Способ определения гомоцистеина в пробе и набор для его осуществления

Способ определения гомоцистеина в пробе и набор для его осуществления

Реферат

 

Способ предназначен для определения гомоцистеина в пробе и может быть использован для диагностики и лечения в медицине и биотехнологии. Пробу контактируют с ферментом S-аденозилгомоцистеингидролазой ( SAH-аза) в присутствии субстрата, отличного от гомоцистеина. После завершения ферментативной реакции аналит оценивают без хроматографического разделения продуктов реакции. В качестве аналита используют немеченный аналит, выбранный из аденозина, аналога аденозина и S-аденозилгомоцистеина. Способ не требует использования дорогостоящего и трудоемкого хроматографического разделения и позволяет проводить определение в клинической лаборатории. 2 с. и 38 з.п. ф-лы.

Изобретение касается способа определения гомоцистеина в пробе и набора для его осуществления.

Гомоцистеин представляет собой промежуточную аминокислоту, образующуюся при метаболизме метионина до цистеина. Обычно гомоцистеин, продуцируемый в теле, быстро метаболизируется по одному из двух путей: [1] конденсации с серином с образованием цистатиона или [2] превращения в метионин, и его концентрация/ и концентрация его окисленной формы, гомоцистеина в живом теле при нормальных условиях практически незначительна.

Однако уровни гомоцистеина в биологических пробах могут иметь клиническое значение в ряде ситуаций, т.к. гомоцистеин играет важную роль в сложном ряду биохимических путей, которые пополняют метаболизм содержащих сульфгидрильные группы аминокислот, и его накопление может свидетельствовать о различных нарушениях, происходящих в этих метаболических путях, в том числе, в частности, о врожденных отклонениях метаболизма. Так, например, известно, что гомоцистинурия (аномальное образование гомоцистеина в моче) является нарушением аминокислотного метаболизма, вызываемым недостаточностью ферментов цистатион--синтетазы или метилтрансферазы метилтетрагидрофолиевой кислоты, которая катализирует метилирование гомоцистеина до метионина/.

Метаболизм содержащих сульфгидрильные группы аминокислот тесно связан с метаболизмом фолиевой кислоты и витамина B₁₂ /кобаламина/, которые функционируют в качестве субстратов или кофакторов в различных превращениях. По этой причине было предложено также считать накопление гомоцистеина индикатором нарушения функции кобаламина или фолат-зависимых ферментов или других нарушений или заболеваний, связанных с метаболизмом кобаломина или фолата.

Кроме того, поскольку превращение гомоцистеина в метионин основано на реакции, требующей участия S-метилтетрагидрофолата в качестве донора метила, на метаболизм гомоцистеина могут также влиять антифолатные лекарственные средства, такие как метотрексат, введенные для борьбы с другими нарушениями, в том числе с раком. Поэтому предлагалось наблюдать за уровнем гомоцистеина при проведении лечения злокачественного заболевания антифолатными лекарственными средствами.

Позднее было показано, что повышенные уровни гомоцистеина в крови коррелируют с развитием атеросклероза (см. Clarke, et al., New Eng. J. Med. 324: 1149-1155 /1991/, и даже умеренная гомоцистеинемия рассматривается в настоящее время как фактор риска для сердечных и сосудистых заболеваний. Таким образом, измерение уровней гомоцистеина в плазме или в крови имеет также значение в диагностике и лечении сосудистых заболеваний.

Хотя иммунологические способы прямого определения гомоцистеина недоступны в связи с отсутствием доступных антител к гомоцистеину, был предложен ряд других способов определения гомоцистеина в клинических пробах. Все они предусматривают хроматографические разделения и обычно основаны на одном из следующих принципов: (1) классический хроматографический анализ аминокислот, (2) реакция гомоцистеина в пробе с ферментом S-аденозил-L-гомоцистеингидролазой в присутствии радиоактивно или иным способом меченого S-аденозина в качестве субстрата с последующим разделением и количественным определением образовавшегося продукта /S-аденозил-L-гомоцистеина, SAN/. Как правило, применяют хроматографическое разделение /ЖХВР или тонкослойную хроматографию/ и измерения радиоактивности /см. Refsum et al., Clin. Chem. 31:624-628 /1985/; Kredich et ai., Anal. Biochem. 116:503-510 /1981/; Chui. Am. J. Clin. Path. 90 /4/: 446-449 /1988/; Totani et al., Biochem. Soc. 14/6/:1172-9 /1988/; и Schimizu et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 8:153-159 /1986// (3) реакция гомоцистеина в пробе с флуорофором с последующим разделением при помощи ЖХВР и флуорометрии /см. Refsum. et al., Clin. Chem, 35 (9): 1921-1927 (1989)).

Эти способы трудоемки, занимают много времени и основаны на непосредственном количественном определении. Более конкретно, хроматографическое разделение является общей чертой способов, применяемых ранее, и требует высокоспециализированного и сложного в обращении оборудования.

Применение такого оборудования обычно не приветствуется, в рутинной практике клинической лаборатории и поэтому подобные способы, как правило, не поддаются автоматизации в типичных клинических лабораторных процедурах.

Поэтому существует необходимость разработки улучшенного теста на гомоцистеин, который был бы простым, специфичным, быстрым в проведении, легко приспосабливаемым для применения в клинических лабораториях и, что важнее всего, не требовал бы дорогостоящего и длительного хроматографического разделения. Данное изобретение представляет собой попытку обеспечения такого теста. Таким образом, одним аспектом данного изобретения является обеспечение способа определения гомоцистеина в пробе, предусматривающего стадии контактирования пробы с превращающим гомоцистеин ферментом, например, S-аденозилгомоцистеин /SAH/-гидролазой, и по меньшей мере, одним субстратом для этого фермента, иным, чем гомоцистеин, и оценку /предпочтительно фотометрическую/ без хроматографического разделения реагентов или продуктов реакции немеченного аналита, выбранного из ко-субстрата гомоцистеина и продуктов ферментативного превращения гомоцистеина вышеупомянутым ферментом.

После контактирования пробы с превращающим гомоцистеин ферментом и субстратом ее предпочтительно инкубируют не менее 30 секунд, в частности, по меньшей мере, 5 минут перед проведением последующих стадий.

В качестве превращающего гомоцистеин фермента, применяемого в тесте изобретения, особенно предпочтительна SAH-гидролаза, но можно применять и другие ферменты. Такими ферментами могут быть, например, бетаин-гомоцистеинметилтрансфераза и другие ферменты, участвующие в превращениях гомоцистеина, как описано, например, Graham b Trends Cardiovasc. Med. 1:244 - 249 /1991//.

Ко-субстрат гомоцистеина, подвергаемый оценке в способе по изобретению, представляет собой соединение, которое реагирует с гомоцистеином в катализируемой ферментом, например, SAH-гидролазой, реакции превращения гомоцистеина.

Подразумевается, что применяемый здесь термин "оценка" означает как количественное, так и качественное определение в смысле получения абсолютной величины для количества или концентрации аналита, например, присутствующего в пробе ко-субстрата гомоцистеина, но также в смысле получения показателя, отношения, процента, визуальной или иной величины, свидетельствующей об уровне аналита в пробе. Оценка может быть непосредственной или косвенной, и фактически определяемые химические молекулы, конечно, не должны быть обязательно самим аналитом, а могут быть, например, его производным или каким-либо иным веществом, что обсуждается ниже.

В способе по изобретению применяют либо ферментные, либо иммунологические способы для оценки аналита. В одном из предпочтительных ферментных способов аналит приводят в контакт с ферментом, для которого он является субстратом, и оценивают либо ко-субстрат, либо прямой или непрямой продукт реакции ферментативного превращения аналита этим ферментом. В предпочтительном иммунологическом способе аналит оценивают при помощи процедуры, предусматривающей конкурентное связывание с антителами аналита и другого гаптена /например, полигаптена или меченого аналога аналита/ и оценку связавшегося или несвязавшегося гаптена.

Предпочтительным превращением гомоцистеин ферментом в соответствии с данным изобретением является S-аденозилгомоцистеингидролаза /SAH-гидролаза/, которая катализирует реакцию аденозин + гомоцистеин S -аденозилгомоцистеин /SAH/. Реакция имеет константу равновесия K 10⁶ М^-1.

Реакция может протекать в любом направлении в зависимости от условий реакции, концентрации реагирующих веществ и т.д.

В представленной схеме реакции аденозин представляет собой ко-субстрат гомоцистеина. Однако в тест-способе изобретения можно применять и другие ко-субстраты, такие как аналоги аденозина или близкие им соединения.

Изобретение имеет особенное преимущество в том, что гомоцистеин действует как ингибитор SAH-гидролазы, подавляя реакцию гидролиза, в результате которой образуются гомоцистеин и аденозин, и сдвигая равновесие реакции в пользу синтеза SAH.

Таким образом, количество гомоцистеина в пробе косвенно влияет на образование или использование ко-субстрата гомоцистеина, например, аденозина, SAH-гидролазой и тем самым на его конечную концентрацию в реакционной смеси. В изобретении конечную концентрацию или изменение концентрации ко-субстрата гомоцистеина, например, аденозина, в реакционной смеси можно использовать в качестве индикатора исходной концентрации гомоцистеина в пробе. Так, если аналитом является ко-субстрат, то способ по изобретению отличается от известных способов тем, что вместо прямой оценки гомоцистеин оценивают косвенно путем определения концентрации его ко-субстрата при его катализируемом ферментом превращении. Это дает прямое преимущество, заключающееся в том, что могут быть применены способы детектирования, которые пригодны для типичных клинических лабораторных процедур, но не могут применяться в прежних тестах на гомоцистеин, например, фотометрические способы, что делает определение гомоцистеина в соответствии с данным изобретением особенно пригодным для рутинного клинического применения.

В предпочтительном варианте способа по изобретению, SAH-гидролазная реакция может проводиться в любом направлении. Так, если тест-проба контактирует с аденозином и SAH-гидролазой, количество потребленного аденозина, соответствующее количеству потребленного гомоцистеина, и количество гомоцистеина в пробе можно, следовательно, определить по изменению концентрации аденозина. Вместо аденозина можно применять аналоги и /или/ гетерирующие аденозин соединения.

В других предпочтительных вариантах можно использовать противоположное направление реакции. Тест-проба может контактировать с SAH /обычно в избытке/ и SAH-гидролазой. Тогда в результате гидролиза SAH образуются гомоцистеин и аденозин. Любой гомоцистеин, присутствующий в тест-пробе, будет противодействовать нетто-реакции и, следовательно, ингибировать образование аденозина, за количеством которого наблюдают.

Субстратами SAH-гидролазы, применяемыми в способе изобретения, могут, следовательно, быть SAH или аденозин или его аналоги и предшественники.

Многие ферменты участвуют в сложном ряду биохимических путей метаболизма, содержащих сульфгидрильные группы аминокислот в теле. Эти пути и реакции хорошо изучены и исследована регуляторная роль участвующих в них ферментов. Роль одного из таких ферментов, SAH-гидролазы обсуждается в обзоре Ueland в Pharmacological Rewiews 34:223-253 /1982/. Trewyn et al., в J. Biochem. Biophys. Met. 4:299-307 /1981/ описывают исследование регуляторной роли SAH-гидролазы и предлагают тест на SAH-гидролазную ферментативную активность. Carras et al., в Analytical Biochem., 199: 112 - 118 /1991/ описали другие реакционные пути с участием гомоцистеина и, в частности, обеспечили тест на медиированное метионинсинтазой превращение гомоцистеина. Ко-субстраты и продукты превращения этих различных реакций можно применять в качестве аналитов в тесте данного изобретения, в частности, при применении иммунологических средств оценки.

Клинические пробы для тестирования в соответствии с данным изобретением могут быть получены из любой биологической жидкости или экстракта ткани и могут быть предобработаны перед тестированием. Однако, как правило, применяют пробы плазмы крови или пробы мочи.

В плазме крови или в моче значительная часть присутствующего гомоцистеина может быть связана дисульфидными связями с циркулирующими белками, такими как альбумин, и гомоцистеин может также присутствовать в форме других дисульфидных производных /обычно в форме коньюгатов гомоцистеин-цистеин/. Для оценки общего количества присутствующего в пробе гомоцистеина может быть желательным обработать пробу восстанавливающим агентом для расщепления дисульфидных связей и высвобождения свободного цистеина.

Дисульфиды легко и специфически восстанавливаются тиолами /например, дитиотреитолом /ДТТ/, дитиоэритритом (ДТЭ), 2-меркаптоэтанолом, тиогликолевой кислотой, глютатионом и подобными соединениями/. Прямое химическое восстановление может быть достигнуто с применением боргидридов /например, боргидрида натрия/ или амальгам /например, амальгамы натрия/ или более специализированных реагентов, таких как фосфины или фосфоротиоаты. Восстановление дисульфидов рассмотрено в обзоре Jocelyn в Methods of Enzymology 143: 243 - 256 /1987/, где приведен широкий диапазон подходящих восстанавливающих агентов.

Аденозин или другие ко-субстраты гомоцистеина могут быть оценены известными способами. Как правило, предпочтительны способы, основанные на фотометрическом /например, колориметрическом, спектрофотометрическом или флуорометрическом/ детектировании, а также иммунологические способы, т.к. они могут быть легко приспособлены для применения в клинических лабораториях. Особенно предпочтительны способы, основанные на ферментной реакции или реакции с моно- или поликлональными антителами, т.к. они являются простыми, быстрыми и относительно недорогими. Так, например, аналит может быть оценен путем мониторинга реакции с ферментами, которые превращают его прямо или опосредованно в продукты, которые могут обнаруживаться фотометрически, например, спектрофотометрически. Подходящими для этого ферментами, которые, разумеется, не должны реагировать с другими субстратами превращающего гомоцистеин фермента, в частности, с гомоцистеином, являются аденозиндеаминаза /превращающая аденозин в инозин/ и аденозинкиназа /превращающая аденозин и АТФ в АДФ и фосфорилированный аденозин/. Такие ферменты могут сочетаться с другими ферментами, которые превращают образовавшиеся продукты в дальнейшие детектируемые продукты.

Примеры иммунологических способов включают в себя способы, предусматривающие реакцию аналита с антителами, специфическими для него, которые либо могут быть сами детектированы, либо могут реагировать далее с образованием детектируемых продуктов, например, в сэндвич-анализе. Однако один особенно привлекательный способ предусматривает применение меченого флуорофором аналога аналита, предпочтительно ко-субстрата, например, меченого флуоросцеином аденозина, который вместе с немеченым аналитом может быть приведен в контакт с антителами к аналиту. Если образующийся продукт подвергают флуоресцентному поляризационному анализу с применением поляризованной возбуждающей радиации, то показания о концентрации немеченого аналита могут быть произведены затем из степени деполяризации флуоресцентного излучения. Антитела к аденозину коммерчески доступны /например, у Paessel & Lorei GmbH, Frankfurt, Germany and Serotech Ltd., Oxford, United Kingdom/, а флуоресцентный поляризационный иммуноанализ /FPIA/ хорошо разработан /см. например, US-А-4420568 и US-А-4593089 и другие публикации Abbot Laboratories, относящиеся к их TDX технологии/.

Таким образом, примеры схем детектирования, применяемых в тесте данного изобретения, включают реакции или с меченым флуорофором аденозином, который конкурирует за АТФ /аденозинкиназу, с оценкой, проводимой при помощи измерения поляризации флуоресценции.

Что касается схем /2/ и /3/, то инозин и мочевая кислота имеют характерные особенности поглощения УФ и поэтому могут прослеживаться спектрофотометрически путем кинетических измерений.

Однако применение УФ-детектирования мочевой кислоты или инозина имеет некоторые ограничения, заключающиеся в том, что чувствительность способа довольно низка и он требует источника УФ-света и наличия прозрачного для УФ контейнера для пробы. Поэтому более удобно полагаться на колориметрическое детектирование или электронные датчики, тем более, что такие способы, в частности, колориметрия, как правило, предпочитаются в клинических лабораториях.

В этой связи особенно применима реакция схемы /2/, в которой генерируемый аденозиндеаминазной реакцией аммиак можно легко детектировать известными колориметрическими способами. Так, например, аммиак, генерируемый в пробе, может реагировать с образованием окрашенных продуктов, образование которых можно детектировать спектрофотометрически. Один из таких способов, описанный в Methods of Enzymatic Analysis /Bergmeyer/ Volume 1: 1049-1056 /1970/ основан на реакции аммиака с фенолом в присутствии гипохлорита в щелочных условиях с образованием окрашенного красителя индофенола В качестве катализатора можно использовать нитропруссид натрия. Можно применять также модификации этого способа, например, с использованием различных производных фенола.

Окрашенный конечный продукт образуется в количествах, прямо пропорциональных концентрации аммиака и, следовательно, аденозина в пробе.

В схеме /3/ реакция ксантиноксидазы пригодна для детектирования при помощи флуорогенов или хромогенов, например, редокс-индикаторов, путем оценки окислительно-восстановительного потенциала или путем измерения потребления O₂ или образования H₂O₂, например, с использованием электронных датчиков. Для этой цели можно применять различные редокс-индикаторы и в литературе описан широкий диапазон способов для оценки H₂O₂ и O₂ в растворе. На практике H₂O₂ часто детектируется в клинических тестах.

Пригодными для этих целей редокс-индикаторами являются метиленовый синий, 2,6-дихлорфенол, индофенол и различные редокс-индикаторы, перечень которых дан в таблице 1 Kodak Laboratory Research Products, Catalog N 53, хотя, конечно, можно применять и другие. Для ускорения редокс-реакций могут быть добавлены ферменты с пероксидазной активностью, например, пероксидаза хрена.

Если желателен осаждающийся хромоген, можно использовать МТТ тетразолий в сочетании с ксантиноксидазой или иными подобными ферментами. Путем применения осаждающегося хромогена или флуорогена можно получить показание иммобилизованной окраски или флуоресценции для визуальной оценки концентрации гомоцистеина.

В схеме /4/ для оценки концентрации аденозина применяют хемилюминесцентную АТФ-реакцию. Основанные на хемилюминесценции тесты обладают высоким потенциалом вследствие низких лимитирований детектирования и относительной простоты необходимого оборудования. Хемилюминесцентные реакции можно применять для детектирования таких аналитов, как АТФ или H₂O₂ и одной из наиболее эффективных и наиболее известных подобных реакций является реакция биолюминесценции светлячка.

Люциферин светлячка имеет бензотиазольную структуру, но доступны люциферины из других биологических источников, имеющие другие структуры. Для аналитических целей АТФ, люциферин или люцифераза могут быть определены непосредственно при помощи этой реакции. Можно использовать другую хемилюминесцентную реакцию, при которой образуется H₂O₂, например, как в схеме /3/. Такой реакцией является реакция люминола /5-амино-2,3-дигидрофталазин-1,4-диона/ с гидрогенпероксидазным катализатором, которая приводит к эмиссии света при 425 нм.

Пероксид водорода, например из схемы /3/, может быть также оценен при помощи неферментативных хемилюминесцентных реакций пероксиоксалата и эфиров акридиния, последних - в водном растворе при нейтральном pH.

Применение меченого флуорофором аденозина в схеме /4/ и оценки при помощи измерения поляризации флуоресценции возможно вследствие относительно широкой субстратной специфичности аденозинкиназы. Кроме того, эта широкая специфичность может быть использована для компенсации эндогенного аденозина /или иных нуклеозидных субстратов аденозинкиназы/ путем добавления аденозинкиназы к пробе в виде предобработки, предпочтительно в сочетании с восстанавливающим агентом /например, ДДТ/.

Такая ферментативная обработка пробы желательна, т.к. во многих вариантах изобретения аналит /например, аденозин/ уже присутствует в пробе в вариирующих количествах, обеспечивая, таким образом, потенциальный источник ошибки в тесте. Фоновое содержание аналита может быть компенсировано проведением теста на части пробы без применения превращающего гомоцистеин фермента /например, SAH-гипролазы/; однако такая процедура требует времени и делает тест более громоздким. Альтернативой является предобработка пробы агентом, служащим для превращения или удаления эндогенного аналита, например, ферментом, таким как аденозиндеаминаза, удаляющим фоновый аденозин. Как было упомянуто выше, во избежание необходимости увеличения требуемого для теста времени такую обработку пробы удобно проводить во время предобработки пробы восстанавливающим агентом для высвобождения гомоцистеина.

Кроме применения спектрофотометрического или колориметрического способов для оценки аналита, можно применять и другие фотометрические способы. Среди наиболее применимых способов, которые могут быть применены, находятся агглютинация частиц и способ иммунопреципитации. При применении поликлональных антител можно использовать прямую агглютинацию частиц или прямую иммунопреципитацию, хотя при использовании SAH-гидролазы в качестве превращающего гомоцистеин фермента это обычно не является предпочтительным. Однако в этом случае можно использовать способы ингибирования преципитации и ингибирования агглютинации частиц. Они основаны на применении комбинаций антитело/гаптен, приводящих к преципитации /осаждению/ или агглютинации частиц, что может быть детектировано путем турбидиметрического или нефелометрического измерения. При ингибировании образования комплекса антитело/гаптен аналитом, например, SAH, содержание SAH можно оценить исходя из уменьшения преципитации/агрегации. Реакцию можно выразить следующим образом: При выполнении теста изобретения с применением SAH-гидролазы в качестве превращающего гомоцистеин фермента предпочтительно либо хранить SAH-гидролазу в присутствии восстанавливающего агента, либо обрабатывать ее восстанавливающим агентом перед ее применением в тесте. Было обнаружено, что хранение ее в других условиях инактивирует фермент и применение восстанавливающего агента предотвращает инактивацию во время хранения или обусловливает реактивацию перед использованием.

Можно применять различные восстанавливающие реагенты /например, ДТТ, цистеин, меркаптоэтанол, дитиоэритрит, боргидрид натрия и т.д./, однако особенно пригоден ДДТ, например, в концентрации 5 мМ. Сам ДТТ должен храниться при низком pH и поэтому тест-набор включает раствор ДТТ при низкой pH /например, около 3/, но с низкой буферной емкостью и отдельный раствор SAH-гидролазы, которая может быть частично или полностью неактивной, при нейтральном pH и в присутствии буфера. При объединении этих растворов фермент реактивируется при нейтральном pH. Это объединение растворов можно, если желательно, проводить в присутствии тест-пробы или при добавлении тест-пробы вскоре после этого, так что одновременно происходит высвобождение гомоцистеина. Как для стабилизации /активации SAH-гидролазы, так и для восстановления пробы для высвобождения гомоцистеина можно применять и другие упомянутые выше восстанавливающие агенты.

Использование восстанавливающих агентов для реактивации инактивированной SAH-гидролазы составляет следующий аспект данного изобретения. Еще одним аспектом изобретения является обеспечение набора, содержащего в первом отделении неактивную SAH-гидролазу, а во втором отделении - восстанавливающий агент, например, ДТТ в кислой среде /например, с pH 3/. С применением этого набора SAH-гидролазу можно смешивать с восстанавливающим агентом и таким образом реактивировать непосредственно перед использованием в тесте.

Другие добавки можно также использовать для усиления стабильности SAH-гидролазы во время хранения и в самом тесте. Такими вспомогательными веществами являются НАД⁺, глютатион, многоатомные спирты и сахара /например, инозит, сорбит, ксилит, эритрит, глицерин, этиленгликолъ, сахарозу, лактит и т. д. /, растворимые полимеры, такие как некоторые декстраны, и белки /например, белки-носители/.

В случае применения в способе по изобретению антител, они могут быть, поликлональными, но предпочтительно являются моноклональными. Если коммерческие антитела не доступны, их можно получить стандартными способами. Так, антитела можно получить в животных или в гибридомах, либо моноклональные, либо поликлональные, например, как описано James Gooding в "Monoclonal antibodies, principle and practice", Academic Press, London, 1983, Chapter 3. Моноклоны должны быть подвергнуты сортировке для отбора клонов, которые различают целевой гаптен среди других субстратов для фермента /ферментов/, например, которые различают аденозин и SAH. Поликлональные антитела, реактивные только с данным аналитом /например, с SAH/ должны быть очищены для удаления перекрестно реагирующих антител, т.е. антител, реактивных с другими субстратами, кроме аналита, например, как с аденозином, так и с SAH. Это можно сделать при помощи афинной хроматографии, например, при помощи аденозина в случае, если аналитом является SAH.

При получении антител применяют в качестве гаптена либо сам аналит, либо другую молекулу, содержащую часть аналита, оцениваемую как наиболее подходящую область связывания, например, область, удаленную от областей участвующих в ферментативной реакции. Гаптен конъюгирован подходящим образом с макромолекулой, такой как бычий сывороточный альбумин /BSA/ или гемоцианин. Для SAH целевой эпитоп находится предпочтительно у тиоэфирного мостика или вблизи его и, следовательно, хотя и можно использовать сам SAH конъюгированный с макромолекулой, но все-таки предпочтительнее применять "упрощенную" молекулу, такую как молекула формулы I где R₁ и R₂ которые могут быть одинаковыми или различными, обозначают атомы водорода или OR₄-группы /где R₄ обозначает низшую, например, C_1-6, в частности, C_1-6, алифатическую группу, такую как алкил, предпочтительно метил или этил/ или R₁ и R₂ вместе обозначают атом кислорода, а R₃ обозначает амино- или карбоксигруппу/ или его соль или эфир /например, с C_1-4-алканолом, также соединенные с макромолекулой.

Примерами соединений формулы I, которые можно использовать в качестве гаптенов, являются Такие "упрощенные" структуры могут быть также заимствованы для вышеупомянутых меченых аналогов, применимых в текстах, в которых аналит и меченый аналог участвуют в реакции конкурентного связывания с антителами. Так, дающая сигнал часть, молекулы R^*, которая может быть выбрана из флуорофоров, хромофоров, радиоактивных меток, ферментных, хемилюминесцентных и других меток, обычно применяемых в иммуноанализе, может быть конъюгирована с аналитом как например, R^* - SAH, были с упрощенной содержащей эпитоп молекулой, такой как Подобные меченые части молекул могут быть, разумеется, соединены с частицами, полимерами, белками или иными материалами, если желательно.

Меченые 6-тиоэфиры фуранозы и соединения формулы I являются новыми и представляют собой дальнейшие аспекты данного изобретения.

В связи со следующим аспектом данное изобретение обеспечивает способ получения соединения формулы I, предусматривающий, по меньшей мере, одну из следующих стадий: /а/ реакцию соединения формулы II в которой R₁ и R₂ имеют описанные выше значения, а каждый R₅ обозначает защищенную гидроксигруппу или оба R₅ вместе обозначают алкилендиоксигруппу /т.е. защищенную биогидроксигруппу, такую как -OC(CH₃)₂O-/ с пропилгалогенидом формулы III R₆(CH₂)₃Hal в которой R₆ обозначает R₃-группу или защищенную R₃-группу, а Hal обозначает атом галогена, например, атом брома/, с последующим удалением любых защитных групп, если это желательно; /b/ для получения соединения формулы I, в котором R₃ обозначает аминогруппу /реакцию соединения формулы II с акрилонитрилом и восстановление и удаление защитных групп полученного цианопропилового тиоэфира; /c/ этерификацию соединения формулы I, в которой R₃ обозначает карбоксигруппу.

Исходные продукты формулы III могут быть получены стандартными способами или известны из литературы. Исходные продукты формулы II могут быть получены из соответствующих 1-гидроксиметилфураноз путем защиты цис-гидроксигрупп, бромирования и последующей реакцией с тиомочевиной и гидролизом. Цис-гидроксигруппы 1-гидроксиметилфураноз могут быть защищены при помощи реакции с обычными защищающими гидроксигруппы агентами, например, с ацетоном.

Примерами схем реакций для получения соединений формулы I являются /соединения /1/ и /3/ коммерчески доступны/ Поглощение УФ, поглощение видимого света или флуоресценция веществ в реакционной смеси, иногда осажденных или иным образом отделенных от реакционной смеси, могут быть измерены в конечной точке реакции /когда сигнал является стабильным/ или в одной или нескольких фиксированных временных точках или, альтернативно, может проводиться кинетическое измерение, при котором в разные точки времени проводят несколько измерений.

Для проведения теста изобретения необходимые реагенты можно добавлять к реакционной смеси последовательно или одновременно. Однако во многих предпочтительных вариантах одна или несколько реакций могут предпочтительно идти в течение некоторого времени перед добавлением реагентов для последующей реакции /реакций/.

Например, при реакции тест-пробы с аденозином и SAH-гидролазой образование SAH из гомоцистеина и аденозина должно происходить в течение некоторого времени перед процедурой оценки аденозина.

В клиническом химическом анализе стандартной практикой является применение стандартных кривых для калибровочных целей. Так, при проведении способа данного изобретения можно использовать пробы с известным содержанием гомоцистеина вместо клинических проб для построения стандартной кривой для измеряемого ответа/сигнала. Содержание гомоцистеина неизвестных проб можно затем рассчитать путем интерполяции из стандартной кривой. Таким образом, точное определение количества образующих сигнал молекул или редокс-потенциалов не является необходимым.

Тест-способ данного изобретения можно применять для диагностики или наблюдения патологических или потенциально патологических состояний, которые связаны с содержанием гомоцистеина или проявляются в определенном содержании гомоцистеина в жидкостях тела или тканях. К таким состояниям относятся атеросклероз, заболевания крови, витаминная недостаточность и /или/ врожденные нарушения метаболизма. Его можно применять также для оценки действия фармацевтических веществ, таких как антифолатные лекарственные средства.

В другом аспекте изобретение обеспечивает аналитический продукт, иногда в форме набора /кита/, для применения в определении гомоцистеина в пробе, содержащий превращающий гомоцистеин фермент, субстрат для этого фермента, иной, чем гомоцистеин, генерирующий сигнал агент и иногда средства для оценки сигнала.

В одном из предпочтительных вариантов аналитический продукт содержит: превращающий гомоцистеин фермент, например, S-аденозилгомоцистеингидролазу; один или несколько субстратов для этого фермента, иных, чем гомоцистеин; средства для генерирования детектируемого производного аналита, выбранного из ко-субстрата гомоцистеина и продуктов ферментативного превращения гомоцистеина; и иногда средства для спектрофотометрической или колориметрической оценки детектируемого производного для обеспечения показателя содержания гомоцистеина в пробе.

В другом варианте продукт содержит: аденозин; S-аденозилгомоцистеингидролазу; превращающий аденозин фермент; иногда ко-субстрат для превращающего аденозин фермента и средства для генерирования фотометрически детектируемого ответа из ко-субстрата или из продукта ферментативного превращения аденозина превращающих аденозин ферментом. Так, например, превращающий аденозин ферментом может быть аденозинкиназа, а средства для генерирования детектируемого ответа могут содержать АТФ, люциферин и люциферазу. Альтернативно, превращающим аденозин ферментом может быть аденозиндеаминаза, а средства для превращения могут содержать нуклеозидфосфорилазу, ксантиноксидазу и пероксидазу.

Еще в одном варианте кит содержит аденозин; S-аденозилгомоцистеин; иногда связанные с частицами матрикса антитела против S-аденозилгомоцистеина; полигаптен для этих антител и иногда средства для фотометрической оценки агглютинации или преципитации комплексов антитело:полигаптен. В этом варианте в качестве удобного полигаптена может быть применен каркасный полимер, с которым конъюгировано множество 6-тиоэфиров фуранозы, например, оставляющий баковые остатки формулы Они могут быть получены, например, реакцией карбоновой кислоты формулы I /или ее ангидрида или галогенангидрида/ с полимером, имеющим множество остатков аминосоединений в качестве боковых цепей /например, полилизин/ или амин формулы I с полимером, имеющий боковые карбоксигруппы.

В наборах все или часть реагентов могут присутствовать в сухом виде, такие как матрикс для процессинга реакций реакционной среды. Подобным образом набор может содержать, как указано выше, в качестве средств для оценки детектируемого аналита или производного относительно недорогое спектрофотометрическое или колометрическое устройство, например, источник света и детекторное устройство, предназначенное для детектирования интенсивности света при длине волны, характерной для детектируемого аналита, и т.д. или даже простую колометрическую калибровочную диаграмму.

Далее данное изобретение будет описано при помощи следующих не ограничивающих изобретение примеров. Особенно предпочтителен тест по примеру 19.

Пример 1. Пробу /водный раствор гомоцистеина для калибровки или плазму или мочу для клинического анализа/ предобрабатывали восстанавливающим агентом /например, 10 мМ дитиотреитолом/. Эту пробу добавляли, предпочтительно до конечной концентрации гомоцистеина в диапазоне 10^-6 - 10^-5 моль/л, к раствору при 37^oC, содержащему кроличьи IgG (5 мг/мл), аденозиндеаминазу (20 мЕ/мл), нуклеозидфосфорилазу (20 мЕ/мл), ксантиноксидазу (20 мЕ/мл), пероксидазу хрена (500 мЕ/мл), 10 ммоль/л дитиотреитола, 10 ммоль/л фосфата натрия, доводили pH до 7,4 и добавляли 100 мЕ S-аденозил-1-гомоцистеингидролазы. Одновременно или последовательно, но предпочтительно после 10 минут инкубации для того, чтобы произошло превращение аденозина внутри пробы, добавляли аденозин в конечной концентрации 510^-6 моль/л. УФ-поглощение измеряли в течение периода 10 мин и ответную реакцию измеряли при 292 нм к