Синтетический поли-iga-комплекс, белок, способ получения комплекса, способ тестирования, способ защиты

Синтетический поли-iga-комплекс, белок, способ получения комплекса, способ тестирования, способ защиты

Реферат

 

Комплекс моноклональных поли-IgА предназначен для защиты млекопитающих от патогенных микроорганизмов и беременности. Комплекс моноклональных поли-IgА специфичен в отношении патогенных микроорганизмов, аллергенов или сперматозоидов. Комплекс содержит рекомбинатный стабилизаторный белок. Указанный белок включает область I и по крайней мере области IV и V поли-IgА -рецептора и не содержит области VI поли-IgА-рецептора. При этом область I отстоит от области IV и V на расстояние, составляющее около 100-500 аминокислот. Комплекс характеризуется протеолитической стабильностью по сравнению с несвязанными поли-IgА и наличием иммунозащитных и перекрестно-связывающих свойств поли-IgА. Предложен также способ получения комплекса, способ тестирования моноклональных поли-IgА и способ защиты млекопитающих с использованием данного комплекса. Изобретение обеспечивает возможность проведения особенно эффективной и безопасной пассивной иммунизации. 5 с. и 5 з.п. ф-лы. 13 ил.

Настоящее изобретение выполнено при частичном финансировании Правительства США, и Правительство США обладает некоторыми правами на это изобретение.

Настоящее изобретение касается общих вопросов, связанных с пассивной слизистой иммунной защитой и поли-Ig-иммунными реактивами и способами. Здесь термин "поли-Ig" распространяется на полимерные классы антител, т.е. на IgA и IgM-антитела. Антитела класса IgM обычно продуцируются на ранней стадии иммунной реакции и не представляет собой важный фактор в защитном слизистом иммунитете. Таким образом, изобретение в целом относится к полимерным Ig-антителам, и в отношении всех аспектов настоящего изобретения обычными и предпочтительными антителами являются антитела класса IgA, которые обычно выделяются в димерной форме и, в меньшей степени, в форме высших Iga-полимеров.

Многие патогенные бактерии и вирусы первоначально получают доступ в организм, проникая через клеточные выстелки /эпителиальные ткани/ желудочно-кишечного, дыхательного или полового трактов. Специализированный класс антител - IgA-антитела - защищают эти поверхности. Антитела IgA-представляют собой димерные или полимерные молекулы, продуцируемые клетками, расположенными в тканях, находящихся под эпителиальными поверхностями. Они транспортируются эпителиальными клетками в слизистые выделения, где они прошивают или покрывают патогенные микроорганизмы, которые еще не попали в организм, препятствуя патогенным микроорганизмам контактировать и прилипать к эпителиальным клеткам. Таким образом, IgA-антитела оказывают воздействие на патогенные микроорганизмы, которые находятся вне организма, и они осуществляют защиту, препятствуя вхождению в организм через эпителиальные поверхности.

Протекающая в естественных условиях IgA-реакция запускается антигеном, попадающим на слизистые поверхности. Антиген поступает в организм через специфические заборные участки /называемые микроскладкой, или M-клетками/, являющиеся эффективными в отношении трансэпителиального переноса антигена в области слизистой выстелки, содержащей специализированные упорядоченные совокупности клеток слизистой иммунной системы. Говоря точнее, как это показано на фиг. 1, антигены A /показанные в виде зачерненных точек/, находящиеся в полости 1, связывают полостную поверхность из M-клеток в месте 2. Антигены попадают внутрь и проникают в клетку в месте 3, освобождаясь в интераэпителиальном кармане 4, содержащем лимфоидные L-клетки /B- и T-клетки/ и клетки по выявлению и обработке антигенов, такие как макрофаговые клетки /M-клетки/.

Антитела класса IgA, присутствующие у хозяина, иммунизированного естественным образом, транспортируются в выделения посредством связывания со специфическим рецептором /называемым поли-Ig-рецептором/ на базальных /внутренних/ поверхностях из эпителиальных и гландулярных клеток в пределах дыхательной и пищеварительной систем, полового тракта и молочных желез. См. литературу Solara, Kraehenbuhl, "Receptor-Mediated Transepitheli al Transport of Polymeric Immunoglobulins, c.c. 269-298, в книге The Mammary Gland Nelville, Daniel, редакторы, изд-во "Пленум паблишинг", г. Кеймбридж /1987/; Mestecky /1987/, I. Clin, Immunol. , 7:265-276. Комплексы из рецептора и IgA-антитела транспортируются через эти клетки и подвергаются экзоцитозу, попадая на полостные /внешние/ клеточные поверхности, на которых рецептор ферментативно отщепляется, высвобождая IgA-антитело, поступающее в выделения вместе с рецепторным фрагментом, называемым секреторным компонентом /SC/. См. литературу: Mostov et Al. /1980/, Proc. Nat'I Acad Sci US. A., 77: 7257-7261; Solari, R., Kraehenbuhl, J.P., Cell. 36:61-71 /1984/; Kuhn, Kraehenbuhi, J. Biol, Chem., 256:12490-12495 /1981/. Сообщают, что секреторный компонент понижает протеолитический распад IgA-антетел. См. литературу: Lindh, I., I. Immunol., 114:284-286 /1975/; Brownet al., I. Clin Invest., 49: 1374 /1974/.

В общем существующие подходы к иммунизации, при которых рассматривается попадание антигенов, сводятся к продуцированию антител IgG-класса, которые циркулируют по всему организму и нейтрализуют патогенные микроорганизмы после попадания их в организм. Введение антигенов в общем случае не сопровождается возникновением существенной IgA-реакции.

Усилия, направленные на активизацию IgA-защиты на слизистых барьерных поверхностях, сводились к проведению оральной иммунизации либо с целью активной защиты иммунизированного млекопитающего, либо с целью пассивной защиты какого-то другого млекопитающего посредством использования слизистого выделения, взятого у уже иммунизированного млекопитающего. См. литературу: Glass et al., New End I. Med, 308:1389-1392 /1983/; Fubara et al., I. Immunol., 111/2/:395-403 /1973/. Были продуцированы моноклональные IgA-антитела и внесены непосредственно на слизистые поверхности дыхательной системы с целью защиты от проникновения патогенных микроорганизмов. См. литературу: Mazanec et al., I. Virol., 61:2624-2625 /1987/.

Раскрыты различные пути производства и стабилизации моноклональных поли-Ig-антител, дающие реактивы для пассивной слизистой иммунной защиты. Говоря точнее, такие реактивы представляют собой существенно изолированные комплексы, образованные между поли-Ig-антителами, являющимися специфическими для выбранного антигена или семейства антигенов, и стабилизаторным белком, включающим в себя по крайней мере одну поли-Ig-связывающую область поли-Ig-рецептора. Поли-Ig-стабилизатор существенно свободен от каких-либо C-концевых трансмембранных или интрацеллюлярных поли-Ig-рецепторных областей. Получающийся комплекс характеризуется наличием протеолитической стабильности в сравнении с незакомплексованными поли-Ig-антителами, и комплекс обладает специфическими связывающими и иммунозащитными прошивающими свойствами, присущими поли-Ig-антителам. В плане первого аспекта изобретения стабилизаторный белок представляет собой рекомбинантный белок. В плане второго аспекта изобретения поли-Ig-антитело представляет собой моноклональное антитело.

Как более подробно будет говориться ниже, одна из предпочтительных форм комплекса характеризуется наличием ковалентных /дисульфидных/ связей между поли-Ig-антителом и стабилизатором. Такие комплексы могут производиться клеткой, способной продуцировать требуемое поли-Ig-антитело, обладающее специфическими свойствами в отношении выбранного антигена или семейства антигенов, причем упомянутая клетка конструируется с учетом продуцирования поли-Ig-стабилизатора. Комплекс продуцируется культурой таких клеток и извлекается из нее.

Желательно, чтобы поли-Ig-антитело представлено собой моноклональное антитело класса IgA. Как это также более подробно рассматривается ниже, предпочтительный стабилизатор может быть охарактеризован посредством ссылки на области, существующие у встречающегося в естественных условиях поли-Ig-рецептора, и предпочтительный стабилизатор включает в себя область I и по крайней мере область IV или V, или же обе области, с областью VI, существенно усеченной /удаленной/. Область I предпочтительно простирается от области V, захватывая последовательность, состоящую примерно из 100-500 аминокислот.

Третий аспект изобретения сводится к рассмотрению рекомбинантного поли-Ig-стабилизатора, включающего в себя поли-Ig-связывающую область поли-Ig-рецептора и преимущественно не содержащего C-концевые трансмембранные и интрацеллюлярные поли-Ig-рецепторные области. К предпочтительным стабилизаторам относятся также стабилизаторы, которые были подвергнуты обсуждению выше при рассмотрении комплекса, отвечающего первым двум аспектам настоящего изобретения.

Четвертый аспект изобретения касается способов тестирования защитной способности поли-Ig-моноклональных антител in vivo посредством введения моноклональных поли-Ig-антител, подвергаемых тестированию, в систему циркуляции млекопитающего и посредством тестирования слизистых выделений млекопитающего на поли-Ig-антитела. Млекопитающее затем подвергают воздействию провокационной пробы с патогенным микроорганизмом /или сперматозоидами/, и определяют защитную способность в отношении патогенного микроорганизма или оплодотворения. Преимущественно моноклональное поли-Ig-антитело вводят в систему кровообращения млекопитающего посредством впрыскивания или вливания. Или же опухоль или опухоливая клетка /т.е. гибридома/ может быть введена подкожно в виде постоянного источника моноклональных поли-Ig-антител.

Пятый аспект изобретения касается способа приготовления описанного выше сульфгидрильного прошитого комплекса посредством использования фиксационно-зависимых эпителиальных клеток, сконструированных для продуцирования поли-Ig-рецептора, посредством культивирования таких эпителиальных клеток в условиях, допускающих образование монослоя клеток на пористой подложке, расположенной таким образом, что оказывается возможным отделение первой среды, находящейся на базальной стороне монослоя, от второй среды, находящейся на апикальной стороне монослоя. Моноклональное IgA-антитело вводят на базальную сторону монослоя, и комплекс образуется в клетке по мере транспортирования антитела по монослою. Комплекс извлекают из среды на апикальной стороне монослоя. Желательно, чтобы первая среда представляла собой питательную среду, пригодную для поддержания роста эпителиальных клеток. Желательно также, чтобы вторая среда была существенно свободной от белков, мешающих извлечению поли-Ig-комплекса. Моноклональные IgA-антитела могут быть введены в первую среду с совместно культивируемыми гибридомными клетками. Или же моноклональное IgA-антитело сначала получают в гибридомной культуре, затем отделяют от культуры и, наконец, вводят в первую среду.

Комплекс, отвечающий первому и второму аспектам изобретения, может быть введен непосредственно в слизистые поверхности млекопитающего с целью защиты от патогенного микроорганизма или от оплодотворения. Желательно, чтобы комплекс вводился орально, назально, вагинально, ректально, через глаз или в среднее ухо. Один предпочтительный способ введения первого млекопитающего, а затем к введению такого слизистого выделения второму млекопитающему. Например, молоко от первого млекопитающего, содержащее комплекс, может быть дано второму млекопитающему. Для генерации выделения поли-Ig-антитело /например, очищенное от гибридомной культуры/ вводят в систему кровообращения первого млекопитающего /например, посредством вливания или впрыскивания/, и молоко или другие слизистые выделения собирают у млекопитающего.

Изобретение обеспечивает возможность проведения особенно эффективной и безопасной пассивной иммунизации, поскольку не затрагивается весь организм. В соответствии с этим иммунологические реактивы животного происхождения /от млекопитающего, не являющегося человеком/ представляются более допустимыми для введения в систему слизистой иммунной защиты, чем для проведения иммунизации всего организма. Неонатальные инфекции, такие как некротический энтероколит и стрептококковые инфекции группы B, являются особенно важными мишенями, что обусловлено отсутствием естественного слизистого иммунитета в этом возрасте.

Шестой аспект изобретения сводится к генерации поли-Ig-продуцирующей гибридомы под воздействием провокационной пробы на млекопитающем с использованием антигена и к извлечению лимфоидных клеток из слизистой ткани млекопитающего, такой как пейровы бляшки, или иной слизистой ткани, богатой лимфоидными клетками. Хотя пейровы бляшки и являются предпочтительными, к другим приемлемым слизистым тканям, богатым лимфоидными клетками, относятся миндалины, аденоиды, аппендикс и ректальная лимфоидная ткань. Лимфоидная клетка сливается с миеломной клеткой. Антиген желательно вводить на слизистую поверхность млекопитающего.

Другие особенности и преимущества изобретения станут очевидными из следующего описания преимущественных вариантов такового.

На фиг. 1 изображено схематическое представление трансцитоза антигена через M-клетки.

На фиг. 2 изображено схематическое представление этапов образования полимерной IgA-продуцирующей гибридомы.

На фиг. 3 изображено схематическое представление способа оценки защитных характеристик полимерного IgA-антитела, продуцируемого гибридомой.

На фиг. 4 изображено схематическое представление структуры комплекса, возникающего между полимерным IgA-антителом и модифицированным поли-Ig-рецептором.

На фиг. 5 изображено схематическое представление областей, существующих у поли-Ig-рецептора.

На фиг. 6A и 6B изображены нуклеотидная последовательность у генетически закодированного поли-Ig-рецептора и выявленная аминокислотная последовательность.

На фиг. 7 изображено выведенная аминокислотная последовательность, установленная по клонированным кДНК двух кроликовых аллелей поли-Ig-рецептора.

На фиг. 8A-8C изображена кДНК, из которой выведена последовательность, показанная на фиг. 7.

На фиг. 9 изображено сопоставление аминокислотной последовательности области I у поли-Ig-рецепторных аллелей фиг. 7.

На фиг. 10 изображены компоненты различных векторов экспрессии.

На фиг. 11 изображено строение двух специфических векторов экспрессии pLK-нео 6.8 кб и pLM-нео 6.8 кб.

На фиг. 12 изображено введение клонированного поли-Ig-рецепторного гена в векторы, показанные на фиг. 11.

На фиг. 13 изображены различные места ограничения у поли-Ig-рецепторной кДНК.

Примеры.

1. Стабилизаторный белок и поли-Ig-комплекс Предпочтительный стабилизаторный белок получают из поли-Ig-рецептора, трансмембранной молекулы, посредством которой осуществляется перенос поли-Ig-рецептора. Поли-Ig-рецептор включает следующие области, показанные на фиг. 4 и 5: пять экстрацеллюлярных областей, трансмембранный стягивающий сегмент и C-концевой интрацеллюлярный хвост. При протеолитическом расщеплении рецептора получается свободный пятиобластной белковый "SC", или секреторный компонент. См. литературу: MoS-tov et al., Nature, 308:37-43 /1984/; Kuhnet al. , I. Biol. Chem., 258:6653-6659 /1993/. Между поли-Ig-рецептором и IgA-антителом образуются дисульфидные мостики, которые схематически показаны на фиг. 4.

Поли-Ig-рецептор обычно сохраняется неизменным по млекопитающим видам; и здесь под этот термин подпадают все такие рецепторы независимо от вида млекопитающего, например, мышь, крыса, кролик, морская свинка, свинья, овца, лошадь, корова или человек. Специалистам, работающим в этой области, ясно, что кроликовые поли-Ig-рецепторные последовательности, фигурирующие в этой заявке, могут быть использованы в стандартных гибридизационных клонирующих методиках для идентификации закодированных по кДНК поли-Ig-рецепторов, взятых у других млекопитающих.

Суммируя сказанное выше, можно утверждать, что стабилизаторная белковая часть комплекса может представлять собой рекомбинантный стабилизаторный белок, полученный по крайней мере двумя различными способами. Поли-Ig-рецептор может быть клонирован и выражен в клетке, которая обладает способностью экспортирования его и расщепления его с образованием рекомбинантного стабилизаторного белка. Или же поли-Ig-рецепторный ген может быть сконструирован различными способами /в частности, встраиванием стоп-кодона, как это описано ниже/ с образованием конструкции, которая прямо выражается в виде стабилизаторного белка.

Как отмечали выше, оба пути создания стабилизаторного белка начинаются с использования клонированного поли-Ig-рецепторного гена. Мостов /Moctov/ и др. приводят сведения /Nature, 308:37-43 /1984// о клонировании и последовательности у этого гена. Чертеж 6 взят из указанной статьи, и он более подробно объясняется ниже.

Еще один специфический способ клонирования гена приводится ниже. См. литературу: Schaerer et al., J. Cell. Biol., 110:987-998 /1990/. Цитоплазматическую РНК готовят из молочной железы дающих молоко новозеландских кроликов согласно Сьюарду /Suard и др. /Biochem. J., 201:81-90 /1982//, и поли-A и РНК очищают согласно Шиблеру /Schibler/ и др. /J. Mol. Biol., 142:93-116 /1980/. Поли-A+PHK с усиленной рецепторной трансляционной активностью, достигнутой фракционированием по размерам при линейном сахарозном градиенте в 5-20%, служила в качестве матрицы для синтеза кДНК. Первую кДНК-цепочку синтезировали согласно Вали /Wahli/ и др. /Dev. Biol., 67:371-383 /1978//, а вторую цепочку - согласно ДНК-полимеразному I-РНазному H-методу Гублера /Cubler, Gene, 25:263-269 /1983//. Двухцепочечную и dC-концевую кДНК фракционировали на 1%-ном низкоплавком агарозном геле, и кДНК /кислоты/ с размером в области от 1,5 до 7 кб элюировали и "отжигали" до концевой pBR322, как это описано у Пикока /Peacock/ и др. /Biochem. Biophys. Acta, 655:243-250 /1981//. Клетки DHI подвергали трансформации вместе с "отоженной" ДНК, используя общий метод Ханахэна /Hanahan/ и др. /J. Mol. Biol., 166:577-580 /1983//. Трансформированные бактерии подвергали лизису, и ДНК переносили на нитроцеллозные фильтры /Thomas, Methods Enzymol. , 100:255-266, 1983/ и подвергали испытанию, воздействуя двумя синтетическими олигонуклеотидами. Специфическими зондирующими веществами, использованными в этих испытаниях, были нуклеотиды 186-206 и 2421-2437, взятые из последовательности, которую привели в литературе Мостов /Mostov/ и др. /Nature, 308:37-43 /1984/ и которая была помечена Т4-полинуклеотидной киназой и P³²-АТФ, как это описано в Гофа /Gough, N/ и др. /Nature, 309:763-767 /1984//. Клоны кДНК, гибридирующиеся с обоими зондирующими веществами, далее характеризовали, проводя гибридную селективную трансляцию /Reizman et al. , EMBO J. 2:2161-2168, 1983/. Две образовавшиеся плазмиды представляли собой плазмиду PSC-1, которая соответствовала низкомолекулярной форме поли-Ig-рецептора с отсутствующими областями 2 и 3, как это описано у Дойчера /Deitcher/ и др. /Mol. Cell Biol., 6:2712-2715 /1986//, и плазмиду pSC-11 с закодированной высокомолекулярной формой.

На фиг. 6A и 6B показаны последовательность у поли-Ig-рецепторной mPHK и аминокислотная последовательность, вытекающие из сказанного выше, как это приводят в литературе Мостов /Mostov/ и др. Они описывают фиг. 6A и 6B следующим образом. Остатки нумеруются числами от 5' до 3', начиная с первого нуклеотида после поли-dG-хвоста, расположенного в точках 21, 53. Нуклеотидные номера указываются на правом поле. Полная последовательность насчитывает 3517 оснований и содержит необычную поли-A-добавочную последовательность AUUAAA, начинающуюся с 26 остатков при следовании вверх от поли-A-хвоста и указанную треугольниками, стоящими под каждым остатком. Предсказанная аминокислотная последовательность показана над нуклеотидной последовательностью. Сигнальный белок нумеруется числами от -18 до -1. Первая аминокислота у созревшего поли-Ig-рецептора /GIn/глицин// нумеруется числом 1. Два потенциальных места для аспарагинсвязанного гликозилирования отмечены чертой, проведенной сверху. Предсказанная мембранностягивающая область отмечена пунктирной чертой, проведенной сверху. Цистеиновые пары для пяти областей, а также соответствующий первый цистеин для шестой области указываются зачерченными кружками, расположенными над первым цистеином каждой области, и незачерченными кружками, расположенными над вторым цистеином каждой области.

Обладая клонированным поли-Ig-рецепторным геном, им можно воспользоваться для непосредственной экспрессии требуемого стабилизаторного белка. В частности, рекомбинантные белки, содержащие некоторые поли-Ig-связывающие области у секреторного компонента, будут оказывать стабилизирующее воздействие на полимерный иммуноглобулин в отношении протеолитического распада без проявления существенного вредного эффекта в отношении специфического связывания и защитных функций полимерного IgA-антитела. В частности, области, показанные на фиг. 4 и 5, представляют собой главную поли-Ig-связывающую область I, две промежуточные главные области II и III и C-концевые области IV и V, которые способствуют поли-Ig-стабилизации.

Поли-Ig-рецептор усекается на C-границе с целью удаления трансмембранной и интрацеллюлярной частей белка, которые не являются существенными в отношении стабилизации или защиты. Усеченной поли-Ig-рецептор, пригодный для использования в настоящем изобретении, следовательно, содержит /как минимум/ N-граничную поли-Ig-связывающую область I.

Проведенное ниже обсуждение двух специфических усеченных поли-Ig-рецепторов делается с целью иллюстрации изобретения, а не для ограничения его. Специалистам, работающим в этой области, совершенно ясно, что специфические белковые последовательности, приведенные ниже, могут быть модифицированы с осуществлением обычных замещений и исключений при сохранении функционального назначения и характера изобретения.

На фиг. 7 изображена аминокислотная последовательность, отвечающая клонированным кДНК двух кроликовых аллелей поли-Ig-рецептора. Одна аллель обозначается "Ho. I" и соответствует кДНК, которую в литературе Мостов /Mostov/ с сотр. /Nature, 308:37-43 /1984//, что показано на фиг. 6A и 6B. Другая аллель была клонирована в лаборатории заявителя Краехенбулом /Kraehenbuhl/ по способу, о котором говорили выше, и последовательность у такой аллели обозначается "Ho.2" на фиг. 7. На фиг. 7 знак деления /":"/ используется для обозначения идентичных остатков; знак в виде точки /"."/ используется для обозначения схожих остатков, т.е. A, S, T; D, E; N, Q; R, K; I, L, M, V; F, V.

На фиг. 8A-8C изображены кДНК-последовательности, отвечающие таким клонам. Опять-таки, двоеточие характеризует идентичные основания. Буква "N" относится к неизвестному основанию.

Имеют место следующие семь областей в пределах поли-Ig-рецепторной последовательности /числа относятся к фиг. 6/.

Область - Сегмент I - 10-118 II - 119-223 III - 224-332 IV - 333-441 V - 442-552 VI - 553-652 VII - 653-755 Область I представляет собой поли-Ig-связывающую область, которая остается у усеченного поли-Ig-рецептора, отвечающего настоящему изобретению.

Специфическая последовательность у области I в случае обоих аллелей /включающих аминокислоты 1-9, которые не играют существенной роли в случае поли-Ig-связывания и, следовательно, не носят критического характера в отношении настоящего изобретения/ показаны на фиг. 9.

Поли-Ig-рецепторная последовательность может быть модифицирована посредством проведения консервативных аминокислотных замещений, исключений и добавлений, которые не изменяют характер поли-Ig-связывания. В самом деле, как видно из фиг. 9, из сопоставления двух последовательностей, отвечающих области I, видно, что имеют место только три аминокислотных изменения в положениях 38, 70 и 76. В каждой из других областей, рассматриваемых в настоящем изобретения, имеют место от двух до шести аминокислотных изменений, причем в области IV изменения приходятся на остатки 337 и 358, а в области V - на остатки 448, 460 и 513.

В сумме, гомология на аминокислотном уровне определенно превышает 80/, и последовательности могут быть модифицированы во всех трех областях посредством проведения аминокислотных замещений или исключением областей.

В частности, применительно к поли-Ig-ассоциации достаточная гомология должна сохраняться в области I, надлежащей интервал /например в 100-500 аминокислот/ должен удерживаться между областями I и V, и область V должна быть пригодной для сохранения ковалентной дисульфидной стабилизации. Таким образом, очень значительное модифицирование может быть допустимым в областях II-IV.

Очень желательно, чтобы усеченный поли-Ig-рецептор включал также область V, которая в силу существования сульфгидрильной связи является ответственной за ковалентную стабилизацию комплекса. См., в общем, литературу /Eiffert et al. , Hoppe Seyler's Z. Phys. Chem., 365:1489-1495 /1984//, где идентифицируются цистеиновые остатки у поли-IgA-антитела /человеческого/, участвующие в образовании дисульфидных мостиков. Важно, кроме того, чтобы интервал, соответствующий областям II-V и определяющий положение области V в отношении образования дисульфидных мостиков, задавался таким, каким он показан на фиг. 5, и чтобы происходило усиление защитного действия в отношении протеолиза.

Для установления надлежащего положения места усечения мембранно-стягивающий сегмент в области VI полного рецептора может быть идентифицирован как промежуточное образование из неизменных преимущественно гидрофобных остатков /например, 630-652 на фиг. 6/ с предшествующим заряженным остатком /например, лизин 629/ и последующей крайне основной последовательностью /например, аргинин-аланин-аргинин-гистидин-аргинин на фиг. 6/. Эту мембранную растягивающую область, а также C-концевой цитоплазматический хвост молекулы исключают усечением.

В случае одного специфического варианта усечение достигается синтезом 16-членного олигонуклеотида ACTAGTOCTAGACTAG со стоп-кодоном TAG во всех трех считываемых кодах. Оликонуклеотид представляет собой полиндром и самогибридизируется. Результирующие сдвоенное образование вводили в описанную выше поли-Ig-рецепторную кДНК /ДНК положение 1834, аминокислота 554/.

Говоря точнее, четыре аминокислоты /T-S-L-D/, закодированные олигомером, добавляли к C-границе области V, в результате чего усечение в точности происходило в месте перехода от области V к области VI. Ограничительный эндонуклеазный участок, выбираемый для вставки олигомера, представляет собой Sall-участок, который является единственным в своем роде и который располагается вблизи предполагаемых участков естественного разрыва /аминокислоты 563, 597 и 605/. Другие удобные участки введения вставки в области V приходятся на Asp /1827/, KpnI /1831/ и ACCl /1835/. В области VI отсутствуют удобные уникальные участки (фиг. 13.) Описанные выше клонированная поли-Ig-рецепторная кДНК или сконструированная /например, усеченная/ поли-Ig-рецепторная кДНК могут быть в общем случае выражены в какой-либо из широкого разнообразия систем экспрессии, которые хорошо известны специалистам, работающим в этой области. Например, желательные системы экспрессии относятся к специализированным секреторным клеткам /т.е., клеткам, которые естественным образом секретируют большие количества белка/, таким как фибробластовые клетки, включая системы экспрессии Чайниз хамстер оувари /Chinese Hamster Ovary/. Могут быть использованы системы экспрессии эндокринных опухолевых клеток, такие как ATt 20 /ATCC / Американская коллекция типов культур/, циркуляры CRL89 и CRLI795/ или PC-12. Клетки Мейдин-Дарби кейнин кидней /Madin-Darby Canine Kidney /MDCK// являются также желательными клетками хозяина. См. работу Мостова /Moctov/ и др. /1984/, цитированную выше. Выбор носителя эксперссии будет зависеть от клетки хозяина, которая была выбрана.

В случае одного из вариантов усеченный поли-Ig-рецептор может быть экспрессирован в обессмерченных IgA-продуцирующих клетках, таких как образования лимфоцит-миелома. В таком случае предпочтительным носителем экспрессии является носитель, который включает в себя сильный или способный индуцироваться промотор, элемент-усилитель /например, B-лифоцитный специфический усилитель, такой как - усилитель или усилитель вирусного начала/, сконструированный стоп-кодон, введенный в поли-Ig-рецепторную кДНК для устранения необходимости протеолитического отделения областей I-V /секреторный компонент/ от клеточного мембранного фиксатора /область VI-VII/. Ниже описаны специфические системы экспрессии.

Как это показано в общем виде на фиг. 10, носитель экспрессии может представлять собой вектор, выраженный, к примеру, через pLK-нео или гидро или pLM-нео или гигро с глюкокортикоидными реактивными элементами или через те же векторы, у которых глюкокортикоидные реактивные элементы удалены и заменены на - элемент-усилитель, т.е. pAKR--нео и pSV 40--нео. Вектор может содержать следующие элементы.

1. Надлежащий промотор для инициирования транскрипции кДНК. LTR-образования, взятые из ретровирусов, являются приемлемыми, включая LTR-образования, выделенные из почечной аденокарциномы, как это описано у Уиллиджера /Williger/ и др. /I. Virol., 60:1-11 /1986/. Почечные LTR-образования являются гомологически подобными LTR-образованиям, выделенным из опухолей молочных желез с некоторыми различиями в U₃-области. Оба LTR-образования содержат глюкокортикоидный элемент, с которым связано гормонное стимулирование транскрипции. Например, глюкокортикоид /дексаметазон, фирма "Сигма корпорейшн, г. Сент-Луис, шт. Миссури/ повышает транскрипцию усеченного поли-Ig-рецептора в 10-50 раз. LTR-образование из почки или молочной железы, выделенное из клонирующего вектора /pLK или pLM предоставлял д-р Хейди Диггельманн /Heidi Diggelmann/, Швейцарский институт раковых исследований, в группе которого была сконструирована плазмида; см. работу Уиллиджера /Williger/, и др. , цитированную выше/ последовательным получением pstl, SI и BamH при ферментации, вводили в pSV₂-нео-вектор/ промышленно доступный через Биолаборатории/, который был последовательно ферментирован заранее с протеканием EcoRI-, SI- и BamHI-ферментации /для удаления SV40-промотора и замены его на LTR-промотор/ /фиг. 6B/. Вектор pLK-гигро или pLM-гигро конструировали введением гигромицин-резистентного гена /IB/ вместо неомицин-резистентного гена. Плазмида pLK_неоPIRII была внесена в банк Американской коллекции типов культур /АТСС/, г. Роквилл, шт. Мэриленд, под инвентарным номером АТСС 40787. Такая плазмида представляет собой pLE_нео-плазмиду, показанную на фиг. 10, с усеченной полимерной иммуноглобулиновой рецепторно-закодированной ДНК /фиг. 8/, введенной в BamHI-участок-плазмиды.

2. Элементы-усилители для усиления транскрипции и, следовательно, продуцирования усеченного поли-Ig-рецептора. Такие элементы включают в себя вирусные элементы /SV40/, глюкокортикоидные реактивные элементы из MMTV/ или специфические усилители из ткани молочной железы, такие как - усилитель, ответственный за высокую экспрессию иммуноглобулина в B-клетках. Усилитель - типа, извлеченный из мышинного геномного клона, заключающего - локус тяжелой цепи /Mercola, M., Wang, X.F., Olsen, Y., and Calame, K., 1983, Science, 221:663-665/, может быть вставлен за различными промоторами.

3. Векторная основа, включающая выбираемые сигнальные гены /например, неомициновый или гигромициновый резистентный ген/, место начала репликации у E.coli с антибиотиковым резистентным геном.

4. Поли-Ig-рецепторная кодирующая кДНК.

5. Синтетический олигомер, содержащий стоп-кодоны в каждой считываемой группе, например, ACTAGTCTAGACTAGT.

Дополнительные подробности по конструированию таких векторов приводятся на фиг. 11. Кислоту кДНК для pSC-I вводили в вектор экспрессии pSV-2 так, как это описано у Садерна и Берга /Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen., 1: 327-341 /1982//. Эта конструкция обозначается как pSV2-SCl.

Результирующий вектор трансфектировали в миеломных клетках, и клетки выделяли для установления наличия эффективной экспрессии у усеченного поли-Ig-рецептора. Для проведения трансфекции использовали стандартные методики электропереноса.

В частности, клетки собирали из ростовой среды /210⁶ на образец/ и осаждали при вращении /510³ об/мин/. Клетки должны выходить из культур в состоянии слипания на 30-70%, и среда должна претерпеть изменения в предшествующие 24 ч. При низкой температуре /ледяная баня/ клетки промывали электропереносящей средой /2 мМ раствор RPMI в глутамине и 0,5%-ная сыворотка стельной коровы с Pen Strp/. Клетки подсчитывали и вновь суспендировали в электропереносящей среде при содержании 210⁶ на 0,75 мл. Примерно 45-50 мкл линеаризованной ДНК /10 мкг линеаризованной кислоты, суспендированной в 45 мкл фосфатно-буферного солевого раствора/ добавляли к аликвоте /0,75 мл/ клеточной суспензии, находящейся в кювете для электропереноса. Кювету ставили на лед на 15 мин, и смесь подвергали пульсирующему воздействию. Клетки затем помещали в подготовленную среду RPMI или среду Игла /Eagle/ и отбирали.

Подвергнутые трансфекции миеломные клетки экспрессируют и выделяют усеченный поли-Ig-рецептор. В противоположность сказанному, миеломные клетки не обладают способностью отщеплять и выделять полный рецептор. Усеченный поли-Ig-рецептор выделяли и очищали от надосадочной жидкости с миеломной культурой, проводя осаждение сульфатом аммония и гелиевое фильтрование.

В одном особенно предпочтительном варианте, описанном более подробно ниже, усеченный поли-Ig-рецептор получали в гибридоме, которая была выбрана для получения желаемого поли-Ig-антитела.

В такой системе ковалентные дисульфидные связи, связывающие усеченный рецептор с поли-Ig-антителом, образуются в живых клетках, и секретируется результирующий стабильный секреторный Ig-комплекс. Эта система может быть сконструирована либо путем трансфекции миеломных клеток, которые будут использованы в качестве партнеров при слиянии с обессмерченными поли-Ig-продуцирующими B-клетками, либо путем трансфекции гибридом, которые уже образованы и экранированы с целью получения требуемого полииммуноглобулина. Результирующая ковалентная дисульфидная связь образуется в любом случае.

Трансфекцию миеломных клеток SP-20 или p3x63/Ag 8U.I /ATCC /Американская коллекция типов культур/, циркуляры CRL 1581, CRL8287, CRL597/, проводили, используя вектор экспрессии pLK, в котором поли-Ig-рецепторная кДНК-транскрипция происходит под управлением почечного MMTV LTP-промотора. См. литературу: Willigr et al., I. Virology, 60:1-11 /1986/. Эффективная транскрипция получается при стимулировании трансфектированных клеток диксаметазоном /10^-6М/ в течение, по крайней мере, 12 ч.

Еще одна система, пригодная для получения стабилизаторного белка, сводится к трансфекции носителя экспрессии для экспрессии полного поли-Ig-рецептора в эпителиальной фиксационно-зависимой клеточной линии, отвечающей млекопитающему, которая образует монослой на пористом субстрате. Одной такой примечательной клеточной линией является MDCK-клеточная линия, трансформированная с вектором для экспрессии поли-Ig-рецептора, как это описано выше. В частности, может быть использован pLK-нео-ScII-вектор, содержащий глюкокортикоидное LTR_K-образование. Могут быть использованы и другие подходящие эпителиальные клетки хозяина, образующие монослой. Известен гигромициновый резистентный ген, который описали Блоечлинер /Bloechliner/ и Диггельманн /Diggelmann/ /Mol. Cell. Biol., 4:2929-2931 /1984//.

В общем, трансфектированную клеточную линию выращивают с образованием монослоя на пористом субстрате, таком как фильтр /например, пропускающие ячеистые фильтры, 0,45 мкМ, 4,7 см²/, покрытый коллагеном. См. работу Стила /Steele/ и др. /Am. Y. Physiol., 251:C136-C139 /1986//. Клетки будут становиться асимметричными с проявлением базальной и апикальной мембран. Мембрана и монослой располагаются таким образом, чтобы происходило разделение сосуда на области с базальной средой и апикальной средой. Поскольку клетки характеризуются тенденцией получать питание из базальной среды, эта среда должна содержать питательные вещества, необходимые для поддержания роста клеток. Требование к наличию питательных веществ в апикальной среде является менее строгим. Клетки с успехом будут использовать рекомбинантный поли-Ig-рецептор, забирая его из базальной среды и перенося в апикальную мембрану, где рецептор претерпевает ферментативное отщепление с образованием стабилизированного поли-Ig-антитела, ковалентно связанного со стабилизирующим белком. Поли-Ig-A-антитело поступает в базальную среду при культивировании IgA-продуцирующей гибридомы в такой среде. Или же в среду может быть добавлен поли-Ig-рецептор, извлеченный /проведением, например, очистки на основе сродства/ из выделенной гибридо