к растворению формы рецепторов интерлейкина-4 и интерлейкина-10, не содержащие трансмембранный домен. Далее, пригодны также мутированные антагонистические формы интерлейкина-4 и интерлейкина-10, проявляющие сильное связывание с соответствующими рецепторами, но в основном не обладающие биологической активностью. Такой антагонист в виде мутированного интерлейкина-4, в котором тирозин в положении 124 дикого человеческого интерлейкина-4 заменен аспарагиновой кислотой, описан Kruse и др. (см. ЕМВО J. 11, с. 3237, 1992).

Совместную дачу антител предпочтительно осуществляют внутривенно с использованием стерильной водной смеси, которая может содержать любой фармацевтически приемлемый разбавитель, например стерильный буфер, солевой раствор, антибиотики и т.п.

Обычно дачу прекращают, когда инфекция является под контролем, судя по клинической реакции пациента. В сочетании с композицией согласно изобретению можно также применять известные антибиотические терапии.

Воспалительное заболевание кишечника.

Под термином "воспалительное заболевание кишечника" в рамках настоящего изобретения подразумевается язвенный колит или болезнь Крона. Для лечения воспалительного заболевания кишечника интерлейкин-10 предпочтительно дают парентерально, например внутрисосудисто, в частности внутривенно, причем лечимое млекопитающее представляет собой человек.

Интерлейкин обычно дают в количестве примерно 1 мкг - 100 мг на 1 кг веса тела. Часто доза будет находиться в пределах примерно от 10 мкг до 1000 мкг на 1 кг веса тела, а наиболее предпочтительно доза составляет примерно от 50 до 100 мкг на 1 кг веса тела.

Интерлейкин-10 можно дать или отдельно, или вместе с одним или некоторыми дополнительными терапевтическими агентами. В качестве примеров таких агентов, пригодных для контроля периодических воспалений кишечной ткани, можно называть кортикостероиды, сульфазалазины и их производные, иммуносупрессоры, как например циклоспорин А, меркаптопурин и азатиоприн, и другие цитокины. При этом совместную дачу можно осуществлять или последовательно, или одновременно. В об