Фармацевтическая композиция на основе медиатора межклеточной адгезии (варианты), способ ингибирования межклеточной адгезии, способ лечения воспалительного заболевания, способ анализа тестируемого соединения на способность ингибировать клеточную адгезию, способ получения соединения

Фармацевтическая композиция на основе медиатора межклеточной адгезии (варианты), способ ингибирования межклеточной адгезии, способ лечения воспалительного заболевания, способ анализа тестируемого соединения на способность ингибировать клеточную адгезию, способ получения соединения

Реферат

 

Изобретение относится к композициям и способам для уменьшения или регулирования воспаления и для лечения воспалительных заболеваний и других патологических нарушений, в которых участвует межклеточная адгезия. В соответствии с настоящим изобретением предлагаются композиции, которые селективно связываются с рецептором селектина и которые содержат по крайней мере одну связывающуюся с селектином составляющую. Связывающие селектин составляющие имеют общую формулу: R¹ -Gal1,4 (Fuc1,3)GlcNAc-(R²)_a-X, в которой R¹ является олигосахаридом или R₃ - R₄ - C (CO₂H)-, в которой R₃ и R₄, которые могут быть одинаковыми, так и различными, являются - H, - C₁ - C₈ алкилом, - гидрокси C₁ - C₈ алкилом, -арил C₁ - C₈ алкилом или - алкокси C₁ - C₈ алкилом, в которой R² является 1,3Gal, 1,2Man или 1,6GalNAc, a = 0 или 1. Изобретение расширяет арсенал средств для регулирования патологических нарушений, в которых участвует межклеточная адгезия. 13 с. и 66 з.п. ф-лы, 11 ил., 6 табл.

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для уменьшения или подавления воспаления, и для лечения воспалительных процессов и других патологических нарушений, в которых участвует межклеточная адгезия.

Эндотелиальные клетки сосудов и кровяные пластинки (тромбоциты) играют ключевую роль в нескольких биологических ответах при помощи селективного связывания некоторых клеток, например, фагоцитных лейкоцитов, в кровяном потоке. Например, эндотелиальные клетки в предпочтительном варианте связывают моноциты и гранулоциты перед их миграцией через стенку кровеносного сосуда и в окружающую ткань в воспалительной реакции. Известно, что некоторые, подавляющие воспаление, соединения действуют непосредственно на эндотелий сосудов, чтобы промотировать адгезию лейкоцитов к стенкам сосудов. Далее клетки проходят через стенки в область поражения или инфекции. Предполагается, что клеточная адгезия к эндотелию сосудов существует также в метастазах опухолей. Циркулирующие раковые клетки очевидно используют преимущество нормальных воспалительных механизмов организма и связываются с областями стенок кровеносных сосудов, где эндотелий активирован.

Кровяные пластинки также принимают участие в тех же реакциях. Известно, что кровяные пластинки становятся активированным и во время инициирования гемостаза и подвергаются основным морфологическим, биохимическим и функциональным изменениям (например, быстрый экзоцитоз гранул или дегрануляция), в которых мембрана альфа-гранулы пластинки сливается с внешней мембраной плазмы. В результате начинают экспрессироваться новые протеины клеточной поверхности, которые наделяют активированные пластинки новыми функциями, такими как способность связываться как с другими активированными пластинками, так и другими клетками. Активированные пластинки (тромбоциты) включаются в растущие тромбы или быстро освобождают циркулирующую кровь. Активированные тромбоциты, как известно, связываются с фагоцитными лейкоцитами, включая моноциты и нейтрофилы. Примеры патологических и других биологических процессов, в которых видимо участвует в качестве промежуточного последний процесс, включают атеросклероз, образование сгустков крови и воспаление.

В результате недавних работ было обнаружено, что специлизированные рецепторы клеточной поверхности на эндотелиальных клетках и тромбоцитах, именуемые как эндотелиальная молекула-1 адгезии лейкоцитов (ELAM-1) и протеин-140 мембраны гранул (GMP-140) соответственно, включаются в узнавание различных циркулирующих клеток эндотелием и тромбоцитами. Эти рецепторы являются поверхностными гликопротеинами с областью, напоминающей лектин, зоной с гомологией относительно эпидермального фактора роста и зоной с гомологией относительно дополнительных регуляторных протеинов /см. Bevilacgua и др., Science т. 243, стр. 1160 /1989/, которая включена здесь в качестве ссылки/. Например, было показано, что ELAM-1 участвует в эндотелиальной адгезии лейкоцитов, что является первой стадией во многих воспалительных реакциях. В частности, ELAM-1 связывается с человеческими нейтрофилами, моноцитами, эозинофилами, некоторыми Т-лимфоцитами /N. Graber и др., J. Jmmunol, т. 145, стр. 819 /1990//, NK-клетками и линией промиэлоцитных клеток HL-60.

Термин "селектин" был предложен для общего класса рецепторов, который включает ELAM-1 и GMP-140, ввиду их области, напоминающей лектин, и селективной природы их адгезионных функций. Эти рецепторы клеточной поверхности экспрессируются на самых разнообразных клетках. GMP-140 (известный также под обозначением PADGEM) содержится на поверхности тромбоцитов и эндотелиальных клеток, где он участвует во взаимодействиях тромбоцит-лейкоцит и эндотелий-лейкоцит. Еще одним членом класса селектина является антиген MEL-14 и его человеческий аналог LAM-1, которые являются клеточными поверхностными рецепторами лимфоцитов и действуют как "домашние" рецепторы лимфатических узлов. Точная природа лиганда, узнаваемого рецепторами селектина, остается неизвестной.

Ранее были разработаны различные другие приемы блокировки действия селектинов и, таким образом, ингибирования клеточной адгезии. Например, использование моноклональных антител, направленных на ELAM-1, было предложено в качестве процедуры ингибирования адгезии эндотелий-лейкоцит с целью лечения патологических реакций, таких как воспаление. Эндотелиальный интерлеукин-8, как было установлено, также является ингибитором взаимодействий лейкоцит-эндотелий.

После того, как будет выяснено взаимодействие лиганд-рецептор, станет возможным разрабатывать высокоспецифические, эффективные ингибиторы клеточной адгезии с участием селектина, которые были бы весьма полезны при терапевтическом лечении. Лиганд (лиганды) также можно использовать для синтеза других фармацевтических соединений, таких как противовоспалительные агенты или антиоксиданты, для применения к местам поражений. До настоящего времени недостаточное понимание взаимодействия лигандов и молекул рецепторов на соответствующих клетках осложняло эти усилия. Настоящее изобретение удовлетворяет эти и некоторые другие нужды.

Новые композиции, которые селективно связываются с рецептором селектина и которые содержат по крайней мере одну связывающую селектин составляющую, являются предметом настоящего изобретения. Связующие селектин составляющие имеют общую формулу: R₁-Gal 1,4(Fue 1,3)GlcNAc - (R₂)_a, в которой R₁ является олигосахаридом или R₃-R₄-C/CO₂H/-, в которой R₃ и R₄, которые могут быть как одинаковыми, так и различными, являются -H, C₁-C₈ алкилом, -гидроксил C₁-C₈ алкилом, -арил C₁-C₈ алкилом или -алкокси C₁-C₈ алкилом; в которой R₂ является 1, 3Gal, 1,2 Man, или 1,6 GalNAc и a равно 0 или 1.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления R₁ является сиаловой кислотой, в общем случае, NeuAc или NeuGc.

Если R₁ является олигосахаридом, им в предпочтительном варианте является Neu Ac 2, 3 Gal 1, 4GlcNAc 1 или Neu Gc 2, 3 Gal 1, 4GlcNAc 1,3. Селектинсвязывающими составляющими являются в общем случае олигосахариды, содержащие минимальный тетрасахарид (именуемый SLX), узнаваемый рецептором селектина.

Это соединение в общем случае получают из полисахарида, имеющего повторяющийся блок, содержащий структуру ядра нефукозилированного SLX. При фукозилировании получают поливалентный, несущий SLX, полисахарид. Предпочтительными полисахаридами для этой цели являются полисахариды типа 1a, типа II и типа III из стрептококка Группы B. Поливалентные, связывающие селектин, соединения получают также при помощи соединения составляющих, связывающих селектин, с различными составляющими линкера.

Предлагаемые композиции ингибируют межклеточную адгезию, в которой участвует клеточный поверхностный рецептор селектина, и при этом они способны, например, ингибировать воспаление и другие патологические реакции, связанные с клеточной адгезией. В соответствующих вариантах осуществления композицией, которая связывает селектин, может быть полисахарид, гликопротеин, гликолипид или олигосахарид.

В соответствии с настоящим изобретением, в частности, предлагаются вышеупомянутые соединения в фармацевтических композициях. Эти фармацевтические композиции могут содержать, например, липосомы, которые содержат составляющую, способную селективно связываться с рецептором селектина, и приемлемый с фармацевтической точки зрения носитель. Липосома, содержащая такую составляющую, может также служить в качестве "переносчика к цели" для известного хемотерапевтического агента, который заключен внутри липосомы, и доставляется к намеченным клеткам, которые экспрессируют рецептор селектина. В общем случае хемотерапевтическим агентом является противовоспалительный агент или антиоксидант. Использование составляющих, описанных здесь, для доставки к цели химических агентов, заключенных внутри липосом, является известным и эффективным приемом для снижения терапевтических концентраций медикамента и минимизации побочных эффектов.

Фармацевтические композиции, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут также содержать иммуноглобулины, способные селективно связываться с лигандом олигосахарида, узнаваемым рецептором селектина. Соответствующими иммуноглобулинами для этой цели являются CSLEX-1, FH₆, SNH₃, SNH₄ и УТМ-2.

В других аспектах, в соответствии с настоящим изобретением предлагаются способы ингибирования межклеточной адгезии у пациента с таким заболеванием, как воспаление, при помощи применения к пациенту терапевтически эффективной дозы соединения, содержащего составляющую, способную связываться с рецептором селектина. Рецептор селектина, такой как ELAM-1 или GMP-140, может экспрессироваться на клетках эндотелия сосудов или тромбоцитах. Воспалительным процессом может быть, например, септический шок, рана, связанная с сепсисом, острое респираторное заболевание.

Фиг. 1 иллюстрирует способность клеток, которые экспрессируют SLX (LEC 11), связываться с IL-1 -активированными эндотелиальными клетками в сравнении с теми клетками, которые экспрессируют несиалированный Le^x (CHO-K1 и LEC 12).

Фиг. 2 иллюстрирует способность моноклональных антител, специфических для SLX, блокировать связывание в участием селектина клеток HL-60 при температуре 37^oC (фиг. 2A) и 4^oC (фиг. 2B) по сравнению с моноклональными антителами, которые не связывают SLX-детерминанты.

Фиг. 3 иллюстрирует эффекты инкубирования LEC 11- (фиг. 3A) и LEC 12- фиг. 3B) клеток с SLX и не-SLX специфическими моноклональными антителами на связывание с активированными эендотелиальными клетками.

Фиг. 4 иллюстрирует результаты, полученные при помощи обработки клеток HL-60, LEC11 и LEC12 сиалидазой перед связыванием с активированными эндотелиальными клетками.

Фиг. 5 сравнивает способность липосом, которые содержат гликолипиды с SLX, Le^x или аналогичными углеводными структурами, ингибировать связывание клеток HL-60 с активированными эндотелиальными клетками.

Фиг. 6 сравнивает ингибирование адгезии тромбоцитов с участием GMP-140 при помощи моноклональных антител, специфических относительно SLX и Le^x детерминантов.

Фиг. 7 сравнивает способность липосом, которые содержат гликолипиды с SLX, Le^x или аналогичными углеводными структурами, ингибировать связывание клеток HL-60 с активированными тромбоцитами.

Фиг. 8 сравнивает способность липосом, которые содержат гликолипиды с SLX, Le^x или аналогичными углеводными структурами, ингибировать связывание PMN с активированными тромбоцитами.

Фиг. 9 показывает ингибирование адгезии с участием GMP-140 при помощи гликолипидов с концевой сиаловой кислотой, либо NeuAc, либо NeuGc.

Фиг. 10 демонстрирует профилактически применимые моноклональные антитела против ELAM-1, чтобы предотвратить вызываемую липополисахаридами гибель крыс.

Фиг. 11 демонстрирует терапевтически примененные моноклональные антитела против ELAM-1, чтобы предотвратить вызванную липополисахаридами гибель крыс.

Предлагаются композиции и способы ингибирования воспалительных и других болезненных реакций, в которых участвует клеточная адгезия. В соответствии с настоящим изобретением предлагаются также соединения (например, гликоконъюгаты и моноклональные антитела), которые обладают способностью блокировать или ингибировать адгезию клеток с участием клеточных поверхностных рецепторов селектина. Предложены также способы получения и "просеивания" таких соединений. Предложено также диагностическое и терапевтическое использование таких соединений.

Основу настоящего изобретения составляет открытие углеводной составляющей, узнаваемой поверхностными клеточными рецепторами селектина. Как уже было указано выше, селектины, известные также как семейство "LEC-CAM" молекул в клеточной адгезии, являются уникальными гликопротеинами, экспрессируемыми на поверхности самых разнообразных клеток. Например, ELAM-1 индуцированно экспрессируется на эндотелиальных клетках сосудов /Bevilacgua и др., см. выше и Hession и др., Proc. Natl. Acad. Sci., т. 87, стр. 1673-1677 /1990/; обе эти работы включены здесь в качестве ссылок/. Как было установлено, этот рецептор индуцируется воспалительными цитокинами, такими как интерлеукин 1\ (IL-1 ) и фактор некроза опухоли (TNF , а также бактериальным эндотоксином /липополисахаридом/ /см. Bevilacgua и др., Proc. Natl. Acad. Sci., т. 84, стр. 9238-9242 /1987/, которая включена здесь в качестве ссылки/. Эти соединения действуют непосредственно на эндотелиальные клетки in vitro, чтобы существенно увеличить адгезию полиморфоядерных лейкоцитов (нейтрофило) и моноцитов (Bevilacgua и др., Proc. Natl. Acad. Sci., см. выше).

Как уже было указано выше, GMP-140 является мембранным гликопротеином тромбоцитов и эндотелиальных секреторных гранул /Geng и др., Nature т. 343, стр. 757-760 /1990/, которая включена здесь в качестве ссылки/. Активированные тромбоциты, которые экспрессируют GMP-140 на своей поверхности, как известно, связываются с моноцитами и нейтрофилами /Jungi и др., Blood, т. 67, стр. 629-636 /1986//, а также с линиями клеток, похожими на моноциты, например HL60 и U937 /Jungi и др., см. выше; Silvestein и др., J. Clin Invest, т. 79, стр. 867-874 /1987//; все эти работы включены здесь в качестве ссылок. GMP-140 является мембранным протеином гранул альфа с молекулярной массой 140 000, который экспрессируется на поверхности активированных тромбоцитов при стимуляции тромбоцитов и секретировании гранул /HSU-Lin и др., J. Biol. Chem. т. 259, стр. 9121-9126 /1984/; Sternberg и др., J. Cell. Biol т. 101, стр. 880-886 /1985/; Berman и др., J. Clin. Invest т. 78, стр. 130-137 /1986//. Его также обнаружили в мегакариотах /Beckstead и др., Blood, т. 67, стр. 285-293 /1986// и в эндотелиальных клетках /Mc Ever и др., Blood т. 70, стр. 355а /1987// внутри тел Вейбела-Палада /Bonfanti и др., Blood, т. 73, стр. 1109-1112 /1989//. Фури и др. в Патенте США N 783330 описывают моноклональные антитела, активные относительно GPM-140. Все вышеупомянутые работы включены здесь в качестве ссылок.

Третьим рецептором селектина является "домашний" рецептор лимфоцитов, MEL-14-антиген или LAM-1 /Gallatin и др., Nature, т. 304, стр. 30-34 /1983/; Siegellman и др. , Science, т. 243, стр. 1165-1172 /1989/; Rosen Cell Biology, т. 1, стр. 913-919 /1989/; и Lasky и др., Cell, т. 56, стр. 1045-1055 /1989/; все эти работы включены здесь в качестве ссылок. В дополнение к лимфоцитам, "домашний" антиген MEL-14/LAM-1 видимо функционирует ранее при связывании нейтрофила с эндотелим.

Структура и функция рецепторов селектина была выяснена при помощи клонирования и экспрессии кДНК полной длины, кодирующей каждый из вышеупомянутых рецепторов /см. , например, Bevilacgua и др., Science, см. выше, (ELAM-1), Geng и др., см. выше (GMP-140), и Lasky и др., см. выше /MEL-14 антиген//. Внеклеточная порция селектинов может быть разделена на три сегмента на основе гомолоний с ранее описанными протеинами. N-концевая зона (примерно 120 аминокислот) связана с семейством протеинов лектина млекопитающего типа C, как это описано в Drickamer. J. Biol. Chem. т. 263, стр. 9557-9560, /1988/ /которая включена здесь в качестве ссылки/, которое включает рецептор IgE слабого сродства CD23. Далее следует полипептидный сегмент, который содержит последовательность, которая связана с протеинами, содержащими мотив фактора эпидермального роста (EGF). Наконец, после области EGF имеются один или несколько повторяющихся тандемом мотивов в примерно 60 аминокислот каждый, связанные с теми, что содержатся в семействе дополнительных регулирующих протеинов.

Так как рецепторы селектина содержат область, напоминающую лектин, специфичность этих молекул аналогичным образом основана на взаимодействиях протеина-углевода. Факты, приводимые здесь, указывают на то, что сиалилированная, фукозилированная N-ацетиллактозаминовая составляющая антигена Льюиса X, обозначенная здесь как SLX, является составляющей, узнаваемой зоной лектина рецептора селектина. В частности, анализ показывает узнавание этой составляющей как ELAM-1, так и GMP-140. Соединения настоящего изобретения содержат этот фукозилированный, сиалилированный N-ацетиллактозаминовый блок в различных конфигурациях.

Термин "селективное связывание", как он здесь используется, относится к специфическому узнаванию одной молекулой (в общем случае, именуемой рецептором) другой молекулы (именуемой в общем случае, лигандом) при помощи пространственной или полярной организации детерминантного сайта на второй молекуле. Селективное связывание между этими двумя молекулами имеет место там, где сродство является достаточно сильным. Связывающее сродство в общем случае представляется константой сродства (K_а) для равновесных концентраций ассоциированных и диссоциированных конфигураций, а именно, K_а = [R-L]/[R][L], где [R], [L] и [R-L] являются концентрациями в равновесном состоянии рецептора [R], лиганда [L] и комплекса рецептора-лиганда [R-L] соответственно.

Взаимодействия специфического связывания рецептора и молекул лиганда в общем случае включают обратимые нековалентные ассоциации, такие как электростатическое притяжение, силы Ван дер Ваальса и водородные связи. Смотри в общем случае, Stryer, Biochemistry /W.H. Freeman and Company, N.Y. 3rd. Ed. 1988/, которая включена здесь в качестве ссылки. Примеры взаимодействий селективного связывания включают узнавание антитело-антиген, узнавание фермент-субстрат и т.п.

Номенклатура, используемая для описания олигосахаридных составляющих в соответствии с настоящим изобретением, следует стандартной номенклатуре. Используются стандартные сокращения для отдельных моносахаридов. Например, 2-N-ацетилглюкозамин обозначается через GlcNAc, фукоза - через Fuc, галактоза - через Gal и глюкоза - через Glc. Двумя сиаловыми кислотами, которые могут содержаться на олигосахаридах, являющихся предметом настоящего изобретения, являются 5-N-ацетилнейраминовая кислота (NeuAc) и 5-N-гликолилнейраминовая кислота (NeuGc). Если не указано противное, все сахара, за исключением фукозы (L-изомера) являются D-изомерами в циклической конфигурации (например, пираноза или фураноза). Два аномера циклических форм представляются и .

Моносахариды в общем случае соединены гликозидными связями с образованием олиго- и полисахаридов. Ориентация связи относительно пласкости колец указывается при помощи и . Отмечаются также определенные атомы углерода, которые образуют связь между этими двумя моносахаридами. Так -гликозидная связь между C-1 галактозы и C-4 глюкозы представляется при помощи Gal 1,4 Glc. Для D-сахаров (например, D-GlcNAc, D-Gal и D-NeuAc) обозначение обозначает гидроксил, присоединенный к C-1 (C-2 в NeuAc) ниже пласкости кольца, а -выше кольца. В случае L-фукозы обозначение означает гидроксил, расположенный выше кольца, а означает, что он ниже.

После того, как SLX идентифицирован как углеводный лиганд, который является "посредником" в адгезии лейкоцит-эндотелий и лейкоцит-клетка тромбоцита, соединения, содержащие SLX и близкие структуры, могут быть очищены или синтезированы de novo. Как подробно описано ниже, в соответствии с настоящим изобретением предлагается семейство соединений, содержащих связывающие селектин составляющие, являющиеся предметом настоящего изобретения. Например, биомолекулы можно использовать в качестве несущего эту составляющую соединения. Биомолекулы, как этот термин здесь используется, включают, но ими не исчерпывается полный список биологически значимых молекул, такие как аминокислоты (и их заменители), олигопептиды, протеины (например, гликопротеины и протеиновые гормоны, жирные кислоты), липиды (например, гликолипиды, фосфолипиды, сфинголипиды и ганглиозиды), стероидные гормоны, олигосахариды, полисахариды и нуклеиновые кислоты (например, деоксирибонуклеиновые кислоты и рибонуклеиновые кислоты). Эти соединения могут быть очищены и/или синтезированы в соответствии со стандартными приемами, известными каждому специалисту в этой области техники. Кроме того, самые разнообразные соединения, несущие эту составляющую, можно синтезировать de novo, как это описано ниже.

После того, как получены, такие соединения можно использовать для различных целей, включая, например, конкурирующее ингибирование связывания SLX-несущих клеток с клетками, которые экспрессируют рецепторы селектина. При помощи связывания соединений, являющихся предметом настоящего изобретения, с клеточным поверхностным селективном будет предотвращаться взаимодействие селектина с нативным SLX-лигандом на мигрирующих клетках, которое препятствует нормальному и патологическому связыванию лейкоцитов и других клеток с эндотелием или тромбоцитами. Таким образом, соединения, которые содержат одну или несколько связывающих селектин составляющих, могут служить в качестве эффективных ингибиторов, например, воспаления, атеросклероза, образования сгустков и других патологий с участием эндотелия или тромбоцитов.

Остаток сиаловой кислоты в SLX может находится в различных формах, лишь бы связывание селектина существенно не нарушалось. В общем случае, сиаловая кислота является 5-N-ацетилнейраминовой кислотой (NeuAc) или 5-N-ацетилнейраминовой кислотой (NeuGc), Однако при осуществлении настоящего изобретения можно использовать другие сиаловые кислоты. По поводу обзора различных форм сиаловой кислоты, пригодных для использования в соответствии с настоящим изобретением см. в общем случае, R. Schauer, Methods in Enzymology, т. 50, стр. 64-89 /1987/ и Schaur, Advances in Carbohydrate Chem. Biochem, т. 40, стр. 131-234; обе эти работы здесь включены в качестве ссылки. Как подтверждается в Примере IX ниже, сродство для рецепторов селектина является одним и тем же, если олигосахарид заканчивается в NeuAc или NeuGc. Таким образом, термин "SLX", как он здесь используется, относится к минимальному тетрасахаридному блоку (сиаловая кислота 1,3 Gal 1,4 [Fuc 1,3] GlcNAc 1,3), в которой сиаловой кислотой является NeuAc, NeuGc или другие эквивалентные формы сиаловой кислоты. Структуры, представленные здесь, которые имеют остаток сиаловой кислоты в виде NeuAc, следует понимать, как включающие и другие формы, в частности, NeuGc.

Анализ, представленный ниже, показывает, что пентасахарид, содержащий формулу NeuAc2, 3 Gal 1, 4[Fuc 1,3] GlcNAc 1,3 Gal , является минимальной структурой, обладающей существенно большим ингибиторным действием, чем тетрасахарид. Таким образом, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления олигосахарид будет содержать эту пентасахаридную структуру.

Другие вариации на основе базисного SLX-блока также узнаются рецепторами селектина. Например, анализ, приведенный в Примере VIII ниже, показывает, что олигосахаридная составляющая, именуемая SY2 (известная также под названием антигена VIM-2), имеющая структуру Neu Gc 2, 3 Gal 1, 4 Glc NAc 1, 3 Gal 1, 4 (Fuc 1,3) Glc NAc 1, 3 Gal 1, 4 Glc связывает рецепторы селектина в той же степени, что и SLX. SY2-составляющая содержит два сиалилированных N-ацетиллактозаминовых блока, одним из которых является SLX. Таким образом, олигосахариды, узнаваемые рецепторами селектина, могут содержать несколько сиалилированных N-ацетиллактозамидовых блоков, по крайней мере один из которых фукозилирован /см., Teimeyer и др., Proc. Natl. Acad. Sci (USA), т. 88, стр. 1138-1142 /1991/, которая здесь включена в качестве ссылки.

Составляющая олигосахарида в соответствии с настоящим изобретением в предпочтительном варианте заканчивается остатком сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления остаток сиаловой кислоты может быть, кроме того, соединен с другими остатками сахаридов, такими как вторая сиаловая кислота в 2,8-связи.

В качестве альтернативы концевой остаток сиаловой кислоты может быть заменен самыми различными радикалами. Таким образом, некоторые составляющие, связывающие селектин, в соответствии с настоящим изобретением имеют общую формулу: R₁ - NeuAc 2,3 Gal 1,4 Glc NAc 1 , в которой R₁ является R₂R₃C/CO₂H/-, в которой R₂ и R₃, которые могут быть как одинаковыми, так и различными, являются H, низшим алкилом (C₁-C₈), гидроксил низшим алкилом (C₁-C₈), арилалкилом, алкоксиалкилом. Кроме того, R₂ и R₃ могут быть соединены, чтобы образовать 4-8 элементное карбоциклическое или гетероциклическое кольцо.

Соединения, содержащие SLX и близкие структуры, могут быть получены из клеточных поверхностных гликопротеинов или гликолипидов из нескольких типов клеток. Например, антиген SLX содержится на соединенных при помощи N углеводных группах клеточных поверхностных гликопротеинов клеток LEC11, мутанта гликозилирования CHO-клеток. LEC11 экспрессируют этот уникальный гликопептид, который содержит концевую структуру, несущую как сиаловую кислоту, так и фукозу в последовательности SLX в которой R является: /Смотри, Stanley и др., J. Biol. Chem, т. 263, стр. 11374 /1988/, которая включена в качестве ссылки/.

Используя процедуру, описанную ниже, было показано, что мутант LEC11связывается с активированными эндотелиальными клетками сосудов человека. Ни CHO-клетки дикого типа, ни другие близкие линии мутантных CHO-клеток гликозилирования без специальной структуры гликозилирования /SLX/ не демонстрировали такого же уровня связывания.

Другие источники, которые можно использовать для получения SLX-блока, включают любую клетку, которая естественно экспрессирует эту составляющую на углеводных группах гликолипидов или гликопротеинов. Так, полиморфоядерные нейтрофилы, лимфоциты, клетка опухоли или клетки HL-60 использовали для того, чтобы очистить этот блок. Другие клетки, которые связываются с активированным эндотелием сосудов, можно также использовать для того, чтобы выделить лиганд /см. , Symington и др. , J. Jmmunol, т. 134, стр. 2498-2506 /1985/, Mizoguchi и др. , J. Biol Chem., т. 259, стр. 11949-11957 /1984/, Mizoguchi и др., J. Biol Chem., т. 259, стр. 11943-11948 /1984/, Paietta и др. , Cancer Res. т. 48, стр. 28-287 /1988/, которые включены здесь в качестве ссылки/.

Соединения, содержащие SLX или его аналоги, могут быть получены из натуральных источников, используя хорошо известные в этой области техники приемы изоляции поверхностных гликопропиенов, гликопептидов, олигосахаридов и гликолипидов из клеток /Смотри, например, Gerard, "Purification of glycoproteins" и Thomas и др. "Purification of membrane proteins", обе работы в книге Guide to Protein Purification, том 182, Methods in Enzimology /ред. Deutscher, 1990/, которые включены здесь в качестве ссылки/. Например, клетки LEC11 можно использовать для того, чтобы получить гликопротеин или гликолипид, который содержит SLX-блок, используя, например, прием, описанный у Stanley и др., см. выше. Если коротко, то LEC-11 клетки инфицируют вирусом стоматита сосудов. Затем структурные углеводные изменения, вызванные в LEC11, приводят в экспрессии на N-связанных, снабженных двумя "усами", углеводах гликопротеина G этого вируса. Вирус очищают равновесным градиентным центрифугированием, а гликопептиды очищают с использованием переваривания протеиназой, как этой описано у Stanley и др.

Для того чтобы выделить связывающую селектин составляющую из HL-60, HT-29, colo 205, нейтрофилов и линий других клеток, которые содержат лиганд, узнаваемый селектинами, используют несколько подходов. Так как лиганд в общем случае экспрессируется на поверхности клеток этих типов, один из подходов заключается в изоляции фракции мембран плазмы, обогащенной этим лигандом. После того, как мембраны плазмы изолированы, лиганды могут быть выделены, а затем идентифицированы с использованием моноклональных антител, в частности, тех, что являются химически активными относительно SLX-олихосахарида и близких структур, таких как моноклональные антитела FH6, SNH3 и CSLEX-1.

Чтобы охарактеризовать лиганд селектина на гликопротеине, высвобождение олигосахарида является в общем случае первым шагом в структурном анализе цепи олигосахарида. Этот добиваются при помощи химического расщепления протеин-углеводной связи или при помощи специфического высвобождения олигосахарида эндогликозидазой. В большинстве случаев, различные процедуры можно использовать для того, чтобы установить "правильные" условия для каждого отдельного гликопротеина. Связанные аспарагином олигосахариды высвобождают при помощи гидразинолиза, эндогликозидаз, интенсивного щелочного гидролиза и трифторацетолиза. O-связанные углеводные блоки высвобождают при помощи щелочного -исключения. Олигосахариды отделяют от гликопептидов при помощи гелевой фильтрации. Полученные в результате олигосахариды затем отделяют друг от друга, используя комбинацию гелевой фильтрации, ВЭЖХ, тонкослойной хроматографии и ионообменной хроматографии. Изолированные олигосахариды затем целиком анализируют. Полный структурный анализ очищенных олигосахаридных блоков требует определения моносахаридных блоков, их кольцевой формы, конфигурации /D или L/, аномерной связи / или /, позиций связей между сахарами и их последовательности. Кроме того, устанавливают позицию всех групп-заместителей. Для того чтобы определить позиции гликозидных связей между моносахаридами, используют анализ на основе метилирования. Аномерная конфигурация остатков сахаров может быть определена с использованием 500-МГц ¹H-ЯМР-спектроскопии. Условия и приемы, используемые для осуществления полного структурного углеводного анализа, описаны в общем случае в книге: Beeley, Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecycar Biology, ред. Burdon и Knippenberg, Elsevier, Amsterdam /1985/, которая включена здесь в качестве ссылки.

Современные приемы для осуществления полной характеризации сахаров олигосахарида включают использование нескольких аналитических процедур, таких как FAB-MS /масс-спектроскопия при бомбардировке быстрыми атомами/, HPAE /хроматография анионного обмена при высоких pH/ и ¹H-ЯМР. Эти приемы являются /взаимно/ дополнительными. Последние примеры того, как эти приемы используют для полной характеризации структуры олигосахарида, можно найти в анализе по Спеллмэну и др. , J. Biol. Chem., т. 264, стр. 14100 /1989/ и Стенли и др. , см. выше. Другие приемы включают масс-спектроскопию бомбардировки быстрыми атомами положительных ионов /FAB-MS/ и анализ метилирования при помощи газовой хроматографии-масс-спектроскопии соударения электронов /GC/EI-MS/ /см., Патентная заявка EPO N 893055153.2, которая здесь включена в качестве ссылки/.

Один и подходов в характеризации лиганда селектина на гликолипидах состоит в разрушении клеток, используя органические растворители, выделении гликолипидов и идентификации гликолипидов, активных относительно моноклональных антител к SLX, таких, например, как FH6, SNH3, SNH4, CSLEX-I или УТМ-2, и последующем определении структуры цепей олигосахаридов. Чтобы получить гликолипиды и ганглиозиды, которые содержат SLX, можно использовать стандартные приемы для получения гликолипидов /смотри, например, Ledeen и др., J. Neurochem т. 21, стр. 829 /1973/, которая здесь включена в качестве ссылки/. Например, гликолипиды экстрагируют из HL-60, HT-29, PMN, человеческих лейкоцитов и других линий клеток, экспрессирующих лиганд селектина при помощи приемов, в общем случае, известных каждому специалисту в этой области техники /см., например, Symington и др., J. Jmmunol. т. 134, стр. 2498 /1985/ и Macher и Beckstead, Leukemia Res, т. 14, стр. 119-130 /1990/, которые здесь включены в качестве ссылки/. Клетки выращивают в суспензии и собирают центрифугированием. Гликолипиды экстрагируют из таблетки клеток при помощи хлороформа/метанола 2: 1 и изопропилового спирта/гексана/воды 55:25:20, как это описано в Kannagi и др., J. Biol. Chem. т. 257, стр. 14865 /1982/, которая здесь включена в качестве ссылки. Полученные в результате экстракты разделяют при помощи хлороформа/метанола/воды /3:2:1/, разделение Фолха. Полученная в результате верхняя фаза экстрагирования содержит ганглиозиды, а нижняя фаза содержит гликолипиды.

Верхнюю фазу, содержащую ганглиозиды /гликосфинголипиды, которые содержат по крайней мере одну составляющую сиаловой кислоты, выделяют и отделяют в нейтральных и кислых фракциях, используя хроматографию на ДЭАЭ-Сефадексе, как это описано подробно у Ledeen и Yu, Methods Enzymol, т. 83, стр. 139 /1982/, которая здесь включена в качестве ссылки. Полученные в результате ганглиозиды собирали, подвергали лиофилизации и растворяли в хлороформе/метаноле /2: 1/. Нижняя фаза разделения Фолха содержит гликолипиды. Они разделяются и изолируются при помощи препаративной тонкослойной хроматографии, используя хлороформ/метанол/воду /60:35:8/ в качестве системы растворителей, как это описано Саймингтоном.

Чтобы идентифицировать эти ганглиозиды и гликолипиды, которые содержат лиганд селектина, осуществляли иммунохимический анализ гликолипидов в соответствии с процедурой, предложенной Magnani и др., Anal. Biochem. т. 109, стр. 399 /1980/, которая включена здесь в качестве ссылки. Если коротко, то порцию ганглиозида, описанную выше, подвергали хроматографии на тонкослойной хроматографии. Тонкослойную пластинку затем инкубировали с меченным ¹²⁵I CSLEX-I или другим моноклональным антителом, которое связывается специфически с SLX или близкими структурами. После инкубирования с меченым антителом пластинку экспонировали на радиографическую пленку и проявляли. Черные точки на рентгеновской пленке соответствуют ганглиозидам, которые связываются с моноклональным антителом, и эти ганглиозиды извлекали при помощи соскабливания соответствующих областей с пластинки из окиси кремния и элюирования ганглиозидов смесью хлороформ/метанол/вода. Гликолипиды также сушат и снова суспендируют в хлороформе и проявляются в аналогичной тонкослойной системе, и зондируют радиомеченным антителом. Структурный анализ олигосахаридов, полученных из гликолипидов, осуществляли по существу, как это описано для гликопротеинов.

Олигосахариды, содержащие SLX-блок, могут быть получены из гликопротеинов с использованием приемов, известных в этой области техники /см., например. Gerard, выш