Способ коррекции метаболизма в тканях при гипоксии

Способ коррекции метаболизма в тканях при гипоксии

Реферат

 

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в реаниматологии для восстановления метаболизма в миокарде при гипоксии, в частности в состояниях клинической смерти. Способ приводит к снижению травматичности и дороговизны при осуществлении коррекции метаболизма в организме, в частности на тканевом уровне в миокарде при гипоксии. Это достигается тем, что индукцию свободнорадикального окисления проводят введением в ткани и биологической дисперсной системы-стандартного раствора Кребса-Хензейляйта, который обрабатывают озонокислородной смесью с концентрацией озона 50 мкг/л газовой фазы в течение 5 мин с последующей аэрацией его газовой смесью, содержащей 95% кислорода и 5% углекислого газа, в течение 10 мин. 1 ил. 4 табл.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в реаниматологии для восстановления метаболизма в миокарде при гипоксии, в частности, в состояниях клинической смерти.

Известен способ коррекции метаболизма в тканях путем доставки кислорода к тканям посредством гипербарической оксигенации [1].

Однако для осуществления способа требуется дорогостоящая аппаратура с изоляцией больного, что делает невозможным осуществление контроля за его состоянием и своевременную коррекцию этого состояния.

В последнее время для коррекции гипоксических состояний применяют озонотерапию. Изучены детоксикационные свойства озона, его способность насыщать организм кислородом, влиять на метаболизм через усиление кислородзависимых реакций [2].

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к изобретению является способ активации систем антиоксидантной защиты организма путем физиологической индукции свободнорадикального окисления озонированной биологической дисперсной системой.

В качестве биологической дисперсной системы в известном способе используют кровь, подвергнутую озонированию озонокислородной смесью с концентрацией озона 18-105 мкг/л. При этом проводят экстракорпоральное озонирование 1000 мл крови в оксигенаторе, включенном в артериовенозный шунт с одновременной обработкой по 100 мл крови в течение 5 мин. Воздействие озона по принципу обратной связи включает формирование естественного более высокого фона антиоксидантной защиты как в крови, так и на тканевом уровне, в частности, увеличивается активность СОД и каталазы в миокарде в конце как острого, так и хронического экспериментов через месяц после озонирования крови.

Однако способ по прототипу отличается достаточно высокой травматичностью и дороговизной, так как для его осуществления требуется забор крови у больного, либо использование донорской крови.

Поэтому задачей изобретения является снижение травматичности и дороговизны при осуществлении коррекции метаболизма в организме, в частности, на тканевом уровне в миокарде при гипоксии.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе коррекции метаболизма в тканях при гипоксии, включающем физиологическую индукцию свободно радикального окисления посредством введения озонированной биологической дисперсной системы, в соответствии с изобретением, в качестве биологической дисперсной системы используют стандартный раствор Кребса-Хензеляйта, который обрабатывают озонокислородной смесью с концентрацией озона 50 мкг/л газовой фазы в течение 5 мин с последующей аэрацией его газовой смесью, содержащей 95% кислорода и 5% углекислого газа, в течение 10 мин.

Использование вместо озонированной крови озонированного раствора Кребса-Хензеляйта, подвергшегося дополнительному аэрированию газовой смесью, состоящей из кислорода и углекислого газа, позволяет снизить травматичность и удешевить способ.

Оптимальная концентрация озона в газовой смеси и время озонирования подобраны опытным путем в экспериментах in vivo и in vitro.

В источникам патентной и научно-технической информации не выявлены сведения о коррекции метаболизма в тканях организма путем воздействия на ткань раствора Кребса-Хензеляйта, озонированного озоно-кислородной смесью с концентрацией озона 50 мкг/л газовой фазы в течение 5 мин с последующей аэрацией раствора Кребса-Хензеляйта газовой смесью, содержащей 95% кислорода и 5% углекислого газа, в течение 10 мин. Поэтому предлагаемое техническое решение является новым и соответствует критерию патентоспособности "изобретательский уровень".

Способ в соответствии с изобретением проводили на модели клинической смерти в эксперименте на белых нелинейных крысах массой 180 - 200 г, наркотизированных нембуталом (25 мг/кг). У животных клиническую смерть вызывали острой кровопотерей путем перерезки сонной артерии. Через 5 мин после прекращения сердечных сокращений и остановки дыхания проводили торакотомию и извлекали сердце. Восстановление сердечной деятельности проводили на модели перфузии изолированного органа по Лангендорфу-Фалену с использованием стандартного раствора Кребса-Хензеляйта, аэрированного газовой смесью: 95% кислорода и 5% углекислого газа, при значениях pH в диапазоне 7,3-7,4. В течение первых 7 мин температура раствора поддерживалась на уровне 32 град. с последующим нагреванием до 37 град. Время перфуэии 60 мин. В полость левого желудочка вводили баллончик с постоянным объемом, давление в его полости регистрировали при помощи механотрона 6МДх11С.

Первую серию составили сердца интактных животных, служившие контролем (п= 15). Во вторую включены сердца, изолированные на 5 минуте клинической смерти (п= 15). В третьей серии - перфузию сердца в течение 60 мин осуществляли оксигенированным раствором Кребса-Хензеляйта (п=15). В четвертой серии - изолированные сердца крыс перфузировали озонированным раствором (п= 15). Для этого через раствор пропускали озон с концентрацией 50 мкг/л газовой смеси, начиная с 5 минуты перфузии в течение 5 мин. Всего проведено 4 сеанса озонирования. Каждый сеанс чередовался с перфузией в течение 10 мин раствором, аэрированным газовой смесью, содержащей 95% кислорода и 5% углекислого газа.

Озон получали с помощью генератора озона при пропускании тока барьерного разряда через медицинский кислород. Контроль концентрации осуществляли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 254 нм.

В конце эксперимента сердце замораживали в жидком азоте и растирали в фарфоровой ступке. В гомогенате из ткани миокарда проводили биохимический анализ субстратов углеводного обмена, уровня макроэргических соединений, активности АТФ-аз, интенсивности процессов перекисного окисления липидов и активности общей антиоксидантной системы защиты.

Концентрацию глюкозы определяли глюкозооксидантным методом с использованием биотеста "Лахема", концентрацию лактата и пирувата - лактатдегидрогеназным методом с использованием наборов Bochringer Mannheim Test - Combination (W. Germani): определение адениловых нуклеотидов осуществляли методом Ивановой Г.Н. и Рубель Л.Н. (1969); креатинфосфата (КФ) - по методу Ennor A. (1952). Для определения продуктов перекисного окисления липидов предварительно проводили экстракцию липидов по Folch (1957). В липидном экстракте диеновые конъюгаты (ДК) определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм (Shenstone F.S., 1971), содержание оснований Шиффа (ОШ) определяли на флуориметре АСО-1 (Fletcher В.,1973), концентрацию общих липидов (ОЛ) - с помощью наборов биотеста "Лакема", содержание малонового диальдегида (МДА) определяли по методу Smith I. (1976). Общую антиоксидантную активность измеряли методом индуцированной хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-06 (Кузьмина Е.И.,1983), активность фермента супероксиддисмутазы (СОД) оценивали методом Nishikimi N. (1972). Общую Ca⁺⁺-АТФ-азную активность, включающую фермент цитоплазматической мембраны митохондрий и саркоплазматического ретикулума определяли в цельном гомогенате из ткани миокарда (Козлов Ю.П. с соавт., 1978). Активность Na⁺-Ka⁺-АТФ-азы анализировали в цитоплазматической фракции: протонной H⁺-АТФ-азы - в митохондриях (Мешалкин Е.Н. с соавт., 1981; Имеидзе Э.А. с соавт., 1978). Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики. (Табл. 1).

Результаты исследования. Клиническая смерть животного наступала при развитии циркуляторно-гемической гипоксии на фоне геморрагического шока и гиповолемии через 20 мин после перерезки сонной артерии (15 мин кровопускание, 5 мин остановки сердца, прекращения дыхания и кровообращения). При этом в ткани миокарда отмечалось типичное для тяжелой гипоксии накопление недоокисленных продуктов углеводного обмена (содержание глюкозы повысилось по сравнению с контрольным в 4,9 раза, пирувата - в 1,3 раза, лактата в 2,5 раза). Прекращение аэробных процессов уже через 5 мин клинической смерти характеризовалось разобщением тканевого дыхания и процессов окислительного фосфорилирования и привело к нарушению энергетического состояния: падению уровней макроэргов аденозинтрифосфата (АТФ) на 28%, аденозиндифосфата (АДФ) на 15%, аденозинмонофосфата (АМФ) на 19%; содержание КФ снизилось на 77,7%. Вследствие этого почти в 2 раза снизилась активность транспортных АТФ-аз, активность Н⁺АТФ-азы уменьшилась на 45%. Наблюдалось повышение в 7,7 раза максимальной интенсивности хемилюминесценции (I_max и в 6 раз светосуммы хемилюминесценции (S) за 60 с, I_max отражает потенциальную способность биологического объекта к перекисному окислению липидов (ПОЛ), а величина S находится в обратной зависимости от мощности общей антиоксидантной системы защиты. Активность фермента СОД снизилась в 1,5 раза по сравнению с контролем. Содержание первичных молекулярных продуктов - ДК - не изменилось по сравнению с интактными животными, в то время как уровень вторичных продуктов - МДА - вырос в 4 раза, а конечных - ОШ - в 1,4 раза. Снижение в 2 раза величины индекса ДК/ОШ по сравнению с контролем подтверждало сдвиг процесса ПОЛ в сторону образования вторичных и конечных молекулярных продуктов. (Табл. 2).

Перфузия в течение 60 мин сердец после клинической смерти восстанавливала сердечную деятельность как с использованием воздушно-кислородной смеси, так и с добавлением озона. На восстановление сердечных сокращений расходуется энергия АТФ. Достоверно уменьшалось (Р< 0,05) суммарное содержание адениловых нуклеотидов по сравнению с интактным сердцем и клинической смертью при использовании озона и воздушно-кислородной смеси. Перфузия озоном способствовала более быстрому восстановлению в постишемическом периоде уровня КФ, который к концу перфузии возрастал на 47% по сравнению с клинической смертью. При перфуэии воздушно-кислородной смесью содержание КФ оставалось на прежнем уровне. Это указывает на более быстрое и полное восстановление энергопродукции при озонировании.

Анализ состояния ПОЛ миокарда через 60 минут перфузии оксигенированным раствором выявил достоверное повышение активности СОД по сравнению с периодом клинической смерти. О росте общей антиоксидантной активности свидетельствовало уменьшение в 2 раза S хемилюминесценции гомогената ткани. I_max снизилась в 1,2 раза, уровень ДК существенно не изменился. Количественные соотношения вторичных и конечных молекулярных продуктов продемонстрировали временные зависимости между ними, а именно, что при снижении уровней МДА в 2 раза, во столько же увеличилось количество ОШ.

Использование озонированного раствора способствовало более выраженному повышению антиоксидантной активности. Это проявилось в достоверном снижении S ХЛ в 3 раза) и приросте активности СОД (в 2,5 раза) по сравнению с клинической смертью. Следствием этого явилось падение I_max ХЛ по сравнению со стадией клинической смерти в 2 раза. При этом почти в 8 раз упало содержание ДК, в 3 раза - МДА без количественного прироста ОШ. Индекс ДК/ОШ снизился в 4 раза по сравнению с оксигенацией и указывал на выраженное снижение интенсивности процессов ПОЛ при озонировании. (Табл. 2) Уровни субстратов углеводного обмена достоверно снижались как при перфузии воздушно-кислородной смесью, так и при озонировании. Это свидетельствует об усилении катаболических кислородзависимых реакций. Дополнительным подтверждением явилось восстановление активности H₊-АТФ-аэы, особенно выраженное при озонировании (105% от исходного уровня). Данный факт свидетельствует в пользу генерирования в мембранах митохондрий транспортного электрохимического потенциала и, отсюда, возможного образования АТФ и КФ. Активность транспортных АТФ-аз указывает на способность тканей миокарда проводить возбуждение (Na⁺-K⁺-АТФ-аза) и осуществлять сокращение (Ca⁺⁺-АТФ-аза). При использовании озона увеличение активности было более выражено, чем при оксигенации: на 49% для Ca⁺⁺-АТФ-аэы и на 58% для Na⁺-K⁺-АТФ-азы. При этом отмечены значимые коэффициенты корреляции между величиной ОШ и Ca⁺⁺- АТФ-азой (- 0,74); и ОШ и активностью Na⁺-K⁺-АТФ-азой (- 0,81). Значения этих коэффициентов были выше, чем соответствующие с уровнем АТФ (0,65 - для Ca⁺⁺-АТФ-азы и 0,68 - для Na⁺-K⁺-АТФ-азы). Отсюда, активность транспортных АТФ-аз оказалась в большей зависимости от состояния процесса ПОЛ, определяющего фосфолипидное окружение мембрановстроенных интегральных белков этих транспортных помп. (Табл. 3 и фиг. 1).

Вследствие этих изменений отмечались различия в функциональном состоянии мышц сердца после восстановления в двух сравниваемых сериях (3 и 4). Значение развиваемого давления и максимальная скорость сердечного сокращения через 60 мин перфузии озоном были на 46% и 54% соответственно выше, чем после перфузии воздушно-кислородной смесью. Установлены достоверно значимые коэффициенты корреляции не только между уровнем КФ и максимальной скоростью сокращения (-0,876), но и непосредственно с показателями ПОЛ. При этом уровень ДК имел отрицательную корреляцию с максимальной скоростью сокращения dp/dt), но положительную с частотой сердечных сокращений (ЧСС). Чем выше уровень ДК в мембране, тем выше их гидрофильностъ, тем меньше максимальная скорость сокращения, но больше ЧСС. Между уровнем МДА и dp/dt, напротив, выявлена прямая корреляционная зависимость (0,723). (Табл. 4).

Представленные результаты свидетельствуют о существенных различиях во влиянии на метаболизм в ткани миокарда оксигенированного и озонированного перфузионного растворов.

Конкретный пример эксперимента. Крыса-самец массой 210 г. Внутрибрюшинно вводится нембуталовый наркоз (25 мкг/кг). Перерезается сонная артерия, 15 мин осуществляется кровопускание. Затем наступает остановка сердца и прекращение дыхания. Через 5 мин производится торакотомия и извлекается сердце, которое тут же фиксируется к канюле перфузионной установки. Перфузируется оксигенированным раствором Кребса-Хензеляйта при температуре первых 7 мин 32 град. с последующим нагреванием раствора до 37 град. В полость левого желудочка введен латексный баллончик. Через механотрон 6МДх11С на самописце регистрируются показатели сократительной функции миокарда. Начиная с 5 минуты перфузии через раствор пропускали озон с концентрацией 50 мкг/л газовой фазы в течение 5 мин. Таких сеансов за 60 мин было проведено четыре. Между сеансами в течение 10 мин - перфузия оксигенированным раствором Кребса-Хензеляйта. В конце эксперимента в гомогенате из ткани миокарда проводили биохимический анализ.

Получены следующие данные: МДА - 2,62 опт.пл./мг ОЛ; ДК - 1,91 опт.пл./мг ОЛ; ОШ - 309,5 отн.ед./мг ОЛ; Активность СОД - 6,02 усл.ед./мг белкамин; I_maxХЛ - 910,3 импс/мг ОЛ; S ХЛ - 3975,1 импс/мг ОЛ; АТФ - 2,105 мкмоль/г; КФ - 1,21 мкмоль/г; Активность H⁺-АТФ-азы - 5,94 мкмоль Рн/мг белка; Глюкоза - 0,692 ммоль/г; Пируват - 0,0318 ммоль/г; Лактат - 8,53 ммоль/г; Показатели сократительной функции миокарда: ЧСС - 210 уд/мин; Развиваемое давление - 115 мм рт.ст.; Конечное диастолическое давление - 5,4 мм рт.ст.; Максимальная скорость сокращения - 2062 мм рт.ст.; Максимальная скорость расслабления - 1688 мм рт.ст.

Данный пример свидетельствует о том, что использование озонированного перфузионного раствора приводит к снижению интенсивности процессов ПОЛ за счет повышения уровня антиоксидантной защиты и, как следствие этого, возрастанию скорости кислородзависимых реакций, что подтверждается достаточно полным восстановлением сократительной функции миокарда.

Вывод. Использование озонированного раствора Кребса-Хензеляйта позволяет исключить забор крови у больного и является более экономичным, так как не требует закупки донорской крови.

Источники информации 1. Ефуни С.Н. - Руководство по гипербарической оксигенации.- М.: Медицина, 1986, 416 с.

2. Конторщикова К.Н. Перекисное окисление липидов при коррекции гипоксических нарушений физико-химическими факторами. Дисс.канд., С.-Пб.: 1992.

Формула изобретения

Способ коррекции метаболизма в тканях при гипоксии, включающий физиологическую индукцию свободнорадикального окисления посредством введения озонированной биологической дисперсной системы, отличающийся тем, что в качестве биологической дисперсной системы используют раствор Кребса - Хензеляйта, который обрабатывают озонокислородной смесью с концентрацией озона 50 мкг/л газовой фазы в течение 5 мин с последующей аэрацией его смесью, содержащей 95% кислорода и 5% углекислого газа, в течение 10 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4