Способ получения фукозилированного углевода, способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы, реакционная система in vitro

Способ получения фукозилированного углевода, способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы, реакционная система in vitro

Реферат

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для получения фукозилированных углеводов. Способ осуществляют в единой реакционной смеси с использованием фукозилтрансферазы для создания С-гликозидной связи между гуанозин 5'-дифосфофукозой и доступной гидроксильной группой углеводной акцепторной молекулы до получения фукозилированного углевода и гуанозин-5'-дифосфата. Гуанозин-5'-дифосфат рециркулируют с образованием гуанозин-5'-дифосфофукозы. Способ позволяет усовершенствовать получение фукозилированных углеводов. 3 с. и 25 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 ил.

Настоящее изобретение предоставляет усовершенствованные способы ферментативного получения углеводов, особенно фукозилированных углеводов. В нем предложен усовершенствованный синтез гликозил-1- или 2-фосфатов, в результате использования как химических, так и ферментативных средств. Затем эти фосфорилированные гликозиды используют для получения нуклеотидов сахаров, которые в свою очередь используют как донорные сахара для гликозилирования акцепторных углеводов. Наиболее предпочтительным является использование раскрытых способов для фукозилирования.

В настоящем изобретении предложен способ получения фукозилированных углеводов в единой реакционной смеси, включающие стадии: использования фукозилтрансферазы для создания O-гликозидной связи между нуклеозид-5'-дифосфо-фукозой и доступной гидроксильной группой углеводной акцепторной молекулы до получения фукозилированного углевода и нуклеозид-5'-дифосфата; рециркулирование in situ нуклеозид-5'-дифосфата с фукозой до образования соответствующей нуклеозид-5'-дифосфо-фукозы. Предпочтительные способы настоящего изобретения включают использование гуанина в качестве основания для нуклеозида, использование каталитических количеств нуклеозидов, использование N-ацетигликозамина, галактозы, N-ацетилгалактозамина или N-ацетиллактозамина в качестве углеводной акцепторной молекулы, и использование сиалилированной углеводной акцепторной молекулы.

В настоящем изобретении далее рассматривается вышеуказанный способ получения фукозилированной сиалилированной углеводной молекулы через ферментативное образование гликозидных связей в единой реакционной смеси, включающий: создание первой гликозидной связи между дифосфонуклеозид-активированным гликозильным донором, таким, как UDP-Gal, и доступной гидроксильной группой углеводной акцепторной молекулы, такой, как GlcNAc, с использованием первой гликозилтрансферазы, такой, как -1,4- галактозилтрансфераза, при получении Ga1I, 4GlcNAc; создание второй гликозидной связи между монофосфонуклеозид-активированным сиалильным донором, таким, как CMP-NeuAc, и доступной гидроксильной группой акцепторной молекулы сахара, такой, как гидроксил в 3-положении Gal Ga1I, 4GlcNAc, с использованием сиалилтрансферазы, такой, как -2,3- сиалилтрансфераза; создание третьей гликозидной связи между дифосфонуклеозидактивированным фукозильным донором, таким, как GDP-Fuc, и доступной гидроксильной группой акцепторной молекулы сахара, например, в 3-положении гидроксила GlcNAc Ga11,4- GlcNAc, с использованием такой фукозилтрансферазы, как - 1,3/4-фукозилтрансфераза, где, по крайней мере, одна из стадий (a), (b) или (c) включает далее образование in situ фосфонуклеотид-активированного гликозильного донора из каталитического количества соответствующего монофосфатного и дифосфатного нуклеозида. Наиболее предпочтительны способы настоящего изобретения, в которых продукт с фукозилированным сиалилированным углеводным фрагментом является таким сиалилированным льюисовым лигандом, как сиалил Le^x(SLe^x) или сиалил Le^a (SLe^a), и где фукозу переносят из фукозилированного донора к гидроксильной группе N-ацетилглюкозаминового или галактозного остатка углеводной акцепторной молекулы.

Рассматриваемый способ охватывает многочисленные катализируемые гликозилтрансферазой реакции в единой реакционной смеси, и предпочтительны такие способы, в которых одну гликозилтрансферазу выбирают из группы, состоящей из -2,3- сиалилтрансферазы, -2,4- сиалилтрансферазы, -2,6- сиалилтрансферазы и -2,8- сиалилтрансферазы. Настоящее изобретение включает фукозилирование олигосахарида, и предпочтительны такие фукозилтрансферазы, которые выбирают из группы, состоящей из: -1,2- фукозилтрансферазы, -1,3/4- фукозилтрансферазы, -1,3- фукозилтрансферазы, -1,6- фукозилтрансферазы и -1,4- фукозилтрансферазы. Наиболее предпочтительные фукозилтрансферазы включают - галактозилазо --1,2- фукозилтрансферазу, N-ацетиглюкозамин -1,3- фукозилтрансферазу, N-ацетилглюкозамин --1,4- фукозилтрансферазу и N-ацетил-глюкозамин -1,6- фукозилтрансферазу.

Углеводные акцепторные молекулы практически неограничены, так как гликозилтрансферазы не селективны относительно положений соседних сахаров. Таким образом, это могут быть любые углеводные замещенные молекулы, в которых углевод является Ga11,4G1cNAc молекулой или ее аналогом, или она может оканчиваться Ga11,4G1cNAc-X фрагментом, где X представляет органическую молекулу. Дополнительные углеводные акцепторные молекулы, которые являются субстратами для фукозилазы, включают аналоги Ga11,4G1cNAc и Ga11, 4Glclac-X. Примерами таких молекул являются лактоза, NeuAc1,6Ga11, 4GlcNAc, Ga11, 3GlcNAc, Ga11,4-G1uca1 (лактал), NeuAc2,3Ga11,4G1uca1, 2-галоидзамещенные продукты реакции вышеуказанных глюкалей, Ga11,4/5- Ga11,4G1cNAc-O- аллил и т.п. Следует также учитывать, что углеводная акцепторная молекула должна содержать доступную гидроксильную группу на сахариде, с которой связана фукозильная или другая донорная группа сахара, а гидроксил, который должен присутствовать, определяется гликозилтрансферазным ферментом, который используют в этой реакции.

Рассматриваемый здесь способ включает далее регенерацию каталитических количеств нуклеотидов, которые используют для создания нуклеозидных сахаров. Предпочтительными основаниями для нуклеотидов являются цитидин, гуанин или уродин. Доноры моносахароидов активируются такими нуклеотидными сахарами, как цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовая кислота, гуанидин-5'-дифосфофукоза и уродин-5'-дифосфогалактоза.

Помимо вышеуказанных способов, настоящее изобретение включает также in vitro реакционные системы. Такие системы называют инертным или нереакционноспособными контейнерами, или отделениями, сохраняющими реагенты, используемые для проведения вышеуказанных реакций. Более конкретно, эти реакционные системы содержат, как минимум, фукозилтрансферазу и нуклеозиддифосфофукозо-образующие ферменты. Эти реакционные системы могут, кроме того, содержать гуанозиндифосфофукозофосфорилазу в качестве GDP-фукозо-образующих ферментов, киназу, такую, как пируваткиназу или фруктозо-1,6-дифосфаткиназу, ацетилкиназу или фукозокиназу. Другие реагенты могут включать NADPH регенерационную систему гуанозиндифосфатманнозы и гуанозиндифосфоманнозопирофосфорилазу. Если присутствует NADPH система, она может включать каталитическое количество NADP, изопропанол в количестве от около 1 до около 10%, предпочтительно, от около 2 до около 4% вес/объем реакционной системы, и алкоголь-дегидрогеназу.

Ряд химических способов для синтеза олигосахаридов также здесь описан. Один способ включает получение гликозил-1-или 2-фосфата за счет реакции защищенного гликозильного кольца, содержащего гидроксил в аномерном положении (1- или 2-положение) с трехвалентным фосфитилирующим реагентом до получения защищенного гликозил 1- или 2-фосфит-защищенного кольца. Защищенный фосфит окисляют до получения соответствующего фосфата, который используют в ферментативной реакции. Гликозильное кольцо может далее включать галактозил, глюкозил, фукозил, N-ацетилглюкозил и маннозил, также как и другие сахариды. Предпочтительными трехвалентными фосфитилирующими агентами являются такие дибензил-N, N-диалкилфосфорамидиты, как дибензил-N, N-диэтилфосфороамидит. Такие диалкилы являются низшими алкилами, содержащими 1 - 5 атомов углерода включительно, и они могут быть одинаковы или различны. В этом случае далее используют такие защитные реагенты, как ацетил или бензил. Гликозильное кольцо необязательно представляет группу, состоящую из D- или L-альдоз, содержащих четыре, пять или шесть атомов углерода, или образует группу, состоящую из D- или L-кетоз, содержащих четыре, пять или шесть атомов углерода, а также сахаридов, содержащих вплоть до девяти атомов углерода в цепи сахарида.

Далее настоящее изобретение включает новые промежуточные соединения для получения гликозил-1- или 2-фосфатов. Предпочтительным промежуточным соединением является защищенный фосфитилмоносахарид формулы I: где R₁ представляет арил или низший алкил; x независимо является кислородом или азотом; R₂ независимо является ацильной, бензильной, силильной или алкильной защитной группой; R₃ независимо представляет -CH₃, -OR₂, -CH₂OR₂, -CH(OR₂)-CH(OR₂) или -CH(OR₂)-CH(OR₂)-CH(OR₂); R₄ представляет водород (H), карбоксил или C₁ - C₅ или бензилкарбоксилатный сложный эфир; а n является целым числом 1 или 2.

В предпочтительной группе соединений формулы I R₄ представляет водород, так что формула I становится формулой II, приводимой ниже, где R₁, R₂, R₃ и X и n имеют указанные ранее значения.

Одной из групп наиболее предпочтительных соединений являются те, в которых моносахарид является шестичленным кольцом, R₄ представлен H, а каждый X является кислородом, например, манноза или фукоза. Предпочтительны соединения, в которых R₁ представляет бензил, а R₂ представляет бензил или ацетил. Примеры предпочтительных промежуточных соединений включают дибензилфосфитил-2,3,4,6-тетра-O-ацетил-D-маннозид или дибензилфосфитил-2,3,4-три-O-ацетил-L-фукозид.

Другой группой наиболее предпочтительных соединений являются те, в которых моносахарид является шестичленным кольцом, R₁ и R₂ имеют указанные ранее значения, один X представляет азот, а остальные кислород. Примеры соединений этой группы включают GlaNAc, GalNAc и NeuAc. Примерами этих соединений служат дибензилфосфитил-2-ацетамидо-2-деокси-3,4,6-три-O-ацетил-D-глюкозид и 2-ацетамидо-2-деокси-3,4,6-три-O-ацетил-D-галактозид.

Раскрыт также моносахаридный аналог, который является 2,3,4-три-O-бензоил --L- фукопиранозилбромидом.

Фраза "доступная гидроксильная группа" относится к гидроксизамещенному углероду, образующему часть кольца углеводной акцепторной молекулы, которая может образовывать гликозидную связь в результате действия гликозилтрансферазы, переносящей моно- или дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор на доступный углерод. "Доступная гидроксильная группа" обычно находится в 3-положении для фукозилирования.

Фраза "защищенное гликозильное кольцо" относится к гликозильным кольцам, в которых доступные амино- или гидрокси-заместители прореагировали с ацильной, бензильной, силильной или алкильной защитными группами. Такие группы описаны в книге Грина Т.В. (Green T.W., "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, 1981).

Термин "углевод(ы)" включает любой органический фрагмент, содержащий углеводы, ковалентно связанные с любыми мономерными сахаридами. Он включает дисахариды, олигосахариды, гликолипиды, гликопротеины и неприродные связи, такие, как связи сахаридов с органическими соединениями, которые в природе не связаны с сахарами.

Фраза "углеводная акцепторная молекула" относится к молекуле, содержащей по крайней мере один моносахарид, где этот моносахарид имеет одну или более доступную гидроксильную группу для образования гликозидных связей с моно- или ди-фосфонуклеозид-активированным гликозильным донором.

Фраза "каталитическое количество" относится к концентрациям реагентов, которые присутствуют в относительно небольших количествах по сравнению с количествами реагентов, которые присутствуют в стехиометрических количествах, и их концентрация в значительной степени не уменьшается в процессе реакции. Те реагенты, которые присутствуют в каталитических количествах, обычно является активирующими реагентами, которые затем регенерируют и возвращают в реакцию за счет побочных реакций.

Фраза "моно- или дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор" или "активированная донорная молекула" относятся к таким нуклеотидным сахарам, как уридин-5'-дифосфо-галактоза. Эти соединения содержат высокоэнергетические связи, которые облегчают образование гликозильной связи с углеводной акцепторной молекулой. Нуклеозид может состоять из любых природных оснований и сахаров, и может также включать незначительное количество производных, таких как метил- или азозамещенные основания, дегидроксилированные или защищенные гидроксильные группы на сахарах, и тиофосфатные аналоги дифосфатного фрагмента.

Фраза "гликозидная связь" относится к кислород/углеродной связи, которая обычно бывает между сахарами. Она может быть либо , либо по своей конфигурации, и обычно включает реакцию дегидратации, когда дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор переносят на доступный углерод углеводный акцепторной молекулы, используя гликозилтрансферазу.

Фраза "гликозильное кольцо" относится к сахару или аминосахару, содержащему 5 или 6 атомов углерода в кольце. Сюда входят альдозы, дезоксиальдозы и кетозы, независимо от ориентации или конфигурации связей у асимметричного углерода. Они включают такие сахара, как рибоза, арабиноза, ксилоза, аллоза, альтроза, глюкоза, идоза, галактоза, талоза, рибулоза, ксилулоза, псикоза, N-ацетилгклозамин, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилманнозамин, N-ацетилнейраминовая кислота, фруктоза, сорбоза, тагатоза, рамноза и фукоза.

Термин "гликозилтрансфераза" относится к семейству ферментов, которые соединяют дифосфонуклеозид-активированный гликозильный донор с доступным углеродом углеводной акцепторной молекулы за счет гликозидной связи. Эти ферменты включают как выделенные из природных источников, так и из источников генетических модифицированных для выделения таких ферментов. Семейство гликозилтрансфераз включает сиалилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, N-ацетилгалактозаминилтрансферазы, фукозилтрансферазы, маннозилтрансферазы, галактозилтрансферазы и КДО трансферазы.

Фраза "NADPH регенерационная система" относится к компоненту ферментов, которые рециклизует NADP, образующийся in situ ферментативной реакции обратно в NADPH. Обычно такая система основана на алкогольдегидрогеназном превращении спирта (изопропила) в кетон (ацетон).

Фраза "сиалилированный лиганд Льюиса" относится к молекуле, способной связываться либо с ELAM рецептором, либо с GMP-140 рецептором протеинов. Химически определенные эти лиганды включают природные трисахаридные лиганды SLe^x и SLe^a и их производные. Такие производные включают незначительные замещения гидроксильных групп на водород, алкил, алкокси, галоид, гликозил и т. п. , молекулы гликалей, соединения с гликозильным кольцом, где кислород кольца с S или NH и их алкильные, окисленные или ацильные производные, присоединение аномерного углерода к углеводам или органическим молекулам, изменение в ориентации и положении гликозидых связей или замену энантиомеров природных сахаров.

Фраза "стехиометрическое соотношение" относится к количеству исходного продукта, который присутствует в прямом соотношении с продуктами реакции. Реагент существует в стехиометрическом соотношении с конечными продуктами, так как его обычно используют в реакциях получения конечного продукта и не регенерируют в процессе реакции. Стехиометрическое соотношение обычно составляет около 1 : 1 или 2 : 1 (отношение исходного продукта к конечному).

Фраза "трехвалентный фосфитилирующий реагент" относится к реагенту, который реагирует с гидроксильной группой органического соединения с образованием фосфит-содержащего продукта, который можно окислить окисляющим реагентом до получения фосфатного соединения после удаления защитных групп.

Сокращения: ADP - аденозин-5'-дифосфат, ATP - аденозин-5'-дифосфат, CMP, цитидин-5'-монофосфат, CDP, цитидин-5'-дифосфат, CTP, цитидин-5'-трифосфат, CMP, NeuAc цитидин-5'-монофосфо-N-ацетилнейраминовая кислота, Fuc, фукоза, Fk, фукокиназа, Fuc-1-P, фукозо-1-фосфат, Fuc - T, фукозилтрансфераза, Ga1, галактоза, Ga1NAc, N-ацетилгалактозамин, GTP, гуанозин-5'-трифосфат, GDP-Fuc, гуанозин-5'-дифосфофукоза, GDP, гуанозин-5'-дифосфат, GDP-Man, гуанозин-5'-дифосфоманноза, GDP-ManPP, GDP-маннозо-пиррофосфорилаза, GDP-FUCPP, GDP-фукозо-пиррофосфорилаза, G1c-1-P, глюкозо-1-фосфат, G1cNAc, N-ацетилглюкозамин, ManNAc, N-ацетилманнозамин, NADP(NADPH), никотинамидадениндинуклеотидфосфат, NeuAc, N-ацетилнейраминовая кислота, NMK, нуклеозидмонофосфаткиназа, MK, миокиназа, PPase, неорганическая пирофосфатаза, PK, пируваткиназа, PEP, фосфо(енол)пируват, Pyr, пируват, PPi, неорганическая пирофосфатаза, P, неорганический фосфат, Rha, раминоза, UDP, уридин-5'-дифосфат, UTP, уридин-5'-трифосфат, UDP-G1c, уридин-5'-дифосфо-глюкоза, UDP-Ga1, уридин-5'-дифосфо-галактоза.

Во многих использованных здесь структурных формулах имеются только две или три группы, связанные с углеродными атомами кольца. Обычно не изображенные группы представляют собой атомы водорода, и обычно не изображают их связи с атомами углерода, если только их изображение нежелательно, с точки зрения стереометрии. В других формулах зачерненные клинообразные линии изображают связи над плоскостью чертежа, а сужающиеся клиновидные линии используются для обозначения связей расположенных снизу плоскости чертежа. Волнистой линий изображают связи двух типов (и , и ). На фиг. 1 представлена типичная временная зависимость превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу в результате NADPH окисления с использованием измерений оптической плотности (Abs).

Кривая A: контрольная кювета без GDP-маннозы.

Кривая B: то же, что и для контроля, но с добавлением 1 мкмоль GDP-маннозы.

По оси ординат отложены единицы поглощения на 340 нм, а по оси абсцисс - минуты.

На фиг. 2 представлены три картины A, B и С - хроматограммы ВЖЭХ - элюирование для превращения GDP-маннозы в GDP-фукозу в момент времени 0 (A), спустя 3 ч (2) и спустя 6 ч (C) соответственно после начала реакции.

По оси ординат отложено относительное поглощение на 254 нм, а по оси абсцисс - минуты.

На фиг. 3 представлен график, который иллюстрирует синергическое ингибирование -1,3- фукозилтрансферазы гуанозин-5'-дифосфата (GDP) с соединением 50 в присутствии 0.2 мМ ¹⁴C-GDP-фукозы и 20 мМ MnCl₂ при pH 6.2.

Использованы следующие символы: открытый треугольник - нет ингибирования; закрашенный треугольник - 0.05 мМ GDP; пустой квадрат - 34 мМ соединения 50; пустой круг - 0.05 мМ GDP плюс 34 мМ соединения 50.

По оси ординат отложены единицы обратной исходной вязкости образовывающегося продукта (I/v), а по оси абсцисс - обратная величина концентрации N-ацетиллактозамина (LacNAc).

Настоящее изобретение относится к in situ мультиферментативной реакции, в которой углеводная акцепторная молекула подвергается фукозилированию нуклеозид-5'-дифосфофукозой за счет фукозилтрансферазы, где нуклеозид-5'-дифосфофукоза предпочтительно ферментативно образуется из каталитических количеств нуклеотидов (см. общие схемы 1 и 2 далее).

Эти и все последующие схемы приведены в конце описания.

Более конкретно, раскрытое изобретение предлагает улучшенный способ получения предшественников нуклеотидных сахаров, которые действуют как донорские субстраты для реакций гликозилтрансферазы. Эти способы включают как химические, так и ферментативные средства. Химическое усовершенствование относится к повышению выхода и стабильности промежуточных соединений - защищенных сахаров, которые используют для получения гликозил-1 или 2-фосфитов, которые в свою очередь окисляют до фосфатов, которые конденсируют с нуклеозидмонофосфатами до получения нуклеозид-5'-дифосфосахаров или нуклеотидных сахаров.

Другим аспектом настоящего изобретения является усовершенствование мультиферментативной системы, включающей более одной гликозилтрансферазной реакции для синтеза углеводов, где одно усовершенствование состоит в использовании каталитических количеств нуклеотида. Нуклеотиды регенерируются из моно- или дифосфатных форм в трифосфатную форму за счет использования in situ ферментативной реакции одновременно с реакциями гликозилтрансферазы. Используют каталитические количества нуклеотида из-за ингибирующего действия нуклеотидов на гликозилтрансферазы.

Родственные патенты США, содержащие основные материалы, относящиеся к раскрытию изобретения: заявка N 07/670701, поданная 18 марта 1991; N 07/707600, поданная 30 мая 1991; N 07738211, поданная 30 июля 1991 и озаглавленная "Олигосахаридные ферментативные субстраты и ингибиторы: способы и композиции"; N 07/852409, поданная 16 марта 1992, и N 07/889652, поданная 26 мая 1992. Все они включены сюда в качестве ссылок.

A. Фукозилирование.

Один из аспектов настоящего изобретения концентрируется на использования вышеописанной и сравнительной технологии для фукозилирования углеводов. Фукозилирование является обычной терминальной модификацией для многих биологически активных углеводов, таких как антигены Льюиса; как сиалилированные так и несиалилированные.

(1) Фукозилтрансферазы.

Фукозилирование возникает под действием фукозилтрансферазы. Фукозилтрансферазы хорошо известны, и их обзор представлен в Adv. Enzymol, 52 : 44 - 56 (1981). Углерод акцепторного углевода обычно является членом кольца глюкозы, галактозы или N-ацетилглюкозамина или их аналогов. O-гликозидная связь обычно бывает в - ориентации. Наиболее обычным местоположением являются: 2-, 3- или 6-гидроксилы галактозы; 3-, 4- или 6-гидроксильные группы N-ацетилглюкозамина; или 3- или 4-гидроксилы глюкозы. Глюкаль и (5-тио)-глюкозосодеpжащие сахариды могут также быть акцепторным сахаридным фрагментом акцепторного углевода для фукозилтрансферазных ферментов.

Фукозилтрансферазы можно выделить из природных источников или из рекомбинантных микроорганизмов, которые были генетически изменены для выделения фукозилтрансфераз. Очищенные нативные фукозилтрансферазы были описаны Foster, J. Biol. Chem. 266: 3526 - 3531 (1991); Muramatsu, Eur. J. Biochem., 157: 71 - 75 (1986); и Prieels et al., J. Biol Chem., 256 - 10 456 - 10 463 (1981). Фукозилтрансферазные гены, как сообщалось, были клонированы и экспрессированы Campbell et al. , J. Biol Chem., 259: 11 208 - 11 214 (1984); Larsen, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 87: 6674 - 6678 (1990); и Kukowska - Latallo, et al., Genes and Devel., 4: 1288 - 1303 (1990); Weston et al., J. Biol. Chem., 267: 4152 (1992).

Вообще фукозилтрансферазы являются мембранносвязанными. Так, целые фукозилтрансферазы обычно не растворимы в водном растворе. Для облегчения их использования в способах и реакционных системах настоящего изобретения предпочтительно использовать растворимые ферменты, где нерастворимый цитоплазмический хвост был бы исключен или сделан более гидрофильным за счет селективной делеции или добавления полярных аминокислот. Однако природные неизменные фукозилтрансферазы можно использовать в настоящем изобретении за счет добавления небольших количеств таких неионных детергентов, как Triton X-100.

Фукозилтрансферазы представляют собой специфический тип гликозилтрансфераз. Активированная донорская молекула представляет обычно нуклеотид-5'-дифосфофукозу. В реакции вырабатывается нуклеотид как уходящая группа и фукоза, содержащая реакционноспособный карбониевый ион, который образует гликозидную связь с доступной гидроксильной группой акцепторной молекулы.

(2) Условия реакции фукозилирования и субстрата.

Фукозилтрансферазы являются типичными гликозилазами и являются относительно устойчивыми ферментами. Условия реакций, подходящие для большинства гликозилтрансфераз, подходят для фукозилтрансфераз. Так, например, подходящие условия реакций включают температурный интервал от около 10 до 40^oC, буферы включают органические и неорганические буферы со значениями pH в интервале физиологических значений pH. Приемлемый интервал значений pH составляет от около 4 до около 9. Концентрации солей составляют от около 0 до 200 мМ и от около 0.1 до около 1.0% неионного детергента (например, Triton X-100), который используют, если по-другому фермент не растворяется в водной среде фукозилирования. Часто возникает необходимость в таком двухвалентном катионе, как Mn²⁺.

Углеводные акцепторные молекулы практически ничем не ограничены. Известные местоположения связывания указаны ранее; однако остальная часть углеводных акцепторных молекул не является критической. Фукозилтрансферазы достаточно толерантны к субстрату, и кроме акцепторного сахара, через который фукоза присоединяется, и сахаров, непосредственно соседствующих с акцепторным сахаром, остальная часть структуры субстрата имеет мало значения. Акцепторные углеводные молекулы можно получить исключительно из остатков сахаров, включая моносахариды, из гликопротеинов, из гликолипидов, или из неприродных соединений, в которых сахар акцептирующий фукозу, связан с такими соединениями, как арил, гетероциклы, циклоалканы и ациклические углеводороды.

Предпочтительная углеводная акцепторная молекула оканчивается GalpI, 4GalcNAc-X фрагментом, где X представляет органическую молекулу. Примеры X групп отмечены далее в тексте. Примеры углеводных акцепторных молекул включают Ga11,4G1cNAc, лактозу, NeuAc2,6Gal1,4GlcNAc, Ga11,3G1cNAc,Ga11,4G1ucal/ (лактал), NeuAc2, 3Gal1,4Glucal, 2-галоидзамещенные продукты реакций вышеуказанных глюкалей, Gal1,4(5-тио)Glc,Gal1,4GlcNAc- O-аллил.

SLe^x или SLe^a аналог может, таким образом, включать атом галоида вместо одного из кольцевых гидроксилов. Был найден новый способ получения 2- или 3-галоид-моно- или олигосахаридов из их соответствующих гликалей за счет использования хлорпероксидазы. Полученные 2(3)-дезокси-2(3)-галоидсахариды можно затем использовать в обсуждающихся далее синтезах.

В соответствии с этим способом гликаль смешивают с перекисью водорода, выбранным ионом галоида (хлоридом, бромидом или иодидом) и каталитическим количеством хлорпероксидазы (EC 1.11.10) в водном буфере со значением pH около 2.5 - 3.5 до получения реакционной смеси. Полученную реакционную смесь далее поддерживают до тех пор, пока не образуется целевой продукт. Концентрации различных реагентов могут меняться, как это хорошо известно специалистам. Примерные концентрации и синтезы приводятся далее. Таким образом, получают галоидгидрин - продукт и затем его предпочтительно выделяют.

При комнатной температуре обычно время реакции составляет от около 15 мин до 2 - 4 дней. Иодид реагирует быстрее всего, а хлорид реагирует наиболее медленно.

Обычно получают термодинамически образующиеся продукты, за исключением тех случаев, когда 1,3-диаксиальные взаимодействия препятствуют образованию 2-аксиально-замещенных продуктов. Если 1,3-диаксиальные взаимодействия присутствуют в реагирующем гликале, у галоид-гидратированных продуктов наблюдается стереоспецифичность в виде - или - ориентации галоидной группы, причем образуются также оба аномера 1- или 2-гидроксильной группы. Примеры синтеза 2- или 3-галоидуглеводных акцепторных молекул и их предшественников проиллюстрированы на схемах 3, 4 и 4a далее.

Бромгидратирование сиалильной Le^x молекулы с терминальным гликалем (соединение 36 схемы 4a), который имеет конформацию в растворе, аналогичную конформации сиалил Le^x приводят к получению продуктов (соединения 37a и 37b). Продукты, имеющие ту же конформацию, что и соединение 36 и сиалил Le^x на участке связывающего домена, состоят из NeuAc-Ga1-Fuc в соответствии с NOE исследованиями.

Бромированные сахариды можно также получить с использованием N-бромсукцинимида (NBS) в растворителе ацетонитрил-вода. Эту процедуру можно использовать для изменения соотношения образующихся продуктов, таких как соединения 32 и 33, которые получаются в равных количествах ферментативной реакции, и в соотношении 1 : 2.5 (32 : 33) при использовании NBS. 3-галоидное соединение 35 и его изомерный галоидгидратированный продукт, соединение 35a, получают в соотношении 2 : 3 (35 : 35a) с использованием NBS реакций по сравнению с отдельным изомером, соединением 35, в тех случаях, когда используют ферментативную реакцию.

Схема 3 иллюстрирует бромгидратирование D-глюкаля, D-галакталя и D-фукаля и образование соответствующих 2-дезокси-2-броммоносахаридов (соединения 20, 21, 22 и 23). Бромгидратирование сиалаля соединения 34 хлорпероксидазой (CPO) до получения соответствующей 3-дезокси-3-бромсиалильной кислоты соединения 35 также представлено в нижней части схемы 3.

Схема 4 иллюстрирует хлоро- и иодогидратацию галакталя до получения соединений 25, 26 и 27. Представлено на схеме 4 бромгидратирование GalI, 3Glucal (соединение 28) и Gal, 4Glucal (соединение 31) до получения соответствующих - и -2- дезокси-2-бром соединений, соединений 29 и 30 и соединений 32 и 33 соответственно.

Активированный донор фукозы, нуклеозид-5'-дифосфофукоза, чаще всего содержит гуанозин; однако существуют и альтернативные доноры, такие как нуклеотид, содержащий любой L-сахар, например L-рамноза и L-идоза.

Для того чтобы связать реакцию фукозилтрансферазы со второй реакцией гликозилтрансферазы, можно просто использовать преимущество того факта, что оптимальные условия для реакций большинства гликозилтрансфераз перекрываются. Таким образом, данные условия реакции для любой гликозилтрансферазы обеспечивают функционирование известных фукозилтрансфераз. Используя указанные ранее условия реакции для фукозилтрансферазы и используя обычные эксперименты титрования, можно получить условия реакции, подходящие для синтеза фукозилированного олигосахарида, используя только моносахариды.

Вообще при выборе условий селективной реакции для множественных реакций гликозилтрансферазы в единой реакционной смеси следует принять во внимание температуру, pH, общую концентрацию осмотически активных ионов, как представлено ранее. Если одной из гликозилтрансфераз является фукозилтрансфераза, приемлемые условия реакции включают интервал pH предпочтительно от около 6.0 до около 8.5, и наиболее предпочтительно, между около 7.0 и около 7.5. Такие двухвалентные катионы, как Mn²⁺, могут быть использованы, но двухвалентные ионы хелатообразующих агентов нежелательны.

Состав буферов не является критическим. Подходят водные буферы, такие как HEPES. Осмомолярность буфера составляет величину от 100 до около 300 мОсм.

Вышеперечисленные условия, при которых функционируют ферменты, здесь и далее называют условиями биологических реакций.

Времена реакций меняются в зависимости от субстратов, ферментов и температур. Обычно время реакции составляет 24 - 96 ч.

В некоторых случаях, если используют галактозилтрансферазу, а моносахаридный акцептор содержит агликон одного положения глюкозы в - ориентации, условия реакции могут включать лактальбумин, предпочтительно - лактальбумин.

Так, например, реакция сиалилтрансферазы, описанная Ichikawa et al., J. Amer. Chem. Soc. , 113: 4698 - 4700 (1991) может быть связана с рекомбинантной человеческой - (1,3/4) фукозилтрансферазой Льюиса, как описано Kukowska - Latallo et al., Genes and Devel., 4: 1288 (1990). Реакционная смесь водного буфера (HEPES) имеет интервал pH 7.0 - 7.5, и концентрацию солей 50 - 200 мМ. Реакция протекает при температуре около 37^oC.

В. Специфичность субстрата и исследования ингибирования гликозилтрансфераз.

- 1,3/4FucT. Фукозилтрансфераза, способная переносить FUC фрагмент из GDP-Fuc на 3- и 4-OH группы GlcNAc с образованием Le^xили Le^a, является - 1,3/4FucT (Fukowska-Latallo et al. , Gene and Debelopment 4: 1288 (1990); Dumas et al. , Bioorg. and Med. Chem. Lett. 1: 425 (1990)). Как следует из приводимой далее табл. 1, фермент катализирует фукозилирование Gal1,3GlcNAc быстрее (V_отн 580), нежели Gal 4GlcNac (LacNAc) (V_отн 100) (примеры 1 и 4) при концентрации 10 мМ углеводного акцептора. Сиалилированный LacNAc (пример 7) также является субстратом для этого фермента, обеспечивающим синтез (Dumas et al., Bioorg. and Med. Chem. Lett., 1: 425 (1991)) сиалил Le^x. Интересно, что Gal1,4 (5-тио)-Glc (Gautheron - Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al. J. Am. Chem. Soc., 113: 8137 - 8245 (1991)] является лучшим субстратом, нежели соответствующий дисахарид, лактоза (примеры 2 и 3) в тех же условиях. Каждый из субстратов табл. 1 представляет углеводный акцептор фукозы из фукозильного донора с использованием этого фермента. Однако Gal1,4 дезоксиноджиримицин (Gautheron - Le Narvor et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1130 (1991); Wong et al. J. Am. Chem. Soc. , 113: 8137 - 8245 (1991)) (пример 11) является ингибитором (ИК₅₀ 40 мМ). Из-за ограниченного количества - 1,3/4Fuc, дальнейшие исследования не проводились.

- 1,3FucT. Этот фермент ответствен за получение сиалил Le^x в человеческой плазме типа - 1,3FucT, который недавно был клонирован, сверхэкспрессирован (Weston et al., J. Biol Chem., 267: 4152 (1992)) и использован в синтезе. В табл. 2 представлена специфичность субстрата, и, как ожидалось, тот фермент более специфичен для LacNAc (V/K_m 2.9, пример 1), нежели Gal -1,3 GlcNAc (V/K_m 0.22, пример 5). Аналогично результату для - 1,3/4FucT (пример 3, табл. 1), Gal -1,4/5-тио/Glc также является субстратом для - FucT (пример 3, табл. 2). В отличие от - 1,3/4 фермента лактал (пример 6) является субстратом для - 1,3 фермента.

Трисахарид NeuAc -2,3 Gal -1,4 GlcNAc (пример 7), предшественник сиалил Le^x, является наилучшим субстратом с относительной максимальной скоростью 620% в расчете на LacNAc. - 2,6-связанный сиалозид (пример 10) примерно в 50 раз менее активен в качестве субстрата, нежели - 2,3-изомер. Весьма нежелательно, что фермент может также переносить Fuc на глюкальсодержащий сиалилированный трисахарид (V_отн. 330%, пример 9).

Что же касается связывания, этот фермент имеет более высокое сродство и дисахаридами (примеры 1, 3, 4, 6), нежели с трисахаридами. Возрастание сродства наблюдается, когда GlcNAc фрагмент LacNAc заменяют 5-тио-Glc, глюкалем (Haworth et al., J. Chem. Soc. 2644 (1990)) или GlcAc- -O-алл