Способ получения масла, содержащего арахидоновую кислоту, немодифицированное микробное масло, способ обеспечения арахидоновой кислотой смеси для детского питания, косметическая композиция, питание или питательная добавка, способ лечения людей и смесь для детского питания

Способ получения масла, содержащего арахидоновую кислоту, немодифицированное микробное масло, способ обеспечения арахидоновой кислотой смеси для детского питания, косметическая композиция, питание или питательная добавка, способ лечения людей и смесь для детского питания

Реферат

 

Немодифицированное микробное масло, содержащее по крайней мере 10 мас.% арахидоновой кислоты, а также эйкозапентаеновую кислоту в количестве не более 20 мас. % от содержания арахидоновой кислоты получают методом микробиологического синтеза с использованием штамма культуры Pythium insidiossum. Масло вводят в детское питание в количестве, обеспечивающем содержание арахидоновой кислоты в количестве, эквивалентном женскому грудному молоку. Масло вводят также в косметическую композицию. При лечении людей, страдающих от недостатка арахидоновой кислоты, масло вводят в фармакологически приемлемом количестве. Использование изобретения позволяет ликвидировать дефицит арахидоновой кислоты в организме. 7 с. и 20 з.п.ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к способу получения арахидоновой кислоты, к композициям, содержащим арахидоновую кислоту, и их применению.

Арахидоновая кислота (АРК) представляет собой полиненасыщенную жирную кислоту (ПНЖК) с длинной цепью класса омега-6 (5, 8, 11, 14-эйкозатетраеноевая кислота, т.е. 20:4). АРК является наиболее распространенной C₂₀ ПНЖК в организме человека. Она особенно преобладает во внутренних органах, мышцах, в тканях крови, выполняя большую роль как структурный липид, в основном связанный с фосфолипидами в крови, печени, мышцах и других больших органных системах. В добавление к ее первичной роли как структурного липида, АРК также является основным предшественником для большого количества циркулирующих эйкозеноидов, таких как простагландин E₂ (ПГЕ₂), простагландин I₂ (ПГ I₂), тромбоксан A₂ (ТкА₂), лейкотриены B₄ (ЛТВ₄) и C₄ (ЛТС₄). Эти эйкозеноиды оказывают регуляторное влияние на обмен липопротеинов, реологию крови, сосудистый тонус, функцию лейкоцитов и активацию тромбоцитов.

Несмотря на ее важную роль в обменных процессах человека, АРК не может синтезироваться у человека де ново. АРК синтезируется удлинением и нарушением насыщения линолевой кислоты (ЛК), незаменимой жирной кислоты. В этом процессе необходимо присутствие фермента 6- -дезатуразы, этот фермент присутствует в теле человека в небольшом количестве.

Burre et al., Lipids, 25:354-356 (1990). В соответствии с этим с пищей должно поступать большее количество АРК и, что особенно важно, во время очень быстрого роста, например, в младенческом возрасте.

Во время первого года жизни ребенок может удваивать или утраивать свой вес. Следовательно, ему необходимо иметь повышенное содержание АРК в питании. Для того, чтобы удовлетворить эти потребности, грудное женское молоко содержит высокие значения АРК. Sanders et al., Am. J. Clio. Nutr., 31:805-813 (1978). АРК наиболее преобладает из C₂₀ ПНЖК в грудном женском молоке. Младенцы, вскормленные грудным молоком матери, особенно вегетарианки, во многом имеют преимущество из-за наличия дополнительного содержания пищевой АРК. Однако многие матери не вскармливают своих детей грудным молоком или не вскармливают младенцев грудью полный период времени быстрого роста ребенка, выбирая взамен употребление детских питательных смесей.

Заявителям известны детские смеси, содержащие АРК, не выпускаемые промышленностью. В патенте США N 4,670,285 (Clandinin et al.,) указаны потребности детей в жирных кислотах, включая АРК. Для того, чтобы обеспечить этими жирными кислотами, Clandinin et al., предлагают растертый яичный желток, рыбий жир или фосфолипиды эритроцитов крови, растительное масло как жировые компоненты предлагаемой смеси для детского питания. Однако рыбий жир содержит большие количества эйкозапентанеоевой кислоты (ЭПК). Известно, что ЭПК подавляет синтез АРК у младенцев. Carlson et al., INFORM 1:306 (1990). Таким образом, желательно обеспечить запасы АРК без содержания в них ЭПК. Более того, яичный желток содержит относительно низкую концентрацию АРК, так что смеси Кландинина в соавт. являются экономически нежизнеспособными.

Так как АРК содержится в животных, но не в растительных маслах, его продукция в коммерческих количествах остается желательной, но труднодостижимой целью.

Shinmen, et al., Microbiol. Biotech 31:11-16 (1989) доложили способ получения АРК с помощью изолированных грибов Mortiella alpina, используя общепринятый способ ферментации в перемешивающем баке (см. также патент Японии N 1,215,245, Shinmen et al.,). После культивирования организмы собирают, высушивают, их липиды экстрагируют из биомассы грибов органическими растворителями, и липиды химически (ковалентно) модифицируют в этиловые эфиры и затем связывают с циклодекстрином перед использованием в качестве пищевой добавки. Shinmen et al., не обнаружили и не предлагали введения немодифицированных микробных масел.

Parphyridium cinentum, красные микроскопические морские водоросли, - могут выращиваться в водоемах в больших количествах, в содержащихся в них липидах количество АРК достигает 40%. Aber, et al., Biotech. Bioeng. 25: 1057-1070 (1983). Неудачно то, что АРК первично связана с галактолипидами, комплексом полярных липидов, не содержащихся в грудном молоке. Таким образом, не только общее количество пригодной к употреблению АРК продуцируется в количестве 1% от биомассы, но и образующаяся АРК без ее модификации не пригодна для использования в виде добавки к детским смесям.

В патенте США (Suzuki et al., patent N 4,870,011) раскрыт способ получения липидов, таких как гамма-линоленовая кислота, из грибов рода Mortierella. Гамма-линоленовая кислота очищается из смеси липидов, содержащихся в грибах.

В патенте DE 3603000 A1 (Milupa) было обнаружено высокое содержание смеси полиненасыщенных жирных кислот, и их использовали как жировой компонент в детских смесях. Смесь жиров имела высокое содержание АРК и докозагексаноевой кислоты (ДГК) в соотношении 2,5:1, соответственно, так же как и высокое содержание холестерина. Источники жирных кислот перечислены и представлены определенным типом макроскопических водорослей, масел рыб, органных жиров из говядины и свинины или высоко рафинированным маслом яичных желтков. Источником докозагексаноевой кислоты (ДГК) и АРК, как сказано, являются макроводоросли фекофитного и родофитного типов. Здесь не предполагали использования микробов как источника масла. Масло водорослей и рыб также обычно включают ЭПК, которая подавляет синтез АРК in vivo. В добавление к этому высоко рафинированное масло из желтка яиц не является экономически выгодным источником АРК. Более того, не обнаружили, что последнее может быть использовано как АРК-обогащенная добавка для существующего состава детских смесей.

В соответствии с этим, сейчас остается необходимость в экономичном, коммерчески возможном способе получения АРК, предпочтительно без примесей ЭПК. Это является целью настоящего изобретения, удовлетворяющего таким требованиям.

Другая цель изобретения - разработать добавку и источник для этой добавки для использования в детской смеси таким образом, что содержание АРК в смеси приблизительно будет того же уровня, что и в грудном женском молоке.

И другая дополнительная цель этого изобретения - обеспечить получение масла из грибов, содержащего АРК, для получения продуктов для приема внутрь, парентерально или накожно.

Это изобретение относится к получению и использованию масла грибов (ARASCO), содержащего арахидоновую кислоту и композициям, содержащим также масла. Масло может быть названо как единичное клеточное масло. Грибы, культивируемые в условиях, когда они продуцируют масло, собирают, масло экстрагируют и восстанавливают. Масло без дальнейших химических модификаций может быть непосредственно использовано для обеспечения добавок АРК лицам, нуждающимся в ней, включая новорожденных младенцев, беременным или кормящим женщинам или людям с патологией, связанной с недостаточностью АРК. Преимуществами изобретения являются легкое получение, высокая степень чистоты и отсутствие определяемых количеств эйкозапентанеоевой кислоты (ЭПК).

Настоящее изобретение достигает цель обеспечения экономичного источника арахидоновой кислоты (АРК). В одном воплощении это изобретение относится к способу получения грибковых масел, содержащих арахидоновую кислоту (ARASCO), "реально свободную" от эйкозапентанеоевой кислоты (ЭПК). Используемый здесь термин "реально свободный" подразумевает, что присутствием ЭПК в масле составляет менее 1/15 от количества АРК. Это масло - единичное клеточное масло, может быть непосредственно использовано в неизменном виде. Используемый здесь термин "немодифицированный" имеет в виду, что химические свойства жирных кислот или масел сами по себе не были ковалентно изменены. Таким образом, например, временная модификация ARAS CO или APK, которая может быть обратима вслед за приемом масел, не будет за пределами сферы этого изобретения.

Жирные кислоты, полученные из этих видов грибов, предварительно охарактеризованы и обнаружено, что большинство из этих грибов не вырабатывают APK. Weete, J. D. , Fungal Lipid Riochemistry, Plenum Press N.Y. (1974). Из тех видов грибов, которые продуцируют APK, многие, включая все предварительно охарактеризованные виды Pythium, вырабатывают значительные количества эйкозапентанеоевой кислоты ЭПК), в добавление к APK. В табл. I оговорены жирные кислоты профиля P. insidiosum, так же как и жирные кислоты других видов грибов. Неожиданно было обнаружено, что P. insidiosum вырабатывает APK без примеси ЭПК. Как и в случае с жирами рыб, высокое содержание ЭПК в диетических добавках приводит к подавлению способности образовывать APK из пищевой линолевой кислоты (ЛОК). Согласно этому, те из видов грибов, которые продуцируют как APK, так и ЭПК, можно использовать в процессе этого изобретения, но предпочтительно использовать виды, которые не продуцируют значительных количеств ЭПК. Такие предпочтительные виды включают Pyrhium insidiosum и Martierella alpina. Оба вида имеются в распоряжении и хранятся в американской Коллекции типов культур в Роквилле, Мэриленд, под NN 28251 и 42430, соответственно. Во всех отношениях P. insidiosum будет представителем грибов, заявленных в данном изобретении.

Одной из значимых проблем, которую разрешает данное изобретение, является ослабление подавления биосинтеза APK у младенцев, вызванного наличием в их диете повышенного количества ЭПК. Эта проблема может быть решена с помощью создания запасов APK для использования в рецептуре детской питательной смеси до количеств, соответствующих тем, которые обнаружены в грудном женском молоке. Обычно в грудном женском молоке соотношение APK:ЭПК около 20:1, соответственно. Настоящее изобретение специально рассматривает возможность использования некоторых микробных масел, содержащих большое количество APK, для того чтобы ослабить отрицательное влияние пищевого ЭПК. Предпочтительно использовать содержащие APK масла, в которых соотношение APK:ЭПК, по крайней мере, 5: 1. Более предпочтительным будет соотношение 10:1, и наиболее предпочтительно 20:1. Как можно видеть, более высокое содержание APK в конечном продукте по отношению к количеству ЭПК более желательно по конечному результату.

В процессе осуществления данного изобретения грибы культивировали при подходящих условиях для продуцирования масла, содержащего APK. В основном технология культивирования грибов хорошо известна специалистам, и эта технология может применяться в процессе настоящего изобретения. Например, культивирование посеянных количеств (инокулум) грибов может производиться в погруженных в воду культурах во встряхиваемых флаконах, флаконы содержат среду, обеспечивающую рост засеянного мицелия грибов, который при постоянном встряхивании растет в течение 3 - 4 дней.

Состав ростовой среды может меняться, однако он всегда содержит источники углерода и азота. Предпочтительным источником углерода является глюкоза, количества которой могут колебаться от 10 до 100 г на 1 литр ростовой среды. Обычно ее количество 15 г/л используется при культивировании во флаконах при их встряхивании. Эта величина может изменяться в зависимости от желаемой плотности конечной культуры. Другие источники углерода, которые могут использоваться, -меласса, высшая фруктоза сиропа из початков кукурузы, гидролизный крахмал или другой любой недорогой традиционный источник углерода, используемый в ферментативных процессах. В дополнение к этому, лактоза может служить источником углерода для P. insidiosum. Таким образом, распространенные очень дешевые источники углерода с высоким содержанием лактозы могут использоваться как субстрат. Подходящее количество этих источников углерода может быть определено квалифицированным исполнителем. Обычно дополнительное количество углерода необходимо добавить во время культивирования. Так как организмы потребляют много углерода, добавление его источников в комплект флакона делает способ трудоемким.

Азотом обычно обеспечивают в форме дрожжевого экстракта при концентрации от 2 до 15 г экстракта на 1 л среды для роста грибов. Предпочтительно обеспечить около 4 г/л. Может использоваться другой источник азота, включая пептон, триптон, настой из кукурузных початков и т.д. Количество, которое необходимо добавить из этих источников, может быть легко определено квалифицированным персоналом. Азот может быть добавлен в этом способе один раз перед культивированием.

После культивирования в течение 3 - 4 дней при подходящей температуре, обычно около 25 - 30^oC, количества растущих грибов достаточно для использования в качестве посевного материала на обычно используемый перемешивающий бак ферментора (ПБФ). Такие ферменторы известны специалистам и коммерчески доступны. Ферментация может быть выполнена в ванне периодического действия, в сырьевой ванне периодического действия или способом непрерывной ферментации. Предпочтительно использовать ПБФ, оснащенный лопастной турбиной типа Rushton.

Ферментор приготавливают добавлением необходимого количества источников углерода и азота. Например, 1,5 л раствора ферментора может быть приготовлено смешиванием около 50 г глюкозы и около 15 г дрожжевого экстракта на 1 л водопроводной воды. Как предварительно обсуждалось, могут использоваться другие источники азота и углерода или их смеси.

Реактор, содержащий раствор азота, должен быть простерилизован, например, прогреванием, перед засеванием. После охлаждения до 30^oC инокулум (засеваемый материал) может быть добавлен и начато культивирование. Газообмен обеспечивается рассеивателем воздуха. Величина воздушного потока может варьировать, но предпочтительно, чтобы она достигала от 0,5 до 4,0 ООМ (объем воздуха на объем ферментора в минуту). Предпочтительно, чтобы содержание растворенного кислорода сохранялось от 10 до 50% в воздухе, насыщающем объем взятого раствора. Соответственно с этим, регулировка величины потока воздуха необходима в течение всего процесса культивирования. Перемешивание обязательно. Перемешивание желательно осуществлять лопастями. Скорость движения оконечности перемешивающей вертушки должна быть в пределах от 50 до 500 см/секунду, предпочтительно 100-200 см/секунду.

В основном количество инокулума может варьировать. Обычно оно составляет от 2 до 10% объема. Предпочтительно можно использовать засевание инокулумом ферментора до 5% объема.

Содержание питательных веществ должно регистрироваться. При понижении содержания глюкозы ниже 5 г/л должно быть добавлено дополнительное количество глюкозы. В типичном цикле культивирования утилизируется около 100 г глюкозы и около 15 г экстракта дрожжей на 1 литр. Желательно, чтобы содержание азота истощалось во время культивирования, так как это усиливает продукцию масла грибами. Это особенно верно, когда используется в качестве продуцирующего организма M. alpina Иногда в культуре образуется излишнее количество пены. Для предотвращения ее образования необязательно можно добавлять противопенные вещества, известные специалистам, например, Мазу 310.

Температура культивирования может меняться, однако те грибы, которые вырабатывают как APK, так и ЭПК, имеют тенденцию к продукции меньшего количества ЭПК и большего количества APK, когда культивируются при более высоких температурах. Например, когда Mortierella alpina культивируется при температуре ниже 18^oC, она начинает вырабатывать ЭПК. Таким образом, предпочтительно увеличивать температуру до значений, вызывающих предпочтительно продукцию APK. Подходящая температура обычно от 25 до 30^oC.

Предпочтительно проводить культивирование до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность биомассы. Желательно, чтобы плотность биомассы составляла 25 г организмов на 1 литр. Такое количество биомассы обычно достигается через 48-72 часа после начала культивирования. К этому времени организмы обычно содержат около 5 - 40% комплекса липидов, т.е. жиров, в которых 10-40% составляет APK, и они могут быть собраны.

Сбор организмов может осуществляться любым методом, например, таким как фильтрация, центрифугирование, высушивание разбрызгиванием. Из-за своей низкой стоимости фильтрация предпочтительнее.

После сбора мицелия на фильтре осадок может быть проэкстрагирован. Рекомендуется собирать осадок мицелия, который представляет собой биомассу, полученную после сбора. Осадок может быть рыхлым, спрессованным, крошащимся или некрошащимся. Необязательно из осадка перед экстракцией можно удалить остаточную воду, например, высушиванием под вакуумом, или лиофилизацией. Если выбирается такой подход, то предпочтительно использовать для экстрагирования содержащих АРК масел неполярный растворитель. В то время как пригоден любой неполярный растворитель (экстрагент), предпочтительным является гексан.

Альтернативно, влажный осадок (который обычно около 30 - 50% твердости) может быть раздроблен и экстрагирован непосредственно, с использованием полярного растворителя, такого как этиловый спирт, изопропиловый спирт или сверхдефицитные жидкие экстракты с растворителями, такими как CO₂ и NO. Предпочтительно, чтобы осадок был раздроблен перед экстракцией. Благоприятно, что настоящее изобретение допускает экономичное использование технологии со сверхдефицитной жидкостной экстракцией.

Mc Hugh, et al., Sujercritical Fluid Extraction, Butterworth (1986). Такая технология известна специалистам и в настоящее время используется, например, для удаления кофеина из кофейных бобов. Хотя количества продукта в результате экстракции влажного и высушенного материала подобны, экстракция влажного материала, в основном, является более экономным процессом.

Предпочтительный способ водной экстракции включает в себя смешиванием биомассы мицелия с полярным растворителем изопропиловым спиртом в различных реакционных котлах. Такие котлы известны. Желательно использование от 3 до 6 частей растворителя на 1 часть биомассы. Наиболее предпочтительно производить смешивание а атмосфере азота или в присутствии антиоксидантов для того, чтобы предотвратить окисление АРК в липидном экстракте. Используемые здесь термины "липидный экстракт", "масло", "липидный комплекс" и "масло грибов" используются как равноценные.

После экстрагирования смесь может быть отфильтрована для отделения биомассы от растворителя, содержащего липидный экстракт. После этого биомасса может быть восстановлена и использована как кормовая добавка. Используемый здесь термин "кормовая добавка" означает корм или дополнительно может смешиваться с обычным кормом, таким как зерно, и т.д., которыми можно обеспечить животных.

Растворитель, отделенный от липидного экстракта, также может быть восстановлен для повторного использования с помощью выпаривания с любым коллектором. Остатки названы здесь "грубым (неочищенным) маслом". Использование изопропилового спирта как растворителя желательно, так как приводит к удалению любого остатка воды из грубого масла, так как выпариванием удаляют азеотропную смесь вода/изопропиловый спирт, которая образуется спонтанно.

В то же время грубое масло может быть использовано без дальнейшей обработки и может быть в дальнейшем очищено. Такие процессы, которые используются для получения лецитина из растительных продуктов, известны и могут быть использованы на этих дополнительных этапах очистки. Такие процессы не изменяют химически или ковалентно липиды, содержащие АРК и АРК саму по себе.

Количество продукта варьирует, но обычно получают около 5 г АРК-содержащих фосфолипидов на 100 г сухого мицелия. В случае использования M. alpina может быть получено дополнительно 10 - 30 г триглицерида на 100 г сухой массы мицелия. Либо грубое масло, либо очищенный продукт могут использоваться для введения людям. Оба будут включены в определение ARASCO, используемое здесь.

Одной из главных целей изобретения является обеспечение добавки для использования в составе питания младенцев, чтобы концентрация АРК в таких составах была равна концентрации АРК в грудном женском молоке. В таблице 2 сравниваются составы жирных кислот в ARASO с таковыми в грудном женском молоке, которые отсутствуют в детских смесях и содержатся в ARASCO.

I-Simopanlis A, Omega-3 Fatty Acids in Haelth and Dislase, pp. 115-156 (1990).

Как можно видеть, количество АРК, находящейся в детской смеси с добавлением ARASCO, приблизительно близко к содержанию АРК в грудном женском молоке. Дополнительно к этому композиция общих жирных кислот в детской смеси незначительно отличалась при добавлении ARASCO. Обычно может быть использовано от 50 до 1000 мг ARASCO на 1 литр детской смеси. Необходимое количество ARASCO зависит от содержания в нем АРК. Оно может варьировать от 10 до 50% от содержания жирных кислот в масле. Однако обычно содержание АРК около 30%. Когда содержание АРК составляет около 30%, особенно предпочтительной является величина добавки от 600 до 700 мг ARASCO на 1 литр детской смеси. Так, величина разбавления содержащихся жирных компонентов детской смеси, такой как Симилак (Ross Laboratories, Columbus, Ohio), составляет одна часть ARASCO на 5 частей жиров смеси. Предпочтительно, чтобы ARASCO реально была свободна от ЭПК.

Когда Pythium insidiosum используется в описанных процессах, экстрагированное АРК-содержащее масло в основном представлено фосфолипидом. Когда используют в этих процессах Mortierella alpina, то АРК-содержащее масло преобладающе представляет собой триглицерид. Обе формы ARASCO полезны как добавки для детской смеси. Первая из упомянутых форм не только обеспечивает состав АРК, но также и эмульгатором, т.е. фосфатидилхолином, который вместе вносится в коммерческие смеси. Масло из M. alpina, вероятно, более экономично при производстве.

Масло, содержащее АРК, настоящего изобретения имеет множество применений в добавление к его использованию в качестве добавки к детским питательным смесям. Как известно, существует много заболеваний, связанных с дефицитом АРК, например, такие как маразм (Vajreswari, et al., Metabolism 39:779-782 (1990), заболевания с нарушением топики (Melnik, B., Monatesschr. Kinderheilta, 138: 162-166 (1990). В одном воплощении данного изобретения эти патологии лечили введением фармацевтически эффективных количеств масла настоящего изобретения. Масло может быть введено внутрь, местно или парентерально, как будет выбрано лечащим врачом.

Введение в капсулах, как известно, является эффективным способом введения внутрь. Капсулы, содержащие масло грибов, могут вводиться тем лицам, которые желают или которым требуется получение диеты с добавлением АРК. Такой способ особенно эффективен для введения АРК беременным или кормящим женщинам.

В примерах, где ARASCO вводится для лечения патологии, связанной с дефицитом АРК, необходимо вводить фармацевтически эффективные количества АРК. Такое количество моет быть определено без дополнительного экспериментирования.

Другое воплощение данного изобретения вовлекает в себя косметические композиции, содержащие ARASCO. Косметические композиции касаются тех соединений, которые применяются в косметике. Предпочтительным примером такой композиции является крем от морщин. Такая косметическая композиция обеспечивает эффективные способы местного нанесения АРК на кожу, чтобы помочь сохранению тонуса кожи.

Следующие специальные, не ограничивающие изобретение примеры, помещены ниже для дальнейшей иллюстрации изобретения.

Пример 1. Приготовление липида из P. insidisum и добавление его к детской питательной смеси.

В 80-литровый (общий объем) ферментор добавляют 51 литр водопроводной воды, 1,2 кг глюкозы, 240 г дрожжевого экстракта и 15 мл MAZU 210S (пеногаситель). Ферментор стерилизуют при 121^oC в течение 45 минут. Дополнительное количество в объеме 5 л дистиллированной воды добавляют во время процесса стерилизации. pH доводят до 6,2 и добавляют примерно 1 литр инокулума (посевного материала) при плотности клеток 5 - 10 г/литр Pythium insidiosum (АТСС 28251). Величину перемешивания доводят до 125 об/мин (250 см/сек, скорость вращения оконечности лопасти вертушки) и величину аэрации устанавливают 1 стандартный кубический фут в минуту (СКМФ). Через 24 часа величину аэрации увеличивают до 3 СКМФ. К 28 часу добавляют дополнительно 2 л 50%-ного сиропа глюкозы (1 кг глюкозы). К 50 часу сбирают "урожай" в ферменторе, количество собранного продукта составляет около 2,2 кг влажного веса (примере 15 г сухого веса на 1 литр. Собранную биомассу сдавливают для получения твердого осадка (50%-ная твердость) на фильтре с подсосом перед высушиванием замороженного материала. Высушенную биомассу растирают в ступке и экстрагируют 1 л гексана на 200 г сухой биомассы при комнатной температуре при перемешивании в течение 2 часов. Затем смесь фильтруют и фильтрат выпаривают до получения 5 - 6 г грубого масла на 100 г сухой биомассы. Биомассу повторно экстрагируют 1 л этанола на 20 г сухой биомассы в течение 1 часа при комнатной температуре, фильтруют и растворитель выпаривают, получая дополнительно еще 22 г грубого масла на 100 г сухой биомассы. Вторая фракция состоит в основном из фосфолипидов, тогда как первая содержит смесь фосфолипидов и триглицеридов. Объединенные фракции дают масло, содержащее около 30 - 35% арахидоновой кислоты и не содержащее определяемых количеств ЭПК. Это масло добавляют капельно к коммерческой детской питательной смеси Симилак (Ross Laboratories, Columbus, Ohio) до достижения величины добавки 600 мг на 1 литр приготовленного раствора.

Пример 2. Приготовление липида из M. alpina и добавление к детской питательной смеси.

Mortierella alpina (АТСС # 42430) выращивается в 2-литрвом качающемся сосуде, содержащем 1 л водопроводной воды и 20 г среды декстрозы картофеля. Флакон постоянно встряхивают на круговом встряхивателе и оставляют при 25^oC в течение 7 дней. После отбора продукта центрифугированием биомассу высушивают при замораживании до получения около 8 г обогащенного липидом мицелия. Мицелий экстрагируют, используя гексан, как описано в примере 1, и получают около 2,4 г грубого масла. Это масло содержит около 23% арахидоновой кислоты и добавляют к коммерческому составу Симилак капельно до концентрации 1000 мг на 1 литр.

Формула изобретения

1. Способ получения масла, содержащего арахидоновую кислоту (АРК) и включающего АРК-содержащие триглицериды и дополнительно эйкозапентаеновую кислоту (ЭПК) в количестве не более 1/5 от содержания АРК, путем культивирования микробных штаммов в ферментере на питательной среде до получения желаемого количества биомассы, сбора биомассы и извлечения масла из биомассы, отличающийся тем, что микробным штаммом является Pythium insidiosum, культивируемый в присутствии источника углерода и источника азота.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование проводят в среде, содержащей растворенный кислород, который поддерживают в количестве не менее 10% от величины насыщения воздухом среды во время культивирования, источник углерода в концентрации от 10 до 100 г/л среды и источник азота в концентрации от 2 до 15 г/л среды.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что масло практически не содержит ЭПК.

4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что масло содержит, по крайней мере, 10 мас.% АРК.

5. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что масло содержит по крайней мере 30 мас.% АРК.

6. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что масло содержит, по крайней мере, 5 вес. ч. АРК на 1 вес. ч. ЭПК.

7. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что масло содержит по крайней мере 10 вес. ч. АРК на 1 вес. ч. ЭПК.

8. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что АРК находится в виде триглицерида.

9. Немодифицированное микробное масло, отличающееся тем, что содержит по крайней мере 10 мас.% АРК и ЭПК в количестве не более чем 20 мас.% от содержания АРК.

10. Масло по п. 9, отличающееся тем, что содержит не более, чем одну десятую часть ЭПК от содержания АРК, где АРК присутствует в виде триглицеридов.

11. Масло по п. 9, отличающееся тем, что оно практически не содержит ЭПК.

12. Масло по любому из пп. 9 - 11, отличающееся тем, что оно содержит по крайней мере 30 мас.% АРК.

13. Способ обеспечения арахидоновой кислотой смеси для детского питания, отличающийся тем, что к ней добавляют немодифицированное масло, содержащее по крайней мере 10 мас.% АРК и ЭПК в количестве не более чем 20 мас.% от содержания АРК, при этом количество масла достаточно для того, чтобы обеспечить такое присутствие АРК, которое соответствует количеству АРК в женском грудном молоке.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанное масло получают с помощью микроорганизмов рода Pythium или Mortierella.

15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма используют микроорганизм вида Pythium insidiosum или Mortierella alpina.

16. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанное масло практически не содержит ЭПК.

17. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанное масло содержит по крайней мере 30 мас.% АРК.

18. Косметическая композиция, отличающаяся тем, что включает масло, содержащее по крайней мере 10% арахидоновой кислоты и ЭПК в количестве не более 20 мас.% от содержания АРК.

19. Композиция по п. 18, отличающаяся тем, что указанное масло получают с помощью микроорганизмов рода Pythium или Mortierella.

20. Композиция по п. 19, отличающаяся тем, что в качестве микроорганизма используют микроорганизм вида Pythium insidiosum или Mortierella alpina.

21. Композиция по п. 18, отличающаяся тем, что она включает крем от морщин.

22. Питание или питательная добавка, содержащая биомассу Pythium по п. 1.

23. Способ лечения людей, страдающих от патологии, вызванной дефицитом арахидоновой кислоты, который включает введение фармацевтически эффективного количества немодифицированного микробного масла по любому из пп. 9 - 12.

24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что масло вводят энтерально, местно или парантерально.

25. Способ по п. 23, отличающийся тем, что масло вводят в капсулированной форме.

26. Способ по п. 23, отличающийся тем, что масло назначают беременным или кормящим женщинам.

27. Смесь для детского питания, содержащая АРК в количестве, соответствующем его содержанию в грудном молоке, отличающаяся тем, что она содержит масло по любому из пп. 9 - 12.

РИСУНКИ

Рисунок 1