Штамм bacillus subtilis трас, резистентный к тетрациклину, рифампицину, ампициллину, стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов

Реферат

 

Изобретение предназначено для получения пробиотика на основе нового штамма Bacillus subtilis. Штамм В. subtilis ТРАС -КМ- 116 проявляет ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов B. anthracis (возбудителю сибирской язвы), V. cholerae (различным типам возбудителя холеры), Y.pestis (возбудителю чумы), Ps. pseudomallei (возбудителю мелиоидоза). Штамм также обладает множественной (Rifr, Арr, strr, Тcr) лекарственной устойчивостью. Штамм позволяет конструировать на его основе высокоактивный антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии. 2 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения генетически измененных вариантов пробиотиков, с сохранением ингибирующих свойств к Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Pseudomonas (Burkcholderia) pseudomallei. Штамму присвоен номер КМ-116 и он депонирован в Российской коллекции патогенных бактерий "Микроб".

В последние годы в терапии инфекционных заболеваний достаточно широко используют пробиотики - препараты, в состав которых входят животные микроорганизмы (естественные обитатели кишечного тракта человека) или сапрофиты, обитающие во внешней среде. В отличие от антибиотиков они совершенно безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для клинического применения.

Использование для конструирования пробиотиков микроорганизмов из рода Bacillus (чаще, B. subtilis) привело к созданию некоторых эффективных препаратов (бактисубтил, бактерин-СЛ, биоспорин, споробактерин, споролакт, бификол и др.), которые применяют в США, Италии, Югославии, Германии, Франции, Китае, Украине и сравнительно недавно в России (Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В. А. и др. "Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus", Микробиол. журнал, 1993, т.55, N 4, с.92-112; Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Афонская С. В. , Смирнов В.В "Серологический ответ микроорганизма на патогенные бактерии под влиянием пробиотиков из бацилл", Микробиол. журнал, 1993, т.55, N 5, с. 81-83).

Возможность создания новых пробиотиков, совершенствование существующих, а также их более широкое использование для лечения и профилактики инфекционных заболеваний (в том числе особо опасных), дисбактериоза и других нарушений деятельности желудочно-кишечного тракта представляет актуальную задачу.

В инструкциях по применению "Споробактерина", утвержденных решениями Комитета медицинских иммунобиологических препаратов фармкомитета России от 15.10.92 г. и зам.начальника Главного управления ветеринарии от 31.07.92 г. имеется упоминание о том, что поскольку бактерии штамма сенной палочки высокочувствительны к антибиотикам, то "одновременное введение антибиотиков и других антибактериальных препаратов, особенно через рот, резко снижает эффективность споробактерина".

Целью изобретения является получение штамма B.subtilis, обладающего множественной лекарственной устойчивостью (Rifr, Apr, Strr, Tcr) с сохранением ингибирующих свойств к B.antgracis (возбудителю сибирской язвы), V. cholerae (различным типам возбудителя холеры), Y.pestis (возбудителю чумы), P. pseudomallei (возбудителю мелиоидоза), а также культурально-морфологических и биохимических свойств, характерных для штамма прототипа B.subtilis 534, являющегося основой препарата "споробактерин" фирмы "Бакорен", г. Оренбурга.

Для получения антибиотикорезистентных вариантов B.subtilis с помощью методов селекции (Браун В. "Генетика микроорганизмов". Изд. "Наука", М., 1968, с. 134-139) на градиентных пластинках и с помощью различных рекомбинационных процессов (Прозоров А. А. "Генетическая трансформация и трансфекция". Изд. "Наука", М. , 1980, с.124-129; Battisti L., Green B.D., Thorne C.B. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. J.Bacteriology, 1985, V.162, N 2. P.543-550). В качестве исходного (реципиентного) был использован штамм B.subtilis 534 с антимикробным эффектом против патогенной микрофлоры. В качестве донорных культур для осуществления рекомбинационных процессов были использованы маркерные штаммы микроорганизмов (табл. 1).

Предварительно, на - агаре (среда Луриа) с дозами 2,5; 5; 10 мкг/мл антибиотика у штамма B.subtilis 534 был определен уровень чувствительности (резистентности) к различным, наиболее употребляемым в настоящее время в клиниках, десяти антибиотикам: ампициллину (Ap); бензилпенициллину (Bp); тетрациклину (Tc); стрептомицину (Str); хлорамфениколу (Cm); эритромицину (Em); рифампицину (Rif); канамицину (Km); ристомицину (Ris); карбинициллину (Car).

У штамма B. subtilis 534 выявлены единичные клетки популяции бацилл, устойчивые к 10 мкг/мл Str. К остальным антибиотикам B.subrilis 534 была чувствительна.

С высокой частотой выявляются в популяции B.subtilis на градиентных пластинках и Rifr варианты. При этом устойчивость 10 мкг/мл антибиотика в крови (ликворе) кумулируется крайне редко (Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., Медицина, 1982, с.495).

Ампициллинрезистентность (т. е. синтез - лактамазы) у B.subtilis получена с помощью генетических рекомбинационных процессов и имеет ряд особенностей, характерных для резистентности к данному антибиотику - у варианта B. subtilis ТРАС-синтез - лактамазы носит явный индуктивный характер с выраженностью "эффекта массы", т.е. высев малого количества спор или вегетативных клеток этого варианта на среду, содержащую 5-10 мкг/мл ампициллина, из-за малого пула не могут расти на такой среде. В то же время, высев свежей бактериальной массы (вегетативных клеток) этого варианта B.subtilis на среду, содержащую даже больше 10 мкг/мл ампициллина, дает прирост клеток с четким фенотипическим проявлением.

При конструировании пробиотиков с требуемыми свойствами перспективный штамм должен сочетать антагонистическую активность по отношению к заданному набору патогенных культур с достаточной устойчивостью к неблагоприятным условиям среды (в данном случае устойчивость к антибиотикам).

Пример 1. Испытание генетически маркированного штамма B.subtilis ТРАС по проявлению антибиотикорезистентности в сравнении с исходным штаммом - прототипом B.subtilis 534.

Предварительно обе культуры B.subtilis высеваются в пробирки с L-бульоном (фирма "Дифко"). Культуры бацилл подращиваются при 37oC в течение ночи (12-18 ч). Затем бульонные культуры бактериологической петлей высевают бляшками (штрихами) на сектора L-агара с антибиотиками (Rifr, Apr, Strr, Tcr) по 10 мкг/мл и без них. Культивирование посевов на L-агаре при 35-37oC осуществляют в течение 3 сут. Учет результатов роста испытуемой и контрольных культур на средах с различными антибиотиками проводят через 48-72 ч.

На средах с антибиотиками Ap10 и Rif10 растет только культура B.subtilis ТРАС; на среде с St10 - также B.subtilis ТРАС и иногда единичные колонии B. subtilis 534, в то время как на L-агаре без антибиотика растут оба штамма: B.subtilis ТРАС и B.subtilis 534.

На среде с антибиотиками Tc10 растет B.subtilis ТРАС, в то время как B. subtilis 534 к TC10 чувствителен, т.е. рост отсутствует.

Пример 2. Определение антагонистической активности бацилл B.subtilis ТРАС и прототипа B.subtilis 534 по отношению к патогенным микроорганизмам (табл. 2) осуществляли с помощью теста "отсроченного антагонизма" (Константинов Г. Лизоцим. Определение активности лизоцима //Экспериментальная микробиология /Под ред. С. Бырдарова. - София: Медицина и физкультура, 1965, с.327), модифицированного нами.

Для определения антибактериальной активности бацилл B.subtilis ТРАС и B. subtilis 534 делали посев бляшками (3-4 мм в диаметре) взвеси спор испытуемых культур на сектора чашек с BH1 (фирмы "Дифко") агаром (количество засеянных чашек должно соответствовать количеству индикаторных культур - т.е. 6). Бляшки подращивали при 37oC в течение 48-72 ч (размеры их увеличиваются до 15-25 мм в диаметре). Чашки с выросшими бляшками подвергали обработке парами хлороформа - для этого в крышку каждой перевернутой чашки с бляшками добавляли 15-20 капель хлороформа и затем помещали их в эксикатор с крышкой (хлороформирование должно осуществляться не менее 2-х ч, но можно сутки и более). Затем чашки вынимали из эксикатора, проветривали от паров хлороформа.

В расплавленный и остуженный до 45oC 0,5% BH1 агар (по 3 мл в пробирке) засевали 0,1 мл суточной бульонной культуры 1-6 (табл. 2) и наносили (раскатывали) на поверхности BH1 агара с хлороформированными бляшками, но так, чтобы 0,5% BH1 агар не попал на поверхность бляшек, а только соприкасался с их краями. Чашки с посевами культур B.anthacis, V.cholerae, P.pseudomallei помещали в термостат на 24 ч при 37oC, а Y.pestis EV - при 28oC.

Учет результатов "отсроченного антагонизма" B.subtilis ТРАС и B.subtilis 534 по отношению к культурам возбудителей особо опасных инфекций осуществляют в течение 2 сут по зонам просветления (лизиса) газонов вокруг бляшек B. subtilis.

В данном примере антагонистическая активность B.subtilis ТРАС по отношению к патогенным видам микроорганизмов (табл. 2) в тесте "отсроченного антагонизма" проявляется же как и у B.subtilis 534.

Таким образом, представленный штамм B.subtilis ТРАС-КМ-116 проявляет ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладает множественной (Rifr, Apr, Strr, Tcr) лекарственной устойчивостью, что позволяет конструировать на его основе антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии.

Формула изобретения

Штамм Bacillus subtilis ТРАС-КМ 116 (Российская коллекция патогенных бактерий "Микроб"), резистентный к тетрациклину, рифампицину, ампициллину, стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов.

РИСУНКИ

Рисунок 1