Способ изготовления фильтра для табачного дыма, фильтр, сигарета, способ фильтрования табачного дыма

Способ изготовления фильтра для табачного дыма, фильтр, сигарета, способ фильтрования табачного дыма

Реферат

 

Изобретение относится к способу задержания вредных соединений, содержащихся в сигаретном дыму, которые неудовлетворительно задерживаются обычными сигаретными фильтрами. Способ относится к обогащению обычно применяемых фильтров биологическими веществами с ионами металлов Fe²⁺,Сu²⁺,Mg²⁺, образующими комплексные соединения с порфириновым кольцом, а также ионами Fe²⁺, стереоспецифически связанными с белковыми молекулами либо раздельно, либо в сочетаниях между собой. Такое обогащение обычных фильтров указанными биологическими веществами не вносит изменений ни в физические свойства сигаретного дыма (запах, вкус и внешний вид), ни в физические свойства самого фильтра. При изготовлении такого фильтра предусмотрена пропитка обычного фильтра для табачного дыма одним или несколькими биологическими веществами. Фильтр обеспечит задержание вредных соединений, содержащихся в сигарете, до вдыхания курильщиком табачного дыма. 4 с. и 8 з.п.ф-лы, 1 табл., 24 ил.

Изобретение относится к способам предотвращения вдыхания вредных материалов, а именно: окислов азота, свободных радикалов, альдегидов, перекиси водорода, моноокиси углерода, микроэлементов и канцерогенных летучих нитрозосоединений, во время курения сигарет, то есть таких материалов, которые до настоящего времени неудовлетворительно задерживаются применяемыми сигаретными фильтрами (см. , например, PCT/ 82/02820, кл. A 24 D 3/14, 1982, в которой описан сигаретный фильтр, содержащий волокнистую матрицу, обогащенную биологическим веществом).

Во многих публикациях в международных журналах высказывается предположение, что сигаретный дым разделяется на две фазы: а) твердая фаза (смола) и б) газовая фаза. Такое разделение производят с использованием типичного фильтра из кембриджскго стекловолокна, который задерживает 99,9% частиц с размерами более 0,1 мкм. Смола сигаретного дыма содержит в исключительно высоких концентрациях очень стойкие свободные радикалы, которые можно классифицировать по меньшей мере на четыре различные категории.

Частичные хиноны в равновесии с хиноном и гидроксихинонами рассматривают как свободные радикалы, обладающие большинством интересных химических свойств. Хиноновая система восстанавливает молекулярный кислород с образованием высшего окисла O₂, который затем при самопроизвольной дисмутации образует перекись водорода H₂O₂. С каждой затяжкой в газовой фазе вдыхают более 10¹⁵ органических радикалов с периодом полураспада менее 1 с. Однако парадоксально то, что несмотря на столь незначительный период полураспада, такие радикалы в газовой среде способны сохранять высокий уровень активности в течение более 10 мин. В самом деле, по мере приближения к снабженному фильтром концу сигареты концентрация этих радикалов значительно возрастает. Объяснение этому парадоксу следует искать в сохранении устойчивости ситуации благодаря непрерывному образованию свободных радикалов (Pryor, W.A., Stone., Ann. N.Y. Acad.Sci. 686: 12-28, 1993).

В газовой фазе сигаретного дыма самым важным свободным радикалом является окись азота (NO), которая в процессе курения принимает участие в последовательности реакций, в результате которой образу.тся двуокись азота, изопреновые радикалы, перекисные и алкоксильные радикалы. Сигаретный дым включает в себя также существенное число альдегидов, которые вносят свою лепту в его вредные токсические эффекты. Было показано, что незначительные количества альдегидов, экстрагированных из сигаретного дыма, вызывают как катаболизм белка, так и окисление тиоловых групп белков плазмы. Эти свойства, приписываемые альдегидам, являются результатом реакций между карбонильной группой альдегидов и -SH- и - NH₂ группами белков плазмы. Так, например, акролеин, содержащийся в сигаретном дыме, быстро реагирует -SH группами с образованием карбонильных соединений (Alving, K., Forhem, C. и Lundberg, J.M., Br. J. Pharmacol. 110: 739-746). В смоле сигаретного дыма находятся микроэлементы, например железо, медь, марганец и кадмий, которые вовлекаются во многие реакции с образованием свободных радикалов и обуславливают образование очень активных вторичных радикалов (например, перекисных радикалов, алкоксирадикалов, высших окислов, цитотоксичных альдегидов и т.п.). Попадание таких микроэлементов в легкие во время курения сигарет ведет к ряду окислительно-восстановительных реакций как в легочных жидкостях, так и в альвеолярных макрофагах, в результате чего образуются очень активные гидроксильные радикалы (OH-). Эти гидроксильные радикалы образуются главным образом в присутствии железа вследствие реакции Фентона. Медь также способна образовывать в легких гидроксильные радикалы благодаря реакции с перекисью водорода. В низких концентрациях (10^-7 м) марганец усиливает деятельность растворимой гуанилатциклазы эндотелиальных клеток легкого, вызывая образование окиси азота и высшего окисла благодаря механизму позитивной ответной реакции (Youn, Y. K. , Lalonde, C. и Demling, R., Free Rad. Biol. Med. 12: 409-415, 1992). Во время сгорания табака образуется моноокись углерода. Некоторое количество моноокиси углерода задерживается в легких даже после выдоха, что приводит к усилению деятельности растворимой гуанилатциклазы после ее взаимодействия с гемовым остатком энзимов эндотелиальных клеток и других клеток легочной ткани. Повышенное содержание циклического ГМФ внутри клеток в сочетании с механизмом позитивной ответной реакции усиливает образование окиси азота и высшего окисла (Watcon, A., Joyce, H., Hopper, L. и Pride, N. B. , Thorax 48: 119-124, 1993). Газообразная окись азота, которая может продуцироваться клетками многих типов, включая сюда эндотелиальные клетки сосудов и сетчатые эндотелиальные клетки, вызывает расслабление гладкой мышцы (Lowenstein, C.J., Dinerman, J.L., Snyder, S.H., Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). Существуют также экзогенные источники окиси азота, которые аналогично вышеуказанным считают ответственными за повреждение кровеносных сосудов и других тканей. Было с уверенностью установлено, что вторичные и третичные амины способны вступать в реакцию с нитритом и другими агентами нитрозирования с образованием N-нитрозоаминов (Lowenstein, C.J., Dinerman, J.L., Snyder, S.H., Ann. Intern. Med. 120: 227-237, 1994). С 1974 г. результаты ряда исследований продемонстрировали, что во время сбора урожая, обработки табака и курения алкалоиды подвергаются нитрозированию до специфических для табака N-нитрозаминов (CTHA). Из идентифицированных в табаке и/или его дыме CTHA N-нитрозононикотин (NHH), 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (НПБ) и 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанол (НАПБ) являются сильными канцерогенами для животных. NHH индуцирует образование опухоли легких у мышей, опухоли трахей у хомяков и опухолей носовой полости и пищевода у крыс. НПБ индуцирует новообразование в легких у мышей, хомяков и крыс, а также новообразования в печени, носовой полости и поджелудочной железе у крыс. Тампонада слизистой оболочки рта с использованием смеси NHH и НПБ вызывает у крыс образование опухолей в полости рта и легких. Типичное количество как НПБ, так и NHH у большинства сигарет составляет 200 нг/сигарету (Hecht, S. S. , Spratt, T.E. и Trushin, N. Carcinogenesis, 9: 161-165, 1988).

Проведенное авторами изобретения в настоящее время исследование, касающееся влияния сигаретного дыма на легочную ткань, позволило установить, что окись азота вступает в реакцию с высшим окислом с образованием радикала пероксинитрита (ONOO^-) с сильной окислительной способностью, который вызывает в ключевых биомокулелах вторичные вредоносные реакции. Как метаболическое, так и поражающее действие окиси азота на клетки было изучено в лаборатории авторов изобретения in vitro и в экспериментах с живыми существами.

Окись азота в присутствии кислорода окисляется до двуокиси азота (NO₂). Скорость такого окисления зависит от концентрации кислорода и квадрата концентрации окиси азота. Цитотоксичность двуокиси азота очевидна, а в водных растворах она превращается в нитрит и нитрат. Более того, окись азота образует с микроэлементами и/или металлобелками, например с гемоглобином, комплексы (Wink, D.A., Darbyshire, J.F., Nims, R.W., Saavedra, J.E. и Ford, P.E., Chem. Res. Toxicol., 6: 23-27, 1993).

Токсичность высших окислов некоторых типов объясняется тем, что окись азота реагирует с этими высшими окислами с образованием вредного соединения ONOO^-. ONOO^- является необычно стойким соединением, принимая во внимание его сильный окислительный потенциал (+1,4 В). В процессе его разложения оно образует сильноокислительные производные, включая сюда гидроксильную группу, двуоокись азота и нитрониевый ион. Таким образом, любая модификация в процессе образования тканями окиси азота и высшего окисла может привести к образованию вторичных сильноокислительных радикалов (Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., Cancer Mol. Biol., 1: 77-86, 1994). Наконец ONOO^- и его сложные эфиры (RO-ONO или RO-ONO₂) проявляют тенденцию к инактивации ингибиторов альфа-1-протеиназы (Иа1П). Это может быть подтверждено тем фактором, что а) одна перекись водорода не вызывает быстрой инактивации Иа1П, но действует только в присутствии окиси азота, в результате чего образуется ONOO^- и происходит быстрая инактивация Иа1П, б) растворы трет.бутилпероксинитрила (R-O-O-NO₂) или ONOO^- сам вызывает инактивацию Иа1П и в) амины и аминокислоты защищают Иа1П-протеиназу от быстрой инактивации (Moreno, J. J. Pryor, и W.A., Chem. Res. Toxicol. 5: 425-431, 1992). Помимо свободных радикалов, содержащихся в сигаретном дыму, активированные альвеолярные макрофаги составляют другой важный источник продуцирования курильщиками свободных радикалов. Альвеолярные макрофаги, актикированные сигаретным дымом, испытывают респираторный импульс, что приводит к увеличению образования кислородсодержащих свободных радикалов (главным образом O₂-, NO и H₂O₂). У курильщиков, по-видимому, имеется увеличенное число как альвеолярных макрофагов, так и циркулирующих нейтрофилов. Кислородсодержащие свободные радикалы сигаретного дыма также участвуют в развитии рака легких. Вдыхаемый сигаретный дым оказывает на легочные клетки усиленную окислительную нагрузку, приводящую к снижению концентрации внутриклеточных антиоксидантов. Через образование гидроксильных групп перекись водорода вступает в реакцию с ДНК клеток и вызывает разрыв двойной нити. Поскольку этот разрыв может быть предотвращен присоединением каталазы, это косвенно подтверждает повреждающее действие перекиси водорода и гидроксильных групп на клеточную ДНК (Leanderson, P., Ann N.Y. Acad. Sci. 686: 249 - 261, 1993). Более того, перекись водорода способна вызывать преобразование в трахейном эпителии легкого, и с ней связано развитие бронхогенной карциномы у курильщиков. Таким образом, вредная для здоровья роль перекиси водорода (содержащейся в сигаретном дыму), которую она играет в легочных клетках и в развитии рака легких занимает прочное положение в сознании. Смола сигаретного дыма содержит как семихиноновые радикалы, так и железо, образующие, таким образом, систему для продуцирования гидроксильных радикалов. Различные микроэлементы, содержащиеся в смоле сигаретного дыма (железо, медь, марганец, кадмий) могут оказывать как внутриклеточное, так и внеклеточное действие. Fe²⁺ в ходе протекания хорошо известной реакции Фентона Fe²⁺ + H₂O₂ ---> Fe³⁺ + OH + OH^- благодаря гидроксильным группам вызывает множество окислительных реакций. Аналогичным образом продуцирование гидроксильной группа может быть достигнуто посредством Co²⁺. Mn²⁺ является характерным стимулятором активности растворимой гуанилатциклазы. Содержащийся в сигаретном дыму Cd²⁺ исключительно токсичен для легких. Курильщики содержат в своих легких Cd²⁺ в концентрации, которая, по-видимому, вдвое превышает обычную. Полагают, что Cd²⁺ вытесняет Zn²⁺, который в обычном состоянии присутствует в эндотелии легочных сосудов (Kostial, K. , в работе "Trace Elements in Human and Animal Nutrition" (под редакцией W. Mertz), издание пятое, том 2: 319 - 345, издательство Academic Press, Inc., Орландо, штат Флорида, 1986). Альдегиды, содержащиеся в сигаретном дыму, вступают в реакцию с группами -SH и -NH₂ белков, становясь в конечном итоге инертными. Кротоновый альдегид (,- ненасыщенный альдегид), содержащийся в сигаретном дыму, снижает концентрацию -SH групп и повышает концентрацию карбонилсодержащих белков (Stadtman, E.R., Science, 257: 1220 - 1224, 1991).

Сегодня применение сигаретных фильтров настоятельно рекомендуется. Первичной целью добавления фильтров к сигаретам является достижение максимальной степени задержания вредных соединений, присутствующих как в газовой, так и твердой фазах сигаретного дыма. Эпидемиологическое изучение курильщиков показало, что независимо от того, вводили ли сигаретный дым в организм в газовой фазе, твердой фазе или в комбинированной фазе, наблюдалась зависящая от дозы реакция (Surgeon General of the U.S. Public Health Service. The health consequences of using smokeless tobacco, N.H. Publ. N 86: 2874, Бетезда, штат Мэриленд, 1986 г.). Было доказано, что уже сама по себе модификация сигареты является практическим шагом к решению проблемы снижения содержания вредных соединений в сигаретном дыму. Этого первоначально достигали с использованием обычных фильтров, а затем изменением состава табака в процессе химической обработки. В процесс изготовления сигарет изменения были также внесены с использованием пористой бумаги или бумаги, изготовленной из табачных листьев. За последние 15 лет было сделано множество попыток сделать курение менее вредным для здоровья путем уменьшения количества дыма на сигарету, изменения диаметра сигареты и применения перфорированных фильтров. Перфорированные фильтры позволяют разбавлять сигаретный дым воздухом в степени, достигающей 50%. В сочетании с перфорированными фильтрами используют также активированный уголь. Это содействует резкому снижению содержания в дыме смолы и никотина. К таким техническим приемам прибегают, в частности, в таких промышленно развитых странах, как Австрия, Канада, Франция, германия, Швеция, Англия и США. Средний выход смолы и никотина в дыму американской сигареты был снижен соответственно с 38 и 2,7 мг в 1955 г. до 13 и 1 мг в 1991 г. В странах Европейского сообщества эта тенденция к снижению выхода смолы и никотина в сигаретном дыму все еще продолжается. В январе 1993 г. верхний допустимый предел для смолы составил 15 мг, а к началу января 1998 г. он должен быть снижен до 12 мг. Тем не менее в других странах выход смолы в сигаретном дыму составляет 22 мг (Mitacek, E.J., Brunneman, K.D. Pollednak, A.P., Hoffman, D. u Suttajit, M., Prev. Med. 20: 764 - 773, 1993). Изменения, внесенные в процесс изготовления сигарет, привели к удалению из сигаретного дыма некоторых конкретных токсических веществ; более конкретно были внедрены фильтры из ацетата целлюлозы, что обеспечило, таким образом, частичное удаление полулетучих фенолов и летучих N-нитрозаминов (Brunneman, K. D. , Hoffman, D., Recent. Adv. Tobacco Res. 17: 71 - 112, 1989). Количество моноокиси углерода селективно снижают применением перфорированных фильтров. Концентрацию канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) селективно снизили использованием табака, обогащенного нитритом. Однако снижение ПАУ в табаке с использованием высоких концентраций нитрита привело к нежелательному повышению концентрации канцерогенных N-нитрозаминов, поэтому оказалось необходимым уменьшать содержание ПАУ другими средствами [Hoffman, D. , Hoffman, I., Wynder, E. L., Lung Cancer and the Changing Cigarette in Relevance to Human Cancer of N-Nitroso-compounds, Tobacco Smoke and Mycotoxins. (под редакцией O'Neil, I.K., Chen., J. и Bartsch, H.), том 105: 449 - 459, 1991 г.] Из вышеизложенного ясно, что существует необходимость в создании фильтра, способного задерживать вредные окислы азота, свободные радикалы, перекись водорода, альдегиды и концерогенные нитрозосоединения, которые ответственны за вредные эффекты сигаретного дыма на дыхательную и сердечно-сосудистую системы. Для идентификации вредных соединений, содержащихся в сигаретном дыму, авторы изобретения провели химические и биологические эксперименты. Проведенные химические эксперименты включают в себя следующее: а) Идентификация и количественное определение NO и NO_x с помощью нового химического и биологического метода (этот метод был разработан в лаборатории авторов изобретения).

б) Идентификация свободных радикалов с применением методов хемолюминесценции в зависимости от люцигенина.

в) Идентификация альдегидов и хинона путем стимулирования энзиматической системы люциферин-люциферазы (этот метод также был разработан в лаборатории авторов изобретения).

г) Идентификация и количественное определение микроэлементов с применением метода окисления люциферина люциферазой в присутствии АТФ (этот метод был разработан в лаборатории авторов изобретения).

д) Идентификация и количественное определение перекиси водорода с использованием метода хемолюминесценции в зависимости от изолюминолмикропероксидазы.

е) Идентификация и количественное определение ONOO^- спектрофотометрическим анализом и по методу усиленной люминолом хемолюминесценции.

ж) Идентификация канцерогенного нитрозосоединения усиленной люминолом хемолюминесценции.

Проведенные биологические эксперименты охватывают следующее: а) Идентификация окиси азота с использованием изолированной активности растворимой гуанилатциклазы в качестве функционального параметра.

б) Идентификация ONOO^- путем расчета окислительной нагрузки на эритроциты человека, вызванной ONOO^-.

в) Идентификация моноокиси углерода с использованием изолированной активности растворимой гуанилатциклазы в качестве функционального параметра.

Более того, авторы изобретения в лабораторных условиях провели нижеследующие эксперименты: а) Изоляция альвеолярных макрофагов из легких крыс.

б) Расчет окислительной нагрузки на альвеолярные макрофаги, индуцированной гидроперекисью трет-бутила (ГПтБ).

в) Определение NO/NO₂- /ONOO^-, продуцированных альвеолярными макрофагами.

г) Определение перекиси водорода, продуцированной альвеолярными макрофагами.

д) Влияние экзогенной перекиси водорода на продуцирование окиси азота альвеолярными макрофагами.

На добровольцах провели эксперименты in vivo для определения нижеследующих соединений: а) Определение окиси азота в воздухе, выдыхаемом обычными людьми.

б) Определение окиси азота в воздухе, выдыхаемом курильщиками.

в) Определение окиси азота в выдыхаемом сигаретном дыму.

г) Определение ONOO^- в выдыхаемом сигаретном дыму.

д) Определение свободных радикалов в выдыхаемом сигаретном дыму.

е) Определение альдегидов в выдыхаемом сигаретном дыму.

Для определения NO, NO_x, а) содержавшихся в сигаретном дыму, б) выделенных альвеолярными макрофагами после введения сигаретного дыма и в) содержавшихся в сигаретном дыму, выдыхаемом добровольцами, авторами изобретения была сконструирована и изготовлена камера диаметром от 2,5 см, образованная твердыми стержнями из прозрачного плексигласа, с одного конца каждого из которых на механическом токарном станке выполнили отверстия для создания идентичных конических полостей в каждом из таких плексиглазовых стержней. Далее их открытые концы подвергали дополнительной механической обработке и полировке, выполнив соединение между сопряженными коническими элементами, которое позволило очень плотно подгонять и соединять друг с другом обе конические полости. Между соединяемыми элементами в качестве прокладки проложили квадрат из тонкого листового тефлона (политетрафторэтилена толщиной 0,0015 дюйма, 0,038 мм), после чего элементы прижали друг к другу с помощью винтов с накатанными головками. По две трубчатые детали, обеспечивающие доступ с любой из сторон мембраны, позволяли в ходе протекания биологических реакций вводить внутрь, извлекать или модифицировать с любой из сторон мембраны биологически активные образцы и реакционно-способные вещества (фиг. 1).

A) Определение окиси азота хемолюминесценцией.

В соответствии с литературными рекомендациями [Deliconstantion, G., Villiotou, V., Fassitsas, C., (1992) J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65] и [Deliconstantinos, G. , Villotou, V., Stavrides, J.C., (1994) в работе "Biology of Nitric Oxide", под редакцией Feelish M., Busse, R., Moncanda, S. , Portland Rress, в печати] готовили стандартный раствор окиси азота. Реакционный раствор содержал сбалансированный солевой раствор Хэнка (ССРХ) с величиной pH 7,3; 500 мкМ перекиси водорода; 30 мкМ люминола, а его общий объем составлял 500 мкл. Содержание склянки подвергали интенсивному перемешиванию, а выделявшийся материал фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953.

Б. Химическое определение NO/NO^-₂.

Химическое определение окиси азота было основано на диазолизации сульфаноламида окисью азота при кислой величине pH и последующем окислении скополетина, которое может быть определено флуореметрическим путем согласно описанному выше (Deliconstantion, G., Villiotou, V., Fassitsas, C.J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65, 1992). Альвеолярные макрофаги в ССРХ (по 10⁶ клеток/мл) смешивали со 100 мкл реагента, который состоял из 20% сульфаниламина в 20% ортофосфорной кислоты и 25 мкМ скополетина. За затуханием флуоресценции следили при комнатной температуре (22^oC) с помощью спектрофотометра флуоресценции Aminco SPF-500. За флуоресценцией следили непрерывно в течение всего времени до тех пор, пока можно было измерять тангенс угла наклона линии (приблизительно 8 мин). Далее результаты измерения тангенса угла наклона трансформировали в нмоли окиси азота с помощью стандартной кривой, построенной для различных концентраций чистой окиси азота. Нитрит (NO₂-), конечный продукт синтеза окиси азота определяли на основе его накопления в супернатантах культивированных клеток по его реакции с реактивом Грисса.

В. Спектрометрическое определение пероксинитрита (ONOO^-).

ONOO^- синтезировали, титровали и хранили в соответствии с ранее описанным [Deliconstantinos, G., Villiotou, V., Stavrides, J.C., в работе "Biology of nitric oxide" (под редакцией Fellisch, M., Busse, R., Moncanda, S.) Portland Press (в печати)]. Вследствие нестабильности ONOO^- при величине pH 7,4 УФ-спектрограмму фиксировали непосредственно после смещения перекиси водорода с раствором окиси азота. Концентрацию ONOO^- определяли на основе величины эпсилон-302 нм для 1670 м^-1см^-1. УФ-спектрограмма показана после вычитания базальной УФ-спектрограммы для соответствующих концентраций перекиси водорода.

Г. Расчет свободных радикалов.

Расчет свободных радикалов производили с использованием хемолюминесценции, индуцированной люцигенином/ДАМЦО (1,4-диазадицикло-(2,2,2)-октаном в соответствии с ранее изложенным (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis., 1: 22-27, 1993). Реакционная смесь содержала ССРХ с величиной pH 7,4; 30 мкМ люцигенина; 100 мкМ ДАМЦО. Содержание склянки подвергали интенсивному перемешиванию, а выделявшийся материал фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953. Использовали поглотители кислородсодержащих свободных радикалов (ПОД, маннит, гистидин, метионин).

Д. Расчет микроэлементов и альдегидов.

Испытания были основаны на катализируемом люциферазой окислении D-люциферации в присутствии АТФ-магниевой соли в соответствии со схемой реакции Микроэлементы Cd²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺ повышают активность люциферазы, и максимальная хемолюминесцентная реакция возрастает пропорционально концентрации микроэлементов вплоть до 10 мкг. Такие реакции проводят в ССРХ с величиной pH 7,4 при общем объеме 0,5 мл.

Для расчета альдегидов использовали ту же энзиматическую систему люциферин/люцифераза, но без АТФ. Альдегиды вступают в реакцию с этой энзиматической системой, производя хемолюминесценцию в отсутствии АТФ. Испытуемые реактивы брали из комплекта для АТФ анализа (Calbiochem-Novabiochem CA, U.S. A).

Е. Изолирование альвеолярных макрофагов.

Крыс убивали внутривенной инъекцией пентобарбитала натрия, вскрывали грудную клетку, легкие перфузировали для освобождения от крови свободным от Ca²⁺ холодным (4^oC) физиологическим раствором, содержавшим фосфатный буфер (РФБ: pH 7,4), и удаляли в неповрежденном виде из полости грудной клетки. Повторным извлечением ткани через шприц и затем ее пропусканием через установленные последовательно, в порядке уменьшения размера ячеек, сетки из нержавеющей стали с числом отверстий на дюйм соответственно 32, 62 и 68 в условиях постоянного потока сбалансированного солевого раствора Финкельштейна (ССРФ; с величиной pH 7,4) готовили гомогенат легкого крысы. Конечную суспензию альвеолярных макрофагов отстаивали, фильтровали и центрифугировали при 300g в течение 10 мин до образования в пробирке осадка клеток. Осадок из клеток, который содержал более 98% макрофагов, промывали и повторно суспендировали в растворе Рингера. Далее эту процедуру повторяли дважды. На каждую крысу приходилось приблизительно по 1010⁸ изолированных макрофагов. Жизнеспособность определяли по методу исключения с трипаном голубым.

Ж. Идентификация нитрозосоединений.

Нитрозосоединения идентифицировали по медленному выделению окиси азота (NO) после их обработки перекисью водорода. Реакционный раствор содержал 1 мкМ диметилнитрозамина и/или диэтилнитрозамина; 500 мкМ перекиси водорода, 30 мкМ люминола в ССРХ при величине pH 7,4, а его общий объем составлял 0,5 мл. Содержимое склянки подвергали интенсивному перемешиванию, а выделявшийся материал фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953. Для идентификации образования ONOO^- использовали 100 мМ маннита; 100 мМ ДМСО и 3,0 мМ цистеина.

З. Изолирование альвеолярных макрофагов.

Крыс убивали внутривенной инъекцией пентобарбитала натрия, вскрывали грудную клетку, легкие перфузировали для освобождения от крови свободным от Ca²⁺ холодным (4^oC) физиологическим раствором, содержавшим фосфатный буфер (РФБ; pH 7,4), и удаляли в неповрежденном виде из полости грудной клетки. Повторным извлечением ткани через шприц и затем ее пропусканием через установленные последовательно, в порядке уменьшения размера ячеек, сетки из нержавеющей стали с числом отверстий на дюйм соответственно 32, 62 и 68 в условиях постоянного потока сбалансированного солевого раствора Финкельштейна (ССРФ; с величиной pH 7,4) готовили гомогенат легкого крысы. Конечную суспензию альвеолярных макрофагов отстаивали, фильтровали и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин до образования в пробирке осадка клеток. Осадок из клеток, который содержал более 98% макрофагов, промывали и повторно суспендировали в растворе Рингера. Далее эту процедуру повторяли дважды. На каждую крысу приходилось приблизительно по 1010⁸ изолированных макрофагов. Жизнеспособность определяли по методу исключения с трипаном голубым.

И. Окислительная нагрузка на альвеолярные макрофаги, индуцированная гидроперекисью трет.бутила (ГПтБ).

Продуцирование кислородсодержащих свободных радикалов альвеолярными макрофагами, индуцированное 2,5 мМ ГПтБ, определяли с использованием метода люминольной хемолюминесценции. Хемолюминесцентную реакцию фиксировали с помощью люминометра Bedrthold Autolumat LB953 согласно изложенному ранее (Deliconstantinos, G., Krueger, G.R.F., J. Viral Dis., 1: 22-27, 1993).

К. Определение перекиси водорода (H₂O₂).

Готовили изолюминол/микропероксидазную смесь (100 нМ бората натрия, 1 мМ изолюминола, 0,01 мМ микропероксидазы в 70% воды и 30% метанола при величине pH 8). 50 мкл этого реактива смешивали с изолированными альвеолярными макрофагами (10⁶ клеток) в ССРХ при общем объеме 0,5 мл. Данные хемолюминесцентной реакции конвертировали в нмоли перекиси водорода с использованием стандартной кривой, построенной для различных концентраций чистой перекиси водорода.

Л. Получение и очистка растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) для определения моноокиси углерода.

рГЦ из эндотелиальных клеток человека очищали ГТФ-агарозной хроматографией. Цитозоли (10 мг белка) вводили в ГТФ-агарозную колонку (1,8 х 9 см) после предварительного приведения в состояние равновесия 25 мМ трис-HCl буфером с величиной pH 7,6, содержащим 250 мМ сахарозы и 10 мМ MnCl₂. Затем рГЦ элюировали из колонки 5 мл уравновешивающего буфера плюс 10 мМ ГТФ.

М. Определение циклического ГМФ.

Концентрацию цГМФ определяли радиоиммунным анализом после ацетилирования образцов уксусным ангидридом (Deliconstantinos, G., и Kopeikina, L., Anticancer Res. 9: 753-760, 1989). Реакционная смесь содержала 50 мМ триэтаноламина/HCl, 5 мМ креатинфосфата; 3 мМ хлорида магния; 1 мМ изобутилметилксантина; 0,6 ед. креатинкиназы; 1 мМ ГТФ и растворимую гуанилатциклазу (1 мкг белка) при общем объеме 150 мкл. Добавлением ГТФ инициировали реакции и инкубировали 10 мин при 37^oC. Питательную среду аспирировали и цГМФ экстрагировали добавлением охлажденной льдом 0,1М соляной кислоты. По истечении 10 мин образцы переносили в новую чашку Петри, сушили и для определения цГПФ вновь восстанавливали влагосодержание добавлением 5 мМ ацетата натрия (при величине pH 4,75). Образовавшуюся цГМФ определяли с использованием комплекта для цГМФ анализа (AmerSham).

Целью изобретения является разработка и применение способов, при осуществлении которых используют биологические вещества, вступающие в специфические реакции и обеспечивающие поглощение нижеследующих материалов: а) NO и NO_x; б) моноокиси углерода; в) перекиси водорода; г) свободных радикалов; д) альдегидо-хинонов; е) канцерогенных нитрозосоединений и ж) задерживающие микроэлементы: кадмий, медь, марганец, железо и тому подобное, которые вдыхают при курении.

Сущность изобретения в значительной мере основана на знании того, что: а) имеется выбор соответствующих поглотителей, подобных гемоглобину или лизатам эритроцитов, или любому веществу, которое содержит стереоспецифически связанное железо; б) существует выбор поглотителей, которые содержат порфириновое кольцо с железом (например, протопорфирин); в) существует выбор поглотителей, включающих в себя порфириновое кольцо, которое устраняет необходимость в присутствии железа; г) имеется выбор поглотителей, которые содержат порфириновое кольцо в комплексе с другими металлами, например с Mg²⁺, Cu²⁺, д) должен быть разработан биотехнический способ обогащения обычных материалов, используемых в настоящее время для изготовления сигаретных фильтров, которые в результате должны содержать вышеупомянутые биологические вещества-поглотители.

Основная идея настоящего изобретения заключается в концентрации, согласно которой пропитка обычно применяемых сигаретных фильтров и/или фильтров, содержащих активированный уголь, может быть обогащена биологическими веществами, характеризующимися присутствием металлических ионов Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, образующих комплекс с порфириновым кольцом, а также Fe²⁺, стереоспецифически связанного с белковыми молекулами, благодаря чему обеспечивается задержание вредных соединений, содержащихся в сигарете, до вдыхания курильщиком сигаретного дыма. Этот факт является основной характеристикой настоящего изобретения и составляет неоспоримое нововведение с большой вероятностью промышленного применения.

Настоящее изобретение создавали, следуя путем, который позволил бы ему найти применение на уровне промышленного производства.

Готовили раствор 1 мг/мл гемоглобина и/или лизата эритроцитов в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РФБ) с величиной pH 7,4 и его добавляли к 100 мг активированного угля. Смесь инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и фильтровали через фильтровальную бумагу S & S Carl Schleicher & Schuell Co U.S.A. По данным спектрофотометрического анализа фильтрата рассчитывали количество неабсорбированного гемоглобина. Уголь, обогащенный гемоглобином, оставляли сохнуть при комнатной температуре. 200-миллиграммовое количество угля, обогащенного гемоглобином, в виде прокладки помещали между двумя обычными фильтрами таким образом, что весь сигаретный дым, который через них аспирировали, входил в контакт с активными группами молекул (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂) (фиг. 2). После этого такие совместимые материалы были готовыми к использованию для изготовления новых сигаретных фильтров, которые авторы изобретения с данного момента называют биологическими фильтрами.

В другом варианте гемоглобин может быть заменен биологическими веществами, характеризующимися присутствием металлических ионов Fe²⁺, Cu²⁺, Mg²⁺, образующих комплекс с порфириновым кольцом, а также Fe²⁺, стереоспецифически связанного с белковыми молекулами, в частности такими, как трансферин, каталаза, протопорфирин, цитохром C, хлорофилл.

В другом варианте готовили раствор 5 мг/мл гемоглобина и/или лизата эритроцитов в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РФБ) с величиной pH 7,4 и его сканировали при 25^oC с использованием самопишущего спектрофотометра Acta Beckman. Пики поглощения наблюдали соответственно при 540 и 575 нм (Smith, R.R., Kruszyma, H.J. Pharmacol. Exper. Ther. 191, 557-563, 1974). Обычно применяемые сигаретные фильтры пропитывали этими растворами и сушили на воздухе при 25-35^oC. После этого такие совместимые материалы были готовыми к использованию для изготовления новых сигаретных фильтров, на которые авторы изобретения с данного момента ссылаются как на биологические фильтры. Эти новые биологические фильтры обеспечивают прохождение вдыхаемого дыма в полном контакте с активными группами молекул гемоглобина и/или лизатов, находящихся в фильтре, без изменения физических свойств или вкуса сигаретного дыма. По эстетическим причинам видимый конец биологического фильтра можно нарастить небольшим участком (3 мм) обычного фильтра.

В соответствии с применяемыми для промышленного изготовления альтернативными способами предусмотрено нижеследующее.

Готовили раствор 5 мг/мл протопорфирина в растворе с фосфатным буфером (РФБ) с величиной pH 7,4 и его сканировали при 25^oC с использованием самопишущего спектрофотометра Acta Beckman. Возбуждение протопорфирина ультрафиолетовым облучением (498-408) вызывало оранжево-красную флуоресценцию с длиной волны в диапазоне 620-630 нм. Здесь обычные фильтры пропитывали (вымачивали) вышеуказанным раствором и сушили нагретым воздухом (25-35^oC).

В другом варианте раствор 5 мг/мл трансферина в РФБ с величиной pH 7,4 сканировали с использованием самопишущего спектрофотометра Acta Beckman. Трансферин с трехвалентным железом проявлял характерный спектр 470 нм. Для пропитки используемых в настоящее время обычных фильтров применяли вышеописанные способы.

В альтернативном варианте готовили раствор 5 мг/мл катализы в РФБ с величиной pH 7,4. Осуществляли вышеописанный способ изготовления биологического фильтра.

В еще одном варианте готовили раствор цитохрома C 5 мг/мл в РФБ с величиной pH 7,4. Осуществляли вышеописанный способ изготовления биологического фильтра.

В другом варианте готовили раствор 5 мг/мл хлорофилла в РФБ с величиной pH 7,4. Осуществляли вышеописанный способ изготовления биологического фильтра.

По другому варианту вышеупомянутые биологические вещества помещали в виде прокладки между двумя обычными фильтрами в твердой форме таким образом, что весь аспирированный через фильтр сигаретный дым входил в контакт с активными группами молекул (Fe²⁺, Fe³⁺, -SH, -NH₂).

Различные биологические вещества, использованные для обогащения обычных фильтров, проявляют способность задерживать токсические соединения (окись азота, моноокись углерода, свободные радикалы, перекись водорода, альдегиды, а также микроэлементы и нитрозосоединения), содержащиеся в сигаретном дыму, в различной степени, как это видно из таблицы, приведенной ниже.

Определяли степень задержания очень вредных для здоровья веществ сигаретного дыма и 20 мл сигаретного дыма, профильтрованного через биологический фильтр, сопоставляли с 20 мл дыма, профильтрованного через обычный фильтр. Только 1 мл сигаретного дыма, аспирированного через обычный фильтр, сравнивали с 40 мл сигаретного дыма, аспирированного через биологический фильтр. Оказалось, что способность удерживать микроэлементы у биологического фильтра в 40 раз выше, чем у обычных фильтров.

В нижеследующем подробном описании экспериментальной части типичные результаты представлены таким образом, чтобы понятнее была активность биологических веществ.

а) Идентификация окиси азота, содержащейся в сигаретном дыму, с использованием метода хемолюминесц