Радиоактивный иммунореагент направленного действия, композиция для получения изображения злокачественного новообразования в организме, способ получения изображения и комплексообразующий агент

Радиоактивный иммунореагент направленного действия, композиция для получения изображения злокачественного новообразования в организме, способ получения изображения и комплексообразующий агент

Реферат

 

Изобретение относится к радиоактивному иммунореагенту направленного действия, который представляет собой конъюгат комплексообразующего агента и иммунореактивной группы, меченый ионом радиоактивного металла. Ион радиоактивного металла имеет атомный номер от 21 до 84. Иммунореактивная группа представляет собой антитело, олигонуклеотид или полипептид. Комплексообразующий агент является производным трипиридина. В описании изобретения приведена общая формула используемого комплексообразующего агента. Описана также композиция для получения изображения злокачественного новообразования в организме, содержащая контрастирующий радиоактивный агент приведенного выше состава в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый разбавитель. Кроме того, изобретение относится к способу получения изображения злокачественного новообразования. Способ осуществляют введением пациенту композиции с радиоактивной меткой, включающей эффективное количество комплекса. Измеряют интенсивность излучения, создаваемого радиоактивной меткой за период времени, необходимый для аккумуляции антител на участке новообразования. Интенсивность излучения определяют с помощью специального устройства для фотосканирования. Приводится также комплексообразующий агент, входящий в состав иммунореагента направленного действия, представляющий производное трипиридина. 4 с. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил.

Изобретение относится к новым иммунореагентам, в особенности к направленным радиоактивным иммунореагентам, которые находят применение, например в терапевтических и диагностических препаратах и способах, предназначенных для получения изображения. Настоящее изобретение относится также к новым комплексообразующим агентам.

До 1980 г. рядом лабораторий при различных институтах (S.E. Order et al. , "Use of Isotopic Immunoglobulin in Therapy", Cancer Research 40, 3001-7 (August 1980) была показана возможность направленной доставки радиоиммуноглобулина в участки организма, имеющие опухоли. К 1980 г. было доказано, что опухоли должны концентрировать меченые радиоактивным изотопом антитела к обусловленным опухолью антигенам и что применение меченых радиоактивным изотопом реагентов позволяет как получать диагностическое изображение опухолей, например при помощи гамма-излучения (радиоиммуносцинтиграфии) и позитронной томографии, так и проводить лечение, т.е. уменьшать размер опухоли направлением в цель радиоактивного иммунореагента.

Предыдущие работы по направленной доставке меченых радиоактивным изотопом иммунореагентов проводили с радиоактивным иодом. Однако, как отмечено Scheinberg et al., "Tumor Imaging with Radioactive Metal Chelates Corjugated to Monoclonal Antibodies", Science 215, N 19, 1511 - 13 (March 1982), применение изотопов иода ставит несколько проблем, в частности при получении изображений опухолей сканированием. Из трех обычно доступных изотопов только ¹²³I имеет подходящую излучательную способность для получения изображения и достаточно короткий период полураспада для безопасного диагностирования.

Гамма-излучение ¹²⁵I слишком слабое для получения изображения ¹³¹I часто применяют, но он нежелателен из-за его длинного периода полураспада и обладающего высокой энергией гамма-излучения и цитотоксичного бета-излучения. ¹³¹I также применяют для лечения больших опухолей, но он оказался неэффективным при лечении маленьких опухолей. Кроме того, быстрый метаболизм радиоиодированных антител допускает инкорпорирование иода в щитовидную железу и активную экскрецию иода желудком и мочевыми путями. Такая дисперсия радиоактивного иода препятствует получению изображения специфических опухолей, поскольку на опухоли оказывает влияние фоновое ионизирующее излучение.

Кроме направленной доставки радиоактивных антител в опухоли с целью получения диагностического изображения или лечения, аналогичную направленную доставку проводили для получения изображения при диагностировании инфарктов, в частности инфаркта миокарда, применяя антитела на собачий сердечный миозин (Khaw et al, "Myocardial Infarct Imaging of Antibodies to Canine Cardige Myosin Indium - 111 - Diethylenetriamine Pentaacetic Acid", Science 209, 195-7 (July 1980) и получения изображения при атеросклерозе аналогичной направленной доставкой их в атеросклеротические бляшки. Те же самые недостатки появляются при применении радиоактивного иода для получения изображения при диагностировании инфаркта, как и при применении его для получения изображения опухоли и ее лечении.

Известно, что ¹¹¹In может образовать комплексы с полиаминокарбоновыми кислотами, например этилендиаминотетрауксусной кислотой (EDTA) и диэтилентриаминпентауксусной кислотой (DTPA). Однако ковалентное соединение белков (антител) с этими комплексообразующими агентами, достигаемое ацилированием активированными карбонилами, ароматическим диазониевым сочетанием или бромацетилированием, неэффективно, даже если для облегчения ковалентного соединения белков с комплексообразующими агентами были получены описанные Brechbiel et al ["Synthesis of 1-[p-Isothiocyanatobenzyl) Derivatives of DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor Imaging Studies." Inorg. Chem. 25, 2772-81 (1986)] изоцианатобензилпроизводные этих кислот.

Последние исследовательские работы были направлены на усовершенствование антител (Ab's), например моноклональных, специфических антител для специфической направленной доставки, антител, которые образуют комплекс или связываются непосредственно с радионуклидами, предпочтительных радионуклидов и комбинаций их с антителами и комплексообразующими агентами. Некоторые попытки были предприняты для усовершенствования комплексообразующих агентов.

Тем не менее, EDTA и особенно DTPA, и их производные остаются широко распространенными комплексообразующими агентами, применяемыми для ковалентного связывания антител и образования координационных комплексов с радионуклидами металлов. Однако недостатки DTPA были отмечены, например Parker et al, "Implementation of Macrocycle Conjugated Antibodies for Tumor Targeting", Pure and Appl. Chem. , 61, N 9, 1637 - 41 (1989) : "Обычно образуют комплексное соединение радионуклида металла с ациклическим хелатом образующим агентом (например EDTA или DTPA), который ковалентно соединяют с антителами. Ни один из хелатов не был полностью пригодным из-за тенденции металла к отделению от хелата in vivo, ...", u Cox et al, "Synthesis of a Kinetically stable Yttrium-90 Labelled Macrocycle- Antibody Conjugate", J. Chem. Soc., Chem. Commun. 797-8 (1989) : "Иттрий-90 является привлекательным изотопом для терапии ..., но его клиническое применение будет очень ограничено из-за токсичности его для костного мозга, являющейся результатом промотированного кислотой выделения ⁹⁰Y из соединенного с антителами хелата, например диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA)".

В результате предыдущих попыток разработать улучшенные комплексообразующие агенты были получены материалы, которые имеют свои недостатки. Например Craig et al B "Towards Tumor Imaging with Indium-111 Labelled Macrocycle-Antibody Conjugates, "J. Chem. Soc. Chem. Commun. 794-6 (1989), описали макроциклические гексакоординирующие лиганды, но сообщали, что ограничивающей особенностью такого подхода является необходимость мечения макроцила ¹¹¹In до образования конъюгата с антителами. Связывание индия с (4) проходит недостаточно быстро при 37^oC для эффективного мечения радиоактивным изотопом . ... Поэтому были отобраны другие трехосновные триазамакроциклические лиганды по их способности связывать индий быстро в мягких условиях (20^oC, pH 5 и времени менее 1 ч) и в то же время образовать кинетически стабильный комплекс in vivo ....

Однако только (6) оказался эффективным при концентрации лиганда 10 мкМ, в этих условиях содержание меченого радиоактивным изотопом продукта достигало 96% (30 мин, pH 5 20^oC).

Тем не менее, тридцать минут все же неподходящее время. Желательно иметь комплексообразующие агенты, которые лучше чем EDTA и DTPA и которые координационно связывали бы предпочтительные радионуклины, например In, Y, Sc, Ga, Ge, в течение нескольких минут, т.е. в течение менее чем 5 мин, непосредственно перед введением реагента пациенту, особенно когда короткоживующий радионуклид должен обязательно генерироваться из долгоживущего радионуклида во время лечения пациента.

Следует отметить, что комплексы иттрия, предпочтительно радионуклида иттрия, применяемые в терапии, менее стабильны, чем комплексы индия [Mather et al, "Labelling Monoclonal Antibodies with Yttrium 90" Eur. J. Nucl. Med., 15, 307-312 (1989)], причем имеются в виду обычные комплексы их. Mather et al сообщает, что исследования по поиску тканей- мишеней у раковых пациентов (биораспределение вещества после его введения в организм) с применением меченых радиоактивным изотопом антител дают возможность предположить, что in vivo стабильность меченых иттрием антител не так велика, как у их ¹¹¹In - меченых аналогов, и что эти данные подкрепляются другими недавними публикациями в этой области.

Когда хелатирующие агенты ковалентно связываются с белками (например Ab's), белки обычно способны акцептировать намного более чем одну молекулу хелатирующего агента, поскольку они содержат много аминогрупп и меркаптогрупп, через которые присоединяются хелатирующие агенты. Часто очень важно определить, сколько хелатирующих участков присоединено к каждой молекуле белка. Наиболее подходящий путь осуществления этого - применение спектрометрических средств. Однако ранее известные хелатирующие агенты и хелаты их имеют спектры поглощения, которые перекрываются со спектрами поглощения применяемых белков, и аналитическое определение числа хелатирующих или хелатированных участков на молекулу белка не может быть проведено однозначно спектрометрией, т.к. перекрываемые спектры поглощения маскируют друг друга. Поэтому очень желательно получить хелатирующие агенты для конъюгирования с белками, спектры поглощения которых и спектры поглощения хелатов с металлами которых не перекрываются такими спектрами белков, с которыми хелатирующие агенты химически связаны.

Другая проблема, возникающая при применении некоторых известных таких препаратов, состоит в том, что хелатирующий агент нужно активировать восстановителем до образования радионуклидного хелата. Если конъюгаты с белками образованы до получения радионуклидного хелата, то восстановитель, применяемый для активирования комплексообразующего агента, может разрушать белок. Например, предпочтительные хелатирующие агенты, обычно применяемые для комплексообразования с технецием (Tc) и рением (Re), соединяются с металлами через серосодержащие группы, которые нужно восстановить восстановителем (дитиотреитом) для активирования хелатирующего агента до образования радионуклидного хелата. Если белковый конъюгат, содержащий дисульфидные связи, образован до восстановления, то восстановитель может разрушить белок. Поэтому желательно иметь хелатирующие агенты, способные образовать конъюгаты с белками до комплексообразования с радионуклидами.

Коротко говоря, различные обычно применяемые меченые радиоактивными изотопами антитела и хелатирующие агенты, применяемые для получения иммунореактивных конъюгатов ковалентным связыванием хелатирующего агента с иммунореактивным белком, и радионуклидные комплексы их, применяемые в диагностических препаратах для получения изображений и направленных терапевтических препаратах, обладают одним или несколькими следующими недостатками : 1) токсичностью; 2) дисперсией реагента, обусловленной быстрым метаболизмом, 3) неадекватными эмиссионными характеристиками, 4) недостаточным ковалентным связыванием с белком для получения конъюгата, 5) медленным комплексообразованием с металлами, 6) нестабильными комплексами с металлами, например в отношении температуры, времени или pH, 7) неспособностью образовать конъюгаты и оставаться стабильными при хранении до комплексообразования с металлом, 8) невозможностью спектрофотопетрического анализа радионуклидного комплексного реагента и 9) невозможностью комплексообразования без стадии активирования, которая разрушает белок.

Предложены направленные (в цель) радиоактивные иммунореагенты, которые позволяют разрешить указанные выше проблемы. Направленные радиоактивные иммунореагенты изобретения содержат ион радионуклидного металла, комплексообразующий агент, который является производным пиридина, дипиридина, терпиридина, тетрапиридина, пентапиридина, гексапиридина или фенантролина, и иммунореактивную группу, ковалентно связанную через реагирующую с белком группу с компексообразующим агентом.

В соответствии с изобретением предложен направленный (в цель) радиоактивный иммунореагент, содержащий ион радионуклидного металла, комплексообразующий агент и иммунореактивную группу, ковалентно связанную с комплексообразующим агентом, который является соединением формулы A-I (см. в конце описания), R представляет собой водород, алкил, алкокси-, алкилтио-, алкиламино-, алкилформамидогруппу, арил, арилоксигруппу, гетероциклический радикал или реагирующую с белком группу; R¹ представляет собой водород, алкил, алкокси-, алкилтио-, алкиламино-, алкилформамидогруппу, арил, арилоксигруппу, гетероциклический радикал или реагирующую с белком группу; R² представляет собой гидрокси-, карбоксигруппу, гидроксиалкил, алкилтиогруппу, остаток карбонилиминодиуксусная кислота, метилениминодиуксусная кислота, метилентиоэтилениминодиуксусная кислота, карбоксиалкилтиоалкил, остаток гидразинилидендиуксусная кислота или соль такой кислоты или два R² вместе обозначают атомы, необходимые для замыкания макроциклического ядра, содержащего по меньшей мере один координирующий гетероатом и по меньшей мере одну, предпочтительно две, алкиленовые группы, образующие часть ядра; R³ представляет собой водород, алкил, алкокси-, алкилтио-, алкиламино-, алкилформамидогруппу, арил, арилоксигруппу, гетероциклический радикал или реагирующую с белком группу; R⁴ представляет собой водород или реагирующую с белком группу; n = 0, 1, 2, 3 или 4; o = 0 или 1; m = 0 или 1, причем по меньшей мере один из n и m = 0 и по меньшей мере один из R, R¹, R³ и R⁴ является реагирующей с белком группой.

Пиридины имеют формулу A-II где R¹, R² и R³ имеют указанные выше значения.

Дипиридины, терпиридины, тетрапиридины, пентапиридины и гексапиридины имеют формулу A-III где R, R¹, R² и R³ имеют указанные выше значения и n = 0, 1, 2, 3 или 4.

Фенантролины имеют формулы A-IV где R², R³ и R⁴ имеют указанные выше значения.

Настоящее изобретение предлагает новые терперидины, тетрапиридины, пентапиридины и гексапиридины формулы A-I. Предпочтительные терпиридины изобретения имеют формулу A-III, в которой n = 1 и R является радикалом формулы где R⁵ представляет собой алкоксигруппу или алкил, p = 0, 1, 2, 3 или 4 и R⁶ является реагирующей с белком группой.

Изобретение предлагает также новые фенантролины, предпочтительно имеющие формулу A-IV, в которой по меньшей мере один из R⁴ представляет собой реагирующую с белком группу.

Изобретение предлагает также терапевтические и диагностические препараты, содержащие описанный выше направленный (в цель) радиоактивный иммунореагент.

Изобретение предлагает также способ получения для целей диагностирования изображения участка организма пациента, предусматривающий a) введение пациенту эффективного количества описанного выше радиоактивного иммунореагента, способного направиться в участок-цель, и b) активирование (для получения изображения) чувствительного к радиации элемента или устройства, например пленочного или электронного сенсора, радиацией, испускаемой участком-целью.

Способ лечения участков заболевания у пациента по изобретению предусматривает введение пациенту или в образец, взятый у пациента, эффективного количества терапевтического препарата, содержащего указанный выше радиоактивный иммунореагент, способный попадать в определенный участок, и его фармацевтически пригодный носитель.

Важным признаком изобретения является то, что описанные в нем направленные в цель радиоактивные иммунореагенты, содержащие иттрий, обладающий меньшей радиационной токсичностью, чем радиоактивные, содержащие иттрий, иммунореагенты, полученные с другими хелатирующими агентами.

К важным признакам относится также то, что направленные иммунореагенты изобретения не подвергаются быстрому метаболизму и вредному диспергированию.

Другим важным признаком изобретения является то, что описанные комплексы эффективно образуют ковалентные связи с белками и другими биологическими молекулами.

Еще один важный признак изобретения состоит в том, что описанные иммунореагенты обладают хорошими излучающими характеристиками и легко анализируются спектрометрическими способами.

Кроме того, белковые конъюгаты комплексообразующих агентов можно получить и хранить до необходимости получения комплекса с металлом и комплексообразование можно проводить без стадий активирования, которые разрушают белок.

Дополнительно к этому, комплексообразующие агенты быстро образуют комплексы с металлами и полученные хелаты обладают высокой стабильностью по отношению ко времени хранения, температуре и pH.

Другие важные признаки изобретения станут очевидными при прочтении приведенного ниже описания предпочтительных вариантов с учетом предлагаемых чертежей.

Фиг. 1 изображает анализы иммунокомпетентности B 72.3 - THT - Sc⁺⁺⁺, радиоактивного иммунореагента настоящего изобретения, B 72.3 - THT - конъюгаты и немодифицированного B 72.3.

Фиг. 2 изображает анализы иммунокомпетенции B 72.3 - THT - конъюгата, двух препаратов B 72.3 - TMT - конъюгатов и немодифицированного B 72.3.

Фиг. 3 изображает результаты излучения биораспределения B 72.3 - TMT - ¹¹¹In, радиоактивного иммунореагента изобретения, и B 72.3 - DTPA - ¹¹¹In.

Фиг. 4 изображает результаты изучения биораспределения B 72.3 - TMT - ⁹⁰Y, радиоактивного иммунореагента изобретения, и B 72.3 - DTPA - ⁹⁰Y.

Фиг. 5 изображает кривую выживаемости, т. е. число выживших мышей каждый день после первого дня иммунизации по схеме с низкой дозой B 72.3 - DTPA и B 72.3 - TMT и схеме с высокой дозой B 72.3 - TMT и B 72.3 - DTPA.

Фиг. 6 и 7 изображает спектры поглощения TMT, TMT- Y⁺⁺⁺ и TMT - Pb⁺⁺.

Приведенное ниже описание в основном относится к применению направленных (в цель) радиоактивных иммунореагентов в терапевтических и диагностических (для получения изображения) препаратах и способах. Кроме того, направленные радиоактивные иммунореагенты применяют в качестве диагностических реагентов, например реагентов для радиоиммуноэлектрофореза.

Иммунореагенты изобретения содержат ион радионуклеидного металла, комплексообразующий агент и иммунореактивную группу, ковалентно связанную с комплексообразующим агентом через реагирующую с белком группу.

Комплексообразующий агент является производным пиридина, дипиридина, терпиридина, тетрапиридина, пентапиридина, гексапиридина или фенантролина, предпочтительно структурной формулы A-I, приведенной в кратком изложении существа изобретения.

Каждый R в формуле A-I, независимо от других, представляет собой водород, алкил нормального или разветвленного строения, предпочтительно содержащий 1-20 атомов углерода, например метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил, 2-этилгексил, децил, гекасадецил, октадецил; алкоксигруппу, алкил которой содержит 1-20 атомов углерода, как описано выше для R, алкилтиогруппу, алкил которой содержит 1-20 атомов углерода, как описано выше для R, алкиламиногруппу, алкил которой содержит 1-20 атомов углерода, как описано выше для R, алкилформамидогруппу, алкил которой содержит 1- 20 атомов углерода, как описано выше для R, замещенный или незамещенный арил, предпочтительно содержащий 6-20 атомов углерода, например фенил, нафтил, фенантрил, нитрофенил, гидроксифенил, аминофенил, гексадециламинофенил, октадециламинофенил, толил, ксилил, метоксифенил. 3-амино-4-метоксифенил, 4-метокси-3- (N-метилгидразинотиоформамидо) фенил, 3-изоцианато-4-метоксифенил, 3-изотиоцианато-4-метоксифенил, метилтиофенил, карбоксифенил, и алкиларил, например алкилфенил, алкил которого содержит 1-20 атомов углерода, как описано для R, арилоксигруппа, арил которой содержит 6 -20 атомов углерода, как описано выше для R, замещенный или незамещенный гетероциклический радикал, предпочтительно содержащий в ядре 5 или 6 атомов углерода и гетероатомов, например N, S, P или O, например, пиридил, метилпиридил, нитропиридил, метоксипиридил, оксазолил, имидазолил, пиразолил и хинолил, или реагирующую с белком группу. В особенно предпочтительных вариантах R является 4-алкокси-3-аминофенилом или 4-алкокси-3-изотиоцианатофенилом.

Каждый R¹, независимо от других, имеет значение, отобранное из групп, указанных для R. Предпочтительно R¹ является водородом или реагирующей с белком группой.

Каждый R², независимо от других, представляет собой гидроксигруппу, карбоксигруппу, гидроксиалкил, алкил которого предпочтительно содержит 1-4 атома углерода, например гидроксиметил, остаток карбонилиминодиуксусная кислота [-CON(CH₂COOH)₂] , метилениминодиуксусная кислота [-CH₂N(CH₂COOH)₂] ; метилентиоэтилениминодиуксусная кислота [-CH₂SCH₂CH₂N(CH₂COOH)₂]; карбоксиалкилтиоалкил, алкилы которого независимо содержат 1-4 атома углерода, например CH₂CH₂SCH₂ CH₂COOH; остаток 1-гидразин-2- или дендиуксусная кислота, например 1-гидразин-2-или дендиуксусная кислота [-NHN(CH₂COOH)₂] и 1-метил-1-гидразин-2- или дендиуксусная кислота [-N(CH₃)N(CH₂COOH)₂]; и 2,6-дикарбокси-4-пиперидил или соли таких кислот, включая например соли таких металлов, как Na, K, Li и т.д., и соли аммония, например незамещенного аммония, тетраэтиламмония и тетраметиламмония.

Или два R² вместе обозначают атомы, необходимые для замыкания макроциклического кольца, содержащего a) по меньшей мере один гетероатом, координирующий ионы, и b) по меньшей мере одну, предпочтительно две, алкиленовые группы, образующие часть кольца. Образующей макроциклическое ядро группой может быть замещенный (группой с гетероатомом) алкилен, например 2,2-бис-(этоксикарбонил)-1,3-пропилен; или содержащие гетероатом группы, например оксибис (алкилен), например оксибис (этилен), оксибис (этиленоксиметилен), оксибис (этиленоксиэтилен), алкиленокси алкиленоксиалкилен, например метиленоксиэтиленоксиметилен; ариленди (оксиалкилен), например 1,4-диметил-5,6-фениленбис (оксиметилен); 2,6-пиридиленбис (метиленоксиметилен); 2-метокси-5-метил-1,3-фениленбис (метиленоксиметилен) и 1,10-фенантролин-2,9-иленбис (метиленоксиметилен); карбоксиметилиминобис триметилен (карбоксиметил) иминометилен [-CH₂N(CH₂COOH) (CH₂)₃N(CH₂COOH)(CH₂)₃ N(CH₂COOH)CH₂-]; карбоксиметилтиоэтилиминобис триметилен (карбоксиметилтиоэтил) иминометилен, [-CH₂N (CH₂CH₂SCH₂COOH)(CH₂)₃ N(CH₂CH₂SCH₂COOH)(CH₂)₃N (CH₂CH₂SCH₂COOH)CH₂-] ; карбоксиметилиминобис [Этилен (карбоксиметил) иминометилен] , [-CH₂N(CH₂COOH)CH₂CH₂N(CH₂COOH) CH₂CH₂N(CH₂COOH)CH₂-]; карбоксиметилтиоэтилиминобис этилен (карбоксиметилтиоэтил) иминометилен, [-CH₂N(CH₂CH₂SCH₂COOH) CH₂CH₂N(CH₂CH₂SCH₂COOH) CH₂CH₂N(CH₂CH₂SCH₂COOH) CH₂-]; этиленбис (карбоксиметил) иминометилен, [-CH₂N (CH₂COOH)CH₂CH₂N(CH₂COOH) CH₂-]; карбоксиметилиминобис (метилен) [-CH₂N (CH₂COOH)CH₂-]; или соли указанных выше групп, содержащих карбоксигруппы, включая например соли металлов и аммония, указанные для R². В особенно предпочтительных вариантах R² является остатком метилениминодиуксусной кислоты или его солью.

Каждый из R³ независимо от других имеет значение, отобранное из группы, указанных для R. Предпочтительно R³ представляет собой водород.

Каждый из R⁴ независимо от других представляет собой водород или регулирующую с белком группу.

В приведенной выше формуле A-I n = 0, 1, 2, 3 или 4, m = 0 или 1 и o = 0 или 1, причем по меньшей мере один из n и m = 0.

По меньшей мере один из R, R¹, R³ и R⁴ реагирующей с белком является группой. Предпочтительно не более чем один из R, R¹, R³ и R⁴ на каждом ароматическом кольце является реагирующей с белком группой. Наиболее предпочтительно, если только один из R, R¹, R³ и R⁴ в молекуле является реагирующей с белком группой.

Термин "реагирующая с белком группа" обозначает любую группу, которая может реагировать с любыми функциональными группами, обычно присутствующими или введенными в белки. Однако, предполагается, что реагирующая с белком группа может быть конъюгирована с небелковыми биомолекулами. Таким образом, реагирующие с белком группы, применяемые на практике настоящего изобретения, включают такие группы, которые могут реагировать с любой биологической молекулой (включая углеводы, нуклеиновые кислоты и липиды), содержащей реакционноспособную группу, или группу специфического взаимодействия рецептор-лиганд, с образованием группы, связывающей комплексообразующий агент с иммунореактивной группой.

Предпочтительными, реагирующими с белками группами являются (они не ограничиваются перечисленными группами ниже): (1) группа, которая будет реагировать непосредственно с аминогруппами или меркаптогруппами белка или биологической молекулой, содержащей иммунореактивную группу, например содержащие активный галоген группы, включая например хлорметилфенилы и хлорацетил (ClCH₂ CO-), активированные, 2-замещенные удаляемой группой этилсульфонилы и этилкарбонилы, например 2-хлорэтилсульфонил и 2-хлорэтилкарбонил; винилсульфонил; винилкарбонил; эпоксигруппу; изоцианатогруппу; изотиоцианатогруппу, альдегидную группу; азиридиногруппу; сукцинимидооксикарбонил; активированные ацилы, например остатки галогенагидридов карбоновых кислот или смешанных ангидридов, и другие группы, которые применяют в обычных фотографических желатиновых отвердителях; (2) группа, которая может легко реагировать с модифицированными белками или биологическими молекулами, содержащими иммунореактивную группу, т.е. белками или биологическими молекулами, модифицированными для того, чтобы они содержали реакционноспособные группы, указанные в (1), например частичным окислением белка для введения в него альдегидной группы или карбоксигруппы, в этом случае реагирующей с белком группой может быть амино-, алкиламино-, ариламино-, гидразино-, алкилгидразино-, арилгидразино-, карбазидо-, семикарбазидо-, тиокарбазидо-, тиосемикарбазидо-, меркаптогруппа, меркаптоалкил, меркаптоарил, гидрокси-, карбоксигруппа, карбоксиалкил и карбоксиарил. Алкилы реагирующей с белками группы могут содержать 1-20 атомов углерода, как описано выше для P. Арилы реагирующей с белком группы могут содержать 6-20 атомов углерода, как описано выше для R. (3) Группа, которая может соединяться с белком или биологической молекулой, содержащей иммунореактивную группу, или модифицированным белком, как указано в (1) и (2) при помощи сшивающего средства. Некоторые применяемые сшивающие средства, такие, как например дифункциональные желатиновые отвердители, бисэпоксиды и бисизоцианаты, становятся частью, т.е. соединяющей группой, в конъюгате белок - комплексообразующий агент в процессе реакции сшивания.

Другие применяемые сшивающие средства, кроме того, облегчают сшивание, например действуя в качестве расходуемых катализаторов, но не присутствуют в конечном конъюгате. Примерами таких сшивающих средств являются карбодиимидные и карбамоилониевые сшивающие средства, описанные в U. S Patent 4421847, и дикатионные простые эфиры, описанные в U.S Patent 4877724. Описание этих патентов приводится здесь в качестве ссылок. При применении этих сшивающих средств один из реагентов должен иметь карбоксигруппу, а другой должен содержать амино- или меркаптогруппу. Сшивающее средство сначала реагирует селективно с карбоксигруппой, а затем отщепляется в процессе реакции "активированной" карбоксигруппы с амином с образованием амидной связи между белком и комплексообразующими агентами формулы A-I. Таким образом ковалентно соединяются две молекулы. Преимущество этого подхода в том, что исключается сшивание подобных молекул, например комплексообразующих агентов с комплексообразующими агентами, тогда как реакция дифункциональных сшивающих средств населективна, в результате ее образуются нежелательные сшитые молекулы. Предпочтительные, реагирующие с белком группы включают амино- и изотиоцианатогруппы.

Предпочтительные комплексообразующие агенты включают соединения формул 1-59 (см. в конце описания).

Предпочтительные классы комплексообразующих агентов включают терпиридины формулы A-III и фенантролины формулы A-IV. Конкретно предпочтительный класс комплексообразующих агентов имеет формулу A-III, в которой n=1 и R представляет собой фенил, замещенный алкилом или алкоксигруппой, или реагирующую с белком группу. Предпочтительные комплексообразующие агенты включают приведенные выше соединения 20-32. Наиболее предпочтительным комплексообразующим агентом является TMT - изотиоцианат (соединение 24).

Изобретение предлагает новые терпиридины приведенной выше формулы A-III, в которой n=1 и R представляет собой радикал формулы где R⁵ является алкоксигруппой или алкилом; p= 0, 1, 2, 3 или 4; R⁶ является группой, реагирующей с белком, R⁵ является алкилом, предпочтительно содержащим 1-20, более предпочтительно 1-8 атомов углерода, например метилом, этилом; или алкоксигруппой, алкил которой содержит предпочтительно 1-20, более предпочтительно 1-8 атомов углерода, например метокси-, этоксигруппой. R⁶ является описанной выше группой, реагирующей с белком. Предпочтительные группы, реагирующие с белком, включают амино-, алкиламино-, ариламино-, карбазидо-, семикарбазидо-, тиосемикарбазидо-, тиокарбазидо, изоцианато- и изотиоцеанато группу. Особенно предпочтительные группы, реагирующее с белком, включают амино-, изотиоцианато- и семикарбоазидогруппу. Особенно предпочтительные терпиридины включают TMT (соединение 21), TMT - изотиоцианат (соединение 24) и THT соединение 20).

Предпочтительные фенантролины настоящего изобретения имеют формулу A-IV, в которой по меньшей мере один из R⁴ является группой, реагирующей с белком. Предпочтительные группы, реагирующие с белком, включают группы, указанные для R⁶.

Полипиридиновые и фенантролиновые комплексообразующие агенты, имеющие атомы или группы, образующие комплекс металлом, например гетероатомы и иминодиацетатные остатки, можно получить известными в данной области исследования методами. Подходящие схемы реакций описаны в U.S Patent 4837169 и U.S. Patent 4859777, полное описание которых, таким образом, включено здесь в качестве ссылок.

Получение некоторые предпочтительных соединений настоящего изобретения, а именно, тетранатриевой соли 4'-(3-амино-4-метоксифенил)-6,6''-бис(N',N'-дикарбоксиметил-N- метилгидразино)-2,2':6', 2''-терпиридина (THT) и тетранатриевой соли 4'-(3-амино-4-метоксифенил)-6,6''-бис-[N,N-ди(карбоксиметил)аминометил]-2,2': 6', 2''-терпиридина (TМT) показано на реакционной схеме I (см. в конце описания).

Введение в комплексообразующие агенты изобретения описанной выше необходимой группы, реагирующей с белком, можно проводить обычными химическими реакциями. Например, аминогруппы можно ввести в фенилзамещенные полипиридины и фенантролины нитрованием с последующим восстановлением нитрогрупп в аминогруппы. Если необходимо, аминогруппы можно легко превратить в изоцианатогруппы реакцией с фосгеном с образованием хлоркарбониламиногруппы с последующим превращением ее в изоцианатогруппу нагреванием соединения для выделения HC. Карбоксигруппы можно ввести обработкой аминосодержащих полипиридинов и фенантролинов реагентами, например глутаровым ангидридом, с последующим селективным активированием функциональной карбоксигруппы. Защищенные (превращением в циклические ацетали) альдегиды можно получить реакционной последовательностью, необходимой для синтеза полипиридиновых хелатообразующих агентов, и затем удалить у них защитную группу перед конъюгированием с белком.

Класс терпиридинов формулы A-III, содержащих фенил, замещенный алкилом или алкоксигруппой, и группу, реагирующую с белком, особенно благоприятен с синтетической точки зрения. Например присутствие алкила или алкоксигруппы у дибромированного полупродукта синтеза (63) обеспечивает повышенную растворимость его в ТНГ, который является предпочтительным растворителем, применяемым для получения дигидроксизамещенного полупродукта синтеза (66).

Более конкретно, ТМТ (70) является членом подкласса пиридилсодержащих хелатирующих агентов формулы A-III, а именно терпиридином формулы (71), в которой P в положении 4' может быть группой, реагирующей с белком. Действительно, это соединение является членом еще одного подкласса (71), который можно определить как соединения семейства 4' - арилзамещенных терпиридинов (72), у которых X или Y является группой, реагирующей с белками.

Несколько синтетических путей, которые можно применять для получения соединений (72), которые содержат у X или Y группу, реагирующую с белком, в частности нескольких соединений, у которых X или Y является гидроксигруппой, алкилом, алкоксигруппой или содержащей азот или кислород группой, соединенной с группой, реагирующей с белком, описаны ниже.

Соединения (71) и (72) приведены в конце описания.

Полупродуктом синтеза TMT является тетраэфир (73). Его можно омылением превратить в тетракарбоксилат (74) при помощи едкого натра и затем деметилировать с применением H и красного фосфора для получения производного фенола (75) (см. в конце описания).

Фенол (75) можно цианоэтилировать акрилонитрилом и затем обработать спиртом, например этанолом, в присутствии безводного HCl для получения амидата (76a). По другому варианту фенол в виде фенолята можно алкилировать -циано- -галогеналканом и затем обработать снова спиртовым раствором HCl для получения (76b) (см. в конце описания).

Фенол (75) можно также обработать дивинилсульфоном для получения соединения (77a), которое содержит реагирующую с белком винилсульфоновую группу. По другому варианту (75) можно алкилировать - -гидрокси- - -алкилгалогенидом (или сульфонатом) или - -гидрокси- - -полиалкиленоксиалкилгалогенидом (или сульфонатом) и затем обработать дивинилсульфоном для образования винилсульфона (77b). Можно также превратить галогензамещенный спирт, применяемый для получения (77b) в защищенный спирт, например тетрагидропираниловый (ТНР) эфир. Свободный спирт можно выделить обработкой кеталя водной кислотой перед реакцией его с дивинилсульфоном. Реакцию с дивинилсульфоном рекомендуется катализировать основание. В (77b) m=0 или 1 и n=0 или 1-200, но будет пригодна любая оксиалкиленовая группа (см. в конце описания).

По другой синтетической схеме (75) можно алкилировать эфиром галогенуксусной кислоты, например метилбромацетатом, и затем обработать гидразином для получения гидразида (78), который способен реагировать с альдегидной группой, например введенной окислением углеводного остатка, присоединенного к антителу.

По другому варианту гидразид (78) можно обработать водной кислотой, например HCl, и затем нитритом натрия для получения карбонилизида (79). Реакцией последнего с аминогруппами белков при pH выше семи можно получить связанные амидной группой хелаты (см. в конце описания).

Фенил (75) можно также алкилировать для образования алкиленовой или оксиалкиленовой соединяющей группы, которая имеет в концевом положении гидроксигруппу или защищенную гидроксигруппу, как в случае получения винилсульфонов (77b). Алифатический спирт можно затем обработать арилхлорформиатом, например n - нитрофенилхлорформиатом или 2,4,5-трихлорфенилхлорфомиатом для получения карбоната (80). Этот арилхлорформиат может реагировать с аминогруппами белков, например аминогруппами остатков лизина и концевыми аминогруппами пептидов (см. в конце описания).

Соединение (75) мо