Фрагменты днк, кодирующие эритропоэтин человека, рекомбинантные днк, линия клеток, рекомбинантный о- гликозилированный эритропоэтин человека, фармацевтическая композиция

Фрагменты днк, кодирующие эритропоэтин человека, рекомбинантные днк, линия клеток, рекомбинантный о- гликозилированный эритропоэтин человека, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Использование: биотехнология, медико-биологическая промышленность, медицина. Сущность изобретения: клонированы фрагменты геномной ДНК из фетальной печени человека и соответствующие фрагменты кДНК, обеспечивающие высокие уровни экспрессии эритропоэтина в клетках млекопитающих, получена линия клеток СНО продуцент рекомбинантного ЭПО (CHO EPO Cla 44.02-7); в результате экспрессии клонированных фрагментов ДНК в клетках млекопитающих получен О-гликозилированный ЭПО человека с удельной активностью не менее 200000 ед/мг и фармацевтическая композиция, использующая указанный рекомбинантный ЭПО в качестве активного начала. 10 с. и 2 з.п. ф-лы, 12 ил., 11 табл.

Изобретение касается клонированных ДНК, кодирующих человеческий эритропоэтин, экспрессии указанных ДНК и получения in vitro активного эритропоэтина человека.

Эритропоэтин (далее ЭПО) представляет собой циркулирующий гликопротеид, который стимулирует образование эритроцита в высших организмах (см. Carnot и др. , Compt. Rend, 143:384 (1906)). ЭПО иногда упоминается еще и как фактор, стимулирующий эритропоэз.

Продолжительность жизни человеческих эритроцитов составляет около 120 дней. Таким образом, около 1/120 общего числа эритроцитов разрушается ежедневно в ретикуло-эндотелиальной системе. Однако относительно постоянное число эритроцитов продуцируется ежедневно для поддержания постоянного уровня эритроцитов (Guyton, Textbook of Medikal Physiology, стр. 56-60, W.B. Saunders Co., Филадельфия (1976)).

Эритроциты продуцируются путем созревания и дифференцировки эритробластов в костном мозге, и ЭПО является фактором, который воздействует на менее дифференцированные клетки и индуцирует их дифференцировку в эритроциты (Guyton, выше).

ЭПО представляет собой многообещающее терапевтическое средство для клинического лечения анемии, и в частности ренальной анемии. К сожалению, использование ЭПО еще не является общепринятым в практической терапии вследствие его малой доступности.

При использовании ЭПО в качестве терапевтического средства особое значение приобретает вопрос антигенности. Предпочтительно, чтобы ЭПО был получен из сырья человеческого происхождения, например, из крови или мочи пациентов, страдающих апластической анемией или подобными болезнями, при которых выделяются большие количества ЭПО. Эти исходные материалы, однако, существуют в ограниченном количестве (См., например, White и др., Rec, Progr. Horm. Res., 16-219 (1960); Espada и др., Biochem. Med. 3:475 (1970); Fischer, Phurm. Rev., 24:459 (1972) и Gordon, Vitam, Horm. (N.Y.) 31:105 (1973).

Получение ЭПО, как правило, осуществляется путем концентрирования и очистки мочи пациентов с названными заболеваниями (см., например, патенты США NN 439780, 4303650 и 3865801, раскрытие которых введено сюда в качестве ссылки). Ограниченный запас такой мочи служит препятствием практическому использованию ЭПО. Трудность же в использовании мочи от здоровых людей заключается в низком содержании в ней ЭПО по сравнению с мочой пациентов, страдающих анемией. Кроме того, моча здоровых людей содержит определенные ингибирующие факторы, поэтому удовлетворительный терапевтический эффект может быть получен только при условии последующей значительной очистки получаемого таким образом ЭПО.

ЭПО также может быть выделен из плазмы крови овцы, причем выделение ЭПО из этого источника обеспечивает создание достаточно сильнодействующих и устойчивых водорастворимых препаратов (см. Coldwasser, Control Cellular Dif. Develop. , Часть A, стр. 487-494, Alan R. Liss, Inc., Нью-Йорк (1981), которая введена сюда в качестве ссылки). ЭПО овцы, однако, может обладать антигенным эффектом.

Таким образом, традиционные методики выделения и очистки, используемые при получении ЭПО из естественных источников снабжения, являются малопригодными для его массового производства.

Sugimoto и др. в патенте США N 4377513 описывают один способ массового производства ЭПО, предусматривающий размножение in vivo лимфобластоидных клеток человека, таких как Namalva, BAL L - 1, TAL L - 1, TAL L - 1 и JBL.

В специальной литературе появилось также описание получения ЭПО с использованием методов генетической инженерии. Однако еще не опубликовано ни пригодного раскрытия указанных способов, ни химической природы продукта. В противоположность этому настоящая заявка предлагает пригодный для массового производства способ получения белков, проявляющих биологические свойства человеческого ЭПО. С помощью этих методик можно также получить белки, которые могут химически отличаться от аутентичного человеческого ЭПО и все же обнаруживать аналогичные (а в некоторых случаях и улучшенные) свойства. Для удобства все такие белки, проявляющие биологические свойства человеческого ЭПО, упоминаются далее как ЭПО.

Настоящее изобретение касается клонирования последовательности ДНК, которая обеспечивает высокие уровни экспрессии человеческого ЭПО. Также описываются пригодные векторы экспрессии и клеточные системы для получения ЭПО, схемы очистки рекомбинантного продукта, приводятся его характеристики.

Как описывается более подробно ниже, ЭПО был выделен в частично очищенной форме, подвергнут дальнейшей очистке до гомогенности и переварен трипсином для получения специфических фрагментов. Эти фрагменты были очищены и подвергнуты определению последовательностей. На основе этих последовательностей сконструированы и синтезированы олигонуклеотиды, которые затем были использованы для скрининга человеческой геномной библиотеки, ген ЭПО был выделен с целью выделения гена ЭПО.

На базе мРНК из печени плода человека (в возрасте 20 недель) была получена и подвергнута скринингу кДНК-библиотека. Выделены три клона кДНК ЭПО (после скрининга > 750000 рекомбинантов). Два из них были определены как имеющие полную длину. Образец E. coli, трансформированной полноразмерной последовательностью, кодирующей ЭПО, был депонирован в АТСС, Rockville, Maryland под номером 40153. Эти кДНК были экспрессированы как в трансформированных вирусом SV-40 клетках обезьяны (клеточная линия COS-1; Gluzman, Cell 23: 175-182 (1981)), так и в клетках яичника китайского хомячка (клеточная линия CHO; Urlaub, G. и Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci США 77: 4216-4280 (1980)). ЭПО, полученные в клетках млекопитающих, являются биологическими активными in vitro и in vivo.

Таблица 1 представляет собой последовательность экзона из 87 пар оснований гена ЭПО человека.

Фиг. 1 иллюстрирует обнаружение мРНК ЭПО в мРНК печени плода человека.

Таблица 2 представляет аминокислотную последовательность ЭПО, выведенную из нуклеотидной последовательности клона -HEPOF L 13.

Таблица 3 представляет нуклеотидную последовательность кДНК ЭПО в -HEPOF L 13 (показана схематически на фиг. 2) и аминокислотную последовательность, выведенную из нее.

Фиг. 3 иллюстрирует относительные положения вставок ДНК четырех независимых геномных клонов человеческого ЭПО.

Фиг. 4 представляет собой карту интронной и экзонной структуры гена ЭПО человека.

Таблица 4 иллюстрирует ДНК-последовательность гена ЭПО, схематически показанного на фиг. 4.

Фиг. 5 - 9 иллюстрируют конструирование вектора p91023(B).

Фиг. 10 изображает результаты сравнительного анализа в SDS-полиакриламидном геле ЭПО, полученного в клетках COS-1, и нативного ЭПО.

Таблица 5 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности вставки клона -HEPOF L 6.

Таблица 6 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности вставки клона -HEPOF L 8.

Таблица 7 иллюстрирует нуклеотидную и аминокислотную последовательности вставки клона -HEPOF L 13.

Фиг. 11 представляет схематическое изображение плазмиды pRK 1-4.

Фиг. 12 представляет собой схематическое изображение плазмиды pdBPY-MMTneo (342-12).

Настоящее изобретение касается клонирования последовательностей ДНК, кодирующих ЭПО, полученного путем экспрессии этих последовательностей рекомбинантного продукта.

A. Выделение геномного клона человеческого ЭПО Человеческий ЭПО был очищен до гомогенности из мочи пациентов, страдающих апластической анемией, как описано ниже. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином дало фрагменты, которые были разделены высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой, восстановлены из градиентных фракций и подвергнуты микросеквенированию. Последовательности триптических фрагментов подчеркнуты в таблицах 2 и 3 и обсуждены более подробно ниже. Две из аминокислотных последовательностей (Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys и Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg) были выбраны для конструирования олигонуклеотидных зондов (олигонуклеотидный пул 17-членников с 32-кратным вырождением и олигонуклеотидный пул 18-членников с 128-кратным вырождением - для первого триптического фрагмента, а также два пула 14-членников, каждый с 48-кратным вырождением, - для второго триптического фрагмента). 32-кратный дегенеративный 17-членник был использован для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Ch4 A (22) с использованием модификации метода амплификации in situ Woo и O'Malley [4] для получения фильтров для скрининга.

Арабские числа в скобках [1 - 59] используются в настоящем описании для ссылок на публикации, которые приводятся в числовом порядке в конце описания настоящего изобретения.

Фаг, гибридизирующийся с 17-членником, был упакован, распределен на малые группы и опробован с 14-членными и 18-членными пулами. Фаг, гибридизирующийся с 17-членниками, 18-членниками и 14-членниками, был очищен, а фрагменты были субклонированы в векторы М13 для секвенирования путем дидезокси-метода обрыва цепи, описанного Sanger и Conlson [23].

Последовательность области одного из клонов, гибридизирующаяся с 32-кратным дегенеративным 17-членником, показана в табл. 1. Эта последовательность ДНК содержит внутри открытой рамки считывания нуклеотидную последовательность, кодирующую триптический фрагмент, использованный для построения 17-членного пула олигонуклеотидов. Кроме того, анализ последовательности ДНК показывает, что гибридизирующаяся с 17-членником область содержится внутри 87 вр-экзона.

Подтверждение того, что эти два клона (обозначены здесь -HEPO1 и -HEPO2) являются геномными клонами ЭПО, получено путем секвенирования дополнительных экзонов, содержащих области кодирования и другого триптического фрагмента.

B. Выделение клонов кДНК ЭПО.

Northern-(56) анализ человеческой фетальной (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществляли с использованием 95-членного олигонуклеотидного однонитевого зонда, полученного из клона М13, содержащего участок 87 вр-экзона, описанного в табл. 1. Как показано на фиг. 1, в мРНК фетальной печени обнаруживается сильный сигнал. Точная идентификация этой полосы как мРНК ЭПО была достигнута с использованием того же зонда для скрининга -кДНК библиотеке мРНК фетальной печени [25]. Было получено несколько гибридизирующихся клонов (с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу рекомбинантов). Полная нуклеотидная и выведенная аминокислотная последовательности для двух клонов ( -HEPOF L 13 и -HEPOF L 8) представлены в табл. 5 и 6. ЭПО-кодирующая информация содержится внутри 594 нуклеотидов в 5'-половине кДНК, включающих кодирование сильно гидрофобного 27-аминокислотного лидера и 166-аминокислотного зрелого белка.

Идентификация N-конца зрелого белка была основана на N-концевой последовательности белка, выделенного из мочи людей с апластической анемией (табл. 1 и Goldwasser [26], Sue и Sytkowski [27] и Yangawa [21]). В настоящее время неизвестно, представляет ли этот N-конец (Ala-Pro-Pro-Arg---) фактический N-конец для ЭПО в системе кровообращения или происходит некоторое расщепление его в почке или моче.

Аминокислотные последовательности, которые подчеркнуты в табл. 2 и 3, обозначают триптические фрагменты и участок N-конца, для которых была получена информация с белковой последовательности. Выведенная аминокислотная последовательность точно согласовывается с последовательностями триптических фрагментов, которые были секвенированы, подтверждая, что выделенный ген кодирует человеческий ЭПО.

C. Структура и последовательность гена ЭПО человека Относительные положения вставок ДНК четырех независимых геномных клонов ЭПО человека показаны на фиг. 3. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов определил положение гена ЭПО внутри области размером приблизительно 3,3 кв, показанной затемненной линией на фиг. 3. Полное секвенирование этой области (см. пример 4) и сравнение с клонами кДНК привели к получению карты интронной и экзонной структуры гена ЭПО, показанной на фиг. 4. Ген ЭПО разделяется на 5 экзонов. Часть экзона 1, полные экзоны II, III и IV, а также часть экзона V содержат белок-кодирующую информацию. Оставшиеся части экзонов I и V представляют 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, соответственно.

6. Экспрессия ЭПО в COS-клетках Для того чтобы наглядно показать, что биологически активный ЭПО может экспрессироваться в системе культуры клеток in vitro, осуществляли исследования экспрессии в клетках COS [57]. Вектор, используемый для переходных исследований, а именно p91023 (B), описан в примере 5. Этот вектор содержит основной поздний промотор аденовируса, последовательность полиаденилирования, сайт начала репликации и энхансер SV40, а также ген VA аденовируса. Вставка кДНК в -HEPOF L 13 (см. таблицу 6) была встроена в вектор p91023 (B) ниже основного позднего промотора аденовируса. Этот новый вектор идентифицирован как pPTF-L 13.

Через двадцать четыре часа после трансфекции этой конструкции в штамм М6 клеток COS-1 (Horowitz и др., T.Mol. Appl. Genet 2:147-149 (1983) (клетки промыли и перевели в свободные от сыворотки среды и через 48 час клетки собрали). Затем с использованием количественного радиоиммунного анализа для ЭПО (57) исследовали уровень высвобождения ЭПО в культуральную надосадочную жидкость. В отдельном эксперименте вектор, содержащий кДНК ЭПО из -HEPOF L 13 был введен в клетки COS-1; среды далее собирали, как описано выше. ЭПО в средах затем определялся количественно любым из двух биологических анализов, проводимых in vitro, а именно с ³H-тимидином и CFV-E [12, 29], и любым из двух анализов in vivo, а именно на гипоксической мыши и голодающей крысе [29, 30] (см. таблицу 9 и пример 17). Эти результаты показывают, что в клетках COS-1 продуцируется биологически активный ЭПО. Western-блоттинг с использованием поликлонального антитела анти-ЭПО показал, что эритропоэтин, продуцируемый клетками COS, имеет подвижность в SDS-полиакриламидных гелях, идентичную подвижности нативного ЭПО, полученного из человеческой мочи (пример 8). Таким образом, гликозилирование продуцированного в COS-1 ЭПО может быть аналогичным тому, что происходит в случае нативного ЭПО.

Различные векторы, содержащие другие промоторы, также могут быть использованы в COS-клетках или в клетках других млекопитающих. Примеры этих иных промоторов, пригодных в практике настоящего изобретения, включают ранние и поздние промоторы SV-40, генный промотор металлотионеина мыши, промотор, обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусов птиц или млекопитающих. Примерами других типов клеток, пригодных в практике настоящего изобретения, являются такие клетки млекопитающих, как CHO (яичник китайского хомячка), С127 (эпителий обезьяны), ЗТ3 (мышиный фибробласт), CU-1 (почка африканской зеленой мартышки).

Примеры экспрессии ЭПО в СНО, С127 и ЗТ3 представлены в примерах 10 и 11 (СНО) и 13 (С127 и ЗТ3).

Рекомбинантный ЭПО, полученный в клетках СНО, как в примере 11, был очищен традиционными методами колоночной хроматографии. Относительные количества сахаров, присутствующих в гликопротеиде, анализировали двумя самостоятельными методами (1) Reinhold, Methods in Enzymol, 50:244-249 (Метанолиз) и (II) Takemoto, H. и др. Anal. Biochem. 145:245 (1985) (пирил-аминирование, совместно с самостоятельным определением сиаловой кислоты). Результаты, полученные каждым из этих способов, полностью согласовывались друг с другом. Таким образом было проделано несколько определений, что дало средние значения, где N-ацетилглюкозамин для сравнительных целей дан как значение 1: Сахар - Относительный молярный уровень N-Ацетилглюкозамин - 1 Гексозы: - 1,4 Галактоза - 0,9 Манноза - 0,5 N-Ацетилнейроминовая кислота - 1 Фукоза - 0,2 N-Ацетилгалактозамин - 0,1 Примечательно, что значительные уровни содержания фукозы N-ацетилгалактозамина воспроизводимо наблюдались при использовании обоих самостоятельных методов анализа на сахар. Присутствие N-ацетилгалактозамина указывает на наличие O-сцепленного гликозилирования белка. Наличие O-сцепленного гликозилирования далее подтверждалось анализом в SDS-PAGE. В частности, вслед за ферментативным отщеплением всего N-сцепленного углевода на гликопротеидах с использованием эндо-F N-гликозид-пептидазы молекулярная масса белка еще более снижалась после последовательного переваривания нейраминидазой.

Биологическая активность in vitro очищенного рекомбинантного ЭПО была определена методом C.Krystal, Exp. Hematol., 11:649 (1983) (биопроба на пролиферацию клеток селезенки). После многократных определений удельная активность in vitro очищенного рекомбинантного ЭПО была найдена составляющей более, чем 200000 единиц/мг белка. Среднее значение находилось в интервале 275000-300000 единиц/мг белка. Кроме того, также наблюдались значения выше чем 300000. Отношения активности in vivo (анализ полицитемических мышей, Kazal и Erslev, hm. Clinical Lab. Sci., Том B, стр. 91 (1975)) к активности in vitro, полученные для рекомбинантного продукта, находились в интервале 0,7-1,3.

Интересно сравнивать представленную выше характеристику гликопротеида с характеристикой рекомбинантного CHO-продуцируемого ЭПО, ранее изложенной в Международной заявке на патент N WO 85/02810 (опубликована 20 июня 1985 года). Аналогичный сравнительный анализ на сахар, представленный на стр. 65 данной заявки, показывает, что значение для фукозы и N-ацетилгалактозамина равны 0, тогда как отношение гексоза: N-ацетилгалактозамин равно 15,09: 1. Отсутствие N-ацетилгалактозамина указывает на отсутствие O-сцепленного гликозилирования в полученном гликопротеиде. В противоположность этому охарактеризованный выше рекомбинантный CHO-продуцируемый ЭПО настоящего изобретения содержит значительные и воспроизводимо обнаруживаемые количества как фукозы, так и N-ацетилгалактозамина, менее 1/10 относительного количества гексоз и отличается наличием O-сцепленного гликозилирования. Высокая удельная активность вышеописанного рекомбинантного ЭПО может быть непосредственно связана с особенностями его гликозилирования.

Биологически активный ЭПО, полученный экспрессией клонированных последовательностей ДНК для ЭПО настоящего изобретения, может быть использован для лечения. Количество активного компонента, безусловно, будет зависеть от жесткости режима, выбранного пути введения и удельной активности активного ЭПО, и в конечном счете будет определяться лечащим врачом или ветеринаром. Это количество активного ЭПО, определенное в каждом случае лечащим врачом, упоминается здесь как "эффективное для лечения количество ЭПО". Например, при лечении индуцированной гипопролиферативной анемии, ассоциированной с хронической почечной недостаточностью, у овцы эффективное суточное количество ЭПО найдено равным 10 единицам/кг в течение 15-40 дней. См. Eschbach и др., J. Clin. Invest., 73:434 (1984).

Активный рекомбинантный ЭПО может вводиться любым путем, подходящим для используемых условий. Предпочтительна инъекция ЭПО в кровоток млекопитающего. Специалисту, однако, ясно, что предпочтительный путь введения изменяется в зависимости от выбранного режима.

Активный ЭПО можно вводить как чистое (или в основном чистое) соединение, но предпочтительно иметь его в виде фармацевтической композиции или препарата.

Композиции настоящего изобретения как для ветеринарного, так и для человеческого применения, содержат активный рекомбинантный ЭПО, как описано выше, вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и, при необходимости, другими терапевтическими средствами. Носитель (носители) может быть "приемлемым" в смысле его совместимости с другими компонентами композиции и невредным для его реципиента. Желательно, чтобы композиция не включала окислитель и другие вещества. Композиции могут быть получены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики. Все способы включают стадию связывания активного компонента с носителем, который составляет один или более вспомогательных компонентов. В основном, рецептуры приготавливают путем однородного и тщательного смешивания активного компонента с жидкими носителями, или тонкоизмельченными твердыми носителями, или с обоими сразу, после чего, если необходимо, осуществляют формование продукта.

Композиции, пригодные для парэнтерального введения, включают стерильные водные растворы активного компонента с растворами, предпочтительно изотоническими. Такие композиции можно приготавливать путем растворения твердого активного компонента в воде для получения водного раствора. Придание стерильности указанному раствору может достигаться в одноразовых или многодозовых контейнерах, например, запаянных ампулах или пробирках.

Для лучшего понимания настоящего изобретения, действительный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения, приводятся нижеследующие примеры. Понятно, что в предлагаемых методах могут быть выполнены модификации в пределах сущности настоящего изобретения.

Примеры Пример 1: Выделение геномного клона ЭПО.

ЭПО очищают от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, в основном, как описано ранее (Miyake и др., J. Biol. Chem., 252:5558 (1977)), за исключением того, что фенольную обработку заменяют термообработкой при температуре 80^oC в течение 5 минут для инактивации нейраминидазы. Конечной стадией очистки является фракционирование на колонке C-4 Vydac высокоэффективной жидкостной хроматографии (Группа Сепараций) с использованием градиента ацетонитрила от 0 до 95% с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФК) в течение 100 минут. Положение ЭПО в градиенте определяют электрофорезом в геле и анализом N-концевой последовательности [21, 26, 27] основных пиков. ЭПО элюируют при 53% ацетонитрила. Фракции, содержащие ЭПО, выпаривают до 100 мкл, доводят до pH 7,0 бикарбонатом аммония, переваривают полностью 2%-ным ТРСК-обработанным трипсином (Worthington) в течение 18 ч при температуре 37^oC. Триптический перевар затем подвергают ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано выше. Определяют оптическую плотность при 280 и 214 нм. Хорошо отделенные пики выпаривают почти насухо и подвергают непосредственно анализу N-концевой аминокислотной последовательности [59] , используя газофазный секвенатор Модели 480Ф Applied Biocyctems. Полученные последовательности приведены в табл. 2 и 3. Как описано выше, два из этих триптических фрагментов отбирают для синтеза олигонуклеотидных зондов. Из последовательности Val-Asn-Phe-Tyr-Ala-Trp-Lys (аминокислоты 46 - 52 в табл. 2 и 3) получают 17-членник с 32-кратной вырожденностью.

и 18-членник с 128-кратной вырожденностью Из последовательности Val-Tyr-Ser-Asn-Phe-Leu-Arg (аминокислоты 144 - 150 в табл. 2 и 3) получают два пула 14-меров, каждый - с 32-кратной вырожденностью.

которые отличаются в первом положении лейцинового кодона. Олигонуклеотиды помечают на 5'-конце ³²P, используя полинуклеотидкиназу (New England Biolabs) и гамма ³²P-ATP (New England Nuclear). Удельная активность олигонуклеотидов варьирует между 1000 и 3000 дюйм³/ммол олигонуклеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда (Lawn и др., [22]) подвергают скринингу с использованием модификации методики амплификации in situ, первоначально описанной Woo и др. [47]. Приблизительно 3,5 10⁵ фагов высевают с плотностью 6000 фагов на 150 мм чашку Петри (среды NZCYM) и инкубируют при температуре 37^oC до тех пор, пока пятна не станут видимыми, однако маленькими (приблизительно 0,5 мм). После охлаждения при температуре 4^oC в течение 1 ч дупликатные реплики картин пятен переносят на найлоновые мембраны (New England Nuclear) и инкубируют в течение ночи при температуре 37^oC на чашках со свежими средами NZCYM. Затем денатурируют и нейтрализуют флотированием каждого в течение 10 мин на тонкой пленке 0,5H NaOH - 1 M NaCl и 0,5 M Tris (pH 8) - 1M NaCl, соответственно. Вслед за вакуумной сушкой при температуре 80^oC в течение 2 часов фильтраты промывают в 5 x SSC, 0,5% SDS в течение 1 часа, и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскабливание снижает фоновое связывание зонда с фильтрами. Фильтры затем промывают водой и предварительно гибридизируют от 4 до 8 ч при температуре 48^oC в 3М растворе тетраметиламмонийхлорида, 10 мМ NaPO₄ (pH 6,8), 5 x D-Enhardt's, 0,5% SDS и 10 мМ ЭДТА. 17-членник, меченый ³²P, затем прибавляют при концентрации 0,1 пмол/мл и осуществляют гибридизацию при температуре 48^oC в течение 72 ч. Затем фильтры последовательно промывают в 2 SSC (0,3 M NaCl - 0,03 M цитрат натрия, pH 7) при комнатной температуре, в течение 1 ч в 3 M TMAC1 - 10 мМ NaPO₄ (pH 6,8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин - при температуре гибридизации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают после 2-дневной авторадиографии. Положительные сигналы отбирают, группируют в пулы по 8, пересеивают и вновь подвергают скринингу в трипликате с использованием 1/2 пула 14-членников на каждом из двух фильтров и 17-мера - на третьем фильтре. Условия и 17-членник для высевания и гибридизации такие же, как описано выше, за исключением того, что гибридизацию для 14-членника осуществляют при температуре 37^oC. Вслед за авторадиографией 17-членный зонд удаляют с фильтра в 50%-ном формамиде в течение 20 минут при комнатной температуре, а фильтр повторно гибридизируют при температуре 52^oC с 18-членным зондом. Два независимых фага гибридизируются со всеми тремя зондами. ДНК одного из этих фагов (обозначен здесь -HEPO1) переваривают полностью с помощью San 3A и субклонируют в М13 для анализа ДНК-последовательности с использованием дидезокси-метода обрыва цепи, предложенного Sanger и Conlson, [23]. Нуклеотидная последовательность и выведенная аминокислотная последовательность открытой рамки считывания, кодирующей триптический фрагмент ЭПО (подчеркнутая область), описаны здесь. Интронные последовательности даны в строчных буквах, экзонные последовательности (87 нуклеотидов) даны в прописных буквах. Последовательности, которые согласуются с сайтами акцептора сращивания (a) и донора (d), подчеркнуты (см. табл. 4).

Пример 2: Northern - анализ мРНК печени плода человека.

5 мкг мРНК человеческой фетальной печени (20-недельной) и мРНК печени взрослого подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном формальдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу, используя метод Derman и др., Cell, 23:731 (1981). Из М13, содержащего вставку, показанную в таблице 1, затем получают однонитевой зонд. Праймером является 20-членник, происходящий из того же триптического фрагмента, что и первоначальный 17-членный зонд. Получение зонда проводят, как описано Anderson и др., PNAS, [49], за исключением того, что вслед за отщеплением Smal (которое продуцирует желательный зонд длиной 95 нуклеотидов, содержащий 74 нуклеотидов кодирующей последовательности) малый фрагмент очищают из М13 хроматографией на колонке с Сефарозой C14B и 0,1 N NaOH - 0,2 M NaCl. Фильтр гибридизируют с зондом приблизительно до 5 10⁶ отсчетов в минуту в течение 12 часов при температуре 68^oC, промывают в 2 x SSC при температуре 68^oC и подвергают воздействию в течение 6 дней усиливающего экрана. Однонитевая маркерная мРНК из 1200 нуклеотидов (указана стрелкой) движется по соседней "дорожке" (фиг. 1).

Пример 3: кДНК из фетальной печени.

Зонд, идентичный описанному в примере 2, получают и используют для скрининга библиотеки кДНК фетальной печени, полученной в векторе -Ch21A (Toole и др., Nature, [25]) (1984), используя стандартные методики скрининга пятен (Berten, Davis, Science, [53] (1978)). Три самостоятельных положительных клона (обозначены здесь -HEPOF L6, 1350 пар оснований; -HEPOF L8, 700 п. о. и -HEPOF L13, 1400 п.о.) выделяют после скрининга 1 10⁶ пятен. Полные вставки клонов -HEPOF L13 и -HEPOF L6 секвенировали после субклонирования в M13 полностью (табл. 7 и 5, соответственно). -HEPOF L8 секвенировали частично, оставшиеся участки подразумеваются идентичными другим двум клонам (табл. 6). 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности представлены строчными буквами. Кодирующая область представлена прописными буквами.

В отношении табл. 2 и 3 следует упомянуть, что выведенная аминокислотная последовательность, показанная ниже нуклеотидной последовательности, пронумерована, начиная с цифры 1, для первой аминокислоты зрелого белка. Лидерный пептид указан прописными буквами. Остатки цистеина в зрелом белке дополнительно указаны SH, и потенциальные N-сцепленные сайты гликозилирования обозначены звездочкой. Аминокислоты, которые подчеркнуты, отмечают те остатки, которые идентифицированы непосредственно секвенированием N-конца или секвенированием триптических фрагментов ЭПО, которые описаны в примере 1. Частичное подчеркивание указывает остатки в аминокислотной последовательности, которые не удалось определить однозначно. кДНК-клоны -HEPOF L6, -HEPOF L8 и -HEPOF L13 депонированы и доступны из American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящими номерами АТСС 40156, АТСС 40152 и АТСС 40153, соответственно.

Пример 4: Структура гена ЭПО.

Относительные размеры и положения четырех самостоятельных геномных клонов (-HEPO1,2,3 и 6) из библиотеки Hae-111/AluI проиллюстрированы перекрывающимися линиями на фиг. 3. Утолщенная линия указывает положение гена ЭПО. Масштаб (в Kb) и положения известных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции приводятся. Область, содержащая ген ЭПО, полностью секвенирована для обоих тяжей с использованием направленных экзонуклеаза 111-генерированных рядов делеций через эту область. Схематическое изображение пяти экзонов, кодирующих мРНК ЭПО, показано на фиг. 4. Точная 5'-граница экзона 1 в настоящее время неизвестна. Белок-кодирующие участки экзонов закрашены. Полная нуклеотидная последовательность экзонов показана в таблице 4. Известные пределы каждого экзона очерчены сплошными вертикальными линиями. Геномные клоны -HEPO1, -HEPO2, -HEPO3 и -HEPO6 депонированы и доступны из American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, под входящими номерами АТС 40154, АТСС 40155, АТСС 40150 и АТСС 40151, соответственно.

Пример 5: Конструирование вектора p91023 (B).

Вектором для трансформации является pAdD26sVpA (3), описанный Kaufman и др. , Mol. Cell Biol., 2:1304 (1982). Конструкция этого вектора показана на фиг. 5. Эта плазмида содержит кДНК-ген дигидрофолатредуктазы мыши (DFHP), который находится под транскрипционным контролем основного позднего промотора аденовируса 2 (Ad2). 5'-сайт сращивания указан в аденовирусной ДНК, а 3'-сайт сращивания, происходящий из гена иммуноглобулина, присутствует между основным поздним промотором аденовируса 2 и DFHP-кодирующей последовательностью. Ранний сайт полиаденилирования SV40 присутствует по направлению ниже DFHP-кодирующей последовательности. Прокариотический участок pAdD26-SVpA (3) происходит из psVod/Mellon и др., Cell, 27:279 (1981) и не содержит последовательностей pBR322, известных тем, что они ингибируют репликацию в клетках млекопитающих (Lusky и др., Nature, 293:79 (1981).

Как показано на фиг. 5, pAdD26sVpA (3) переводят сначала в плазмиду pAdD26sVpA (3) (d) делецией одного из двух сайтов Pst 1. Это осуществляют путем частичного переваривания Pst 1, используя недостаточность фермента таким образом, что получают субпопуляцию линеаризованных плазмид, в которой только один сайт Pst 1 расщеплен, и последующей обработкой фрагментов Кленова, сшиванием для рециркуляции и скринингом на деленцию сайта Pst 1, расположенного в 3'-положении по отношению к последовательности полиаденилирования SV40.

В плазмиду pAdD26SVpA (3) (d) вставляют трехраздельный лидер аденовируса и гены, ассоциированные с вирусом (VA гены). pAdD26SVpA (3) (d) расщепляют Pvull для создания линейной молекулы. Затем pJAW 43/zatn и др., Cell, 16:851 (1979)) переваривают Xhol, обрабатывают фрагментом Кленова, переваривают PvuIl, и фрагмент из 140 п.о. выделяют электрофорезом в акриламидном геле [6] в трис-боратном буфере (Maniatis и др., выше). Фрагмент 140 п.о. затем сшивают с PvuII-переваренной плазмидой pAdD26SVpA(3) (d) (фиг. 6). Продукт сшивания используют для трансформации E.coli с приобретением устойчивости к тетрациклину; колонии подвергают скринингу с использованием методики Grunstein - Hoghess. Применяя меченый ³²P зонд, гибридизирующийся с фрагментом из 140 п.о., получают положительные колонии, из которых выделяют ДНК для испытания того, является ли реконструированный сайт PvuII 5' или 3'-концом вставленной ДНК из 140 п.о. Правильная ориентация сайта PvuII - на 5'-стороне вставки 140 п.о. Эта плазмида обозначена pTPL на фиг. 6.

Фрагмент ДНК вируса SV40, содержащий последовательность энхансера SV40, получают путем переваривания ДНК SV40 Ava 11, затупления концов фрагментом Кленова, сшивания Xho 1-линкеров с фрагментами от переваривания Xho 1 и выделения наибольшего фрагмента (D) посредством электрофореза в геле. Этот фрагмент затем сшивают с pTPL, расщепленной Xho 1, получая плазмиду pCYSVL 2-TPL. Ориентация фрагмента D SV40 в pCYSVL 2-TPL такова, что поздний промотор вируса SV40 находится в такой же ориентации, что и основной поздний промотор аденовируса.

Для введения генов, связанных с аденовирусом (генов VA), в pCYSVL 2-TPL, вначале конструируют плазмиду pBR322, которая содержит фрагмент в Hind 111 аденовируса типа 2. ДНК аденовируса типа 2 переваривают Hind 111 и фрагмент B выделяют электрофорезом в геле. Этот фрагмент вставляют в плазмиду pBR322, которая предварительно была переварена Hind 111. После трансформации E.coli устойчивые к ампициллину рекомбинанты подвергают скринингу на наличие вставки фрагмента в Hind 111; ориентацию вставки определяют путем переваривания рестрикционным ферментом. pBR322 - Ad Hind 111 B содержит фрагмент B Hind 111 аденовируса типа 2 в ориентации, изображенной на фиг. 7.

Как показано на фиг. 8, гены VA получают из плазмиды pBR322 - Ad Hind 111 B путем переваривания Hpa 1, добавления линкеров EcoRI и переваривания EcoRI с последующим восстановлением фрагмента размером 1,4 кб. Фрагмент, имеющий липкие концы EcoRI, затем вшивают в EcoRI-сайт pPTL, ранее переваренной EcoRI. После трансформирования HB101 E.coli и отбора трансформантов по устойчивости к тетрациклину колонии подвергают скринингу посредством фильтр-гибридизации с ДНК, специфичной для генов VA. Из положительно гибридизирующихся клонов получают ДНК и охарактеризовывают перевариванием рестрикционными эндонуклеазами. Полученная плазмида обозначена p91023.

Как показано на фиг. 9, два сайта EcoR1 в плазмиде p91023 отщепляют путем полного расщепления p91023 при помощи EcoRI и восстановления двух ДНК-фрагментов (около 7 кб и около 1,3 кб). Последний фрагмент содержит гены VA. Концы обоих фрагментов заполняют с использованием фрагмента Кленова, и два фрагмента затем сшивают один к другому. Плазмиду p91023(A), содержащую гены VA и являющуюся аналогичной плазмиде p91023, однако потерявшую интерстициальный фрагмент для двух сайтов EcoRI, идентифицируют посредством скрининга Gruns tein - Hogness фрагментов гена VA, а также традиционного рестрикционного анализа.

Один Pst 1-сайт в плазмиде p91023 (A) отщепляют и заменяют на EcoRI-сайт. p91023(A) полностью расщепляют при помощи Pst 1 и обрабатывают фрагментом Кленова. EcoRI-линкеры сшивают с тупоконечным сайтом Psr1 плазмиды p91023(A). Линейную плазмиду p91023(A) с EcoRI-линкерами, присоединенными в тупоконечном сайте Pst1, отделяют от несшитых линкеров и полностью переваривают EcoRI, после чего повторно сшивают. Плазмиду p91023(B), как изображено на фиг. 9, восстанавливают и идентифицируют как