Растворимый конъюгат антитела, способ лечения онкологического заболевания, фармацевтическая композиция

Растворимый конъюгат антитела, способ лечения онкологического заболевания, фармацевтическая композиция

Реферат

 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии. Создан растворимый конъюгат антитела, способный активировать цитотоксические Т-клетки; конъюгат может быть использован для лечения онкологических заболеваний. Изобретение содержит также описание соответствующей фармацевтической композиции. Техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала противоопухолевых средств, полученных рекомбинантным методом. 3 с. и 27 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл.

Настоящее изобретение относится к коньюгатам антител, которые способны активировать цитотоксические Т-клетки (ЦТК). Конъюгаты используются для разрушения нежелательных клеток, связанных с различными формами рака, аутоиммунными процессами, паразитическими заражениями и бактериальными, вирусными и грибковыми инфекциями.

Известны попытки использовать антитела в сочетании с агентами, оказывающими прямое токсическое действие на клетки-мишени (цитотоксические агенты, цитотоксины), для обеспечения селективного воздействия на клетки-мишени и предотвращения и минимизации неспецифического воздействия на другие клетки. Предложенные комбинации охватывают область от ковалентно связанных комплексов с использованием молекул-связок и нековалентно связанных комплексов до простых смесей (например, Гхозе и др., J.Nate. Cancer Inst. 61(1979) 657-676; Карлссон и др., Boecooy 7(1989)567-73). Известны такие цитотоксины, как дифтерийный токсин, рицин, субъединица A рицина, гелонин, и экзотоксин A Psendomonas aeruginoso (Такеда Кемикал Инд., EP-A-336405 и Пастан и др., WO-A-88/00703; обе ссылки процитированы в связи с приоритетной заявкой SE-9002479).

С появлением гибридомной технологии и сопутствующей ей доступности моноклональных антител стало возможным использовать понятие комплексов, образованных антителами и цитотоксическими агентами, для того, чтобы более специфично направить цитотоксические агенты на требуемую популяцию клеток-мишеней.

Т. к. известно повреждающее воздействие цитотоксических клеток на другие клетки, отличные от клеток-мишеней, предложено заменить цитотоксические агенты иммуностимуляторами, инициирующими Т-лимфоциты и активирующими ЦТК. Конкретные предложения касались антител, коньюгированных с: (i) антителами, направленными против рецептеров Т-клеток, или соединениями, способными связываться с рецепторами Т-клеток (Масс. Инст.Текн., EP-A1-180171); (ii) соединениями, такими как антигены, митогены, другие чужеродные белки и пептиды, которые активируют цитотоксические Т-клетки (Неорекс Корп., EP-A1-334300); (iii) антигенами главного комплекса гистосовместимости (АГКГ) (Бегрингверке АГ, EP-A1-352761); (iv) антигенами, против которых лицо, подлежащее лечению, обладает иммунитетом (Med.Res/Counc. WO-A-90/11779 (опубл. 18.10.1990)); и (v) неназванным бактериальным энтеротоксином (Ochi и Wake симпозиум UCLA: Клеточный иммунитет и иммунотерапия рака, 27 января - 30 февраля 1990 г. , Тезис доклада CЕ 515, стр.109).

Однако предложенные до сих пор иммуностимуляторы были или слишком специфичными, или слишком общими в своем действии. Например, классические антигены активируют лишь около 1 из 10⁵ Т-клеток, в то время как митогены потенциально способны активировать большинство Т-клеток.

Было установлено, что некоторые агенты опосредуют активацию Т-клеток на умеренном уровне, т.е. они активируют Т-клетки с достаточно высокой частотой, но далеко от 100% (Флейшер и др., J. Exp.Med. 167(1988)1697-1707; Уайт и др. , Cell 56(1989)27-35; обе статьи включены в настоящее описание посредством ссылки). Агенты этого типа являются более эффективными активаторами, чем классические антигены, и поэтому они получили название суперантигенов (для обзора см.: Кэпплер и Маррак, Science 248:705, (1990)). Далее, было показано (Доглстен и др., Immonol. 71(1990)96-100; Хедлунд и др., Cell. Immunol. 129(1990)426-34), что известные суперантигены обладают способностью связываться с молекулами Класса II главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) на клетках-мишенях и активировать цитотоксические Т-клетки, несущие надлежащую бета-цепь вариабельного участка рецептора Т-клетки. Опубликованные данные указывают на то, что связывание с ГКГ является необходимым предварительным условием для того, чтобы произошли связывание и активация Т-клеток. Нельзя исключить, что в дальнейшем будут найдены суперантигены, действующие через альфа-цепь вариабельного участка рецептора Т-клетки или через другие поверхностные структуры, имеющиеся на субпопуляциях Т-клеток.

Иммуномодуляторное действие суперантигена - энтеротоксина А Staphylococcus (SEA) также было описано Платсокусом и др. (Cell Immunol. 97(1986) 371-85).

В отношении большинства известных в настоящее время суперантигенов ранее было установлено, что они являются токсинами, и все эти суперантигены имеют микробное происхождение. Стафилококковые энтеротоксины, например, являются энтеротоксичными и активируют Т-клетки, и эти два эффекта отличны друг от друга (Флейшер и др., Cell Immunol 118(1989) 92-101; Альбер и др., J.Immunol. 144(1990) 4501-06; и Infect. Immun. 59(1991)2126-34).

Ранее было предложено использовать суперантигены для того, чтобы направлять опосредуемый ЦТК лизис клеток, несущих АГКГ Класса II (Фармациа АБ, WO-A-91/04053, опубл.04.04.1991). WO-A-91/04053 охватывает суперантигены, но не упоминает включенные в ковалентные иммуноконъюгаты.

Клетки, не имеющие белков Класса II ГКГ, или экспрессирующие пороговые количества этих белков, не связывают достаточных количеств суперантигенов, чтобы эффективно направлять их лизис ЦТК. Таким образом благодаря большому объему количеству клеток, несущих АГКГ Класса II, и малому количеству АГКГ Класса II на большинстве опухолевых клеток, суперантигены не должны представлять большой ценности с точки зрения специфического уничтожения таких нежелательных клеток.

Однако нами было обнаружено, что специфический эффект уничтожения клеток, опосредованного ЦТК, может быть достигнут с помощью суперантигенов, если они ковалентно связаны с антителом против эпитопа, который является специфическим для подлежащей уничтожению клетки. Активация иммунной системы может вызвать экспрессию АГКГ класса II клетками-мишенями, не имеющими этих антигенов, что, в свою очередь, может сделать возможным делаемый литический эффект.

Настоящее изобретение охватывает новые конъюгаты антител (i), включающие в себя (I) антитело против клеток-мишеней, и (2) суперантиген, т.е. структуру, которая узнает (взаимодействует с или связывается с) и активирует Т-клетки, в особенности ЦТК; (ii) Способы разрушения клеток-мишеней, особенно в связи с терапевтическими методами лечения млекопитающих, и способы специфической активности Т-клеток, таких как ЦТК; (iii) способы синтеза конъюгатов; и (iv) фармацевтические композиции, содержащие конъюгаты, и способы приготовления этих композиций.

Способы разрушения клеток-мишеней охватывают методы терапевтического лечения рака, аутоиммунных заболеваний, вирусных инфекций, бактериальных инфекций, грибковых инфекций, паразитических заражений, и других заболеваний, в каковых методах целью является уничтожение определенных клеток с высокой степенью точности. Конъюгаты согласно настоящему изобретению могут быть использованы для получения фармацевтических композиций, предназначенных для разрушения клеток-мишеней, связанных с вышеуказанными заболеваниями. Объектами лечения являются млекопитающие, в первую очередь люди.

Суперантигенная часть конъюгата.

Новые конъюгаты антител отличаются структурой, узнаваемой Т-клетками, поскольку она является суперантигеном. Обычно конъюгаты растворимы при физиологических значениях pH, а in vitro они растворимы в сыворотке.

Предпочтительные суперантигены выбирают из группы стафилококковых энтеротоксинов (SE), таких как SEA, SEB, SEC, SED, и SEE, токсоидов, их активных фрагментов или пептидов, и других соединений, отличающихся по существу таким же характером действия в активации ЦТК. Суперантигены могут включать в себя другие микробные продукты (бактериальные и вирусные), такие как продукты из стафилококковых штаммов, например, токсины синдрома токсического шока (TSST-I), из Streptokocci, например, пирогенный экзотоксин A, и бактериальные экзопротеины и белки, продуцируемые плевропневмониеподобными микроорганизмами, обладающими сходной способностью взаимодействовать с Т-клетками также, как взаимодействуют с ними суперантигены. Суперантигены могут быть получены выращиванием их природных производителей или клеток, полученных методами генной инженерии (рекомбинантными методами), и потенциально - также пептидным синтезом. Суперантиген, используемый в рамках настоящего изобретения, должен, при его испытаниях на представленной в настоящем описании экспериментальной модели, оказывать действие, аналогичное тому, которое представлено в экспериментальной части настоящего описания.

Предпочтительные суперантигены обладают потенциальной способностью связываться с 1-40% изоформ полиморфного белка поверхности Т-клетки, связанного с активацией ЦТК, предпочтительно - с бета-цепью вариабельного участка рецептора Т-клетки.

AT - часть конъюгата.

Антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело (монАТ), хотя могут быть использованы и поликлональные антитела, если они обладают достаточно узким интервалом специфичности. Выражение "антитело" относится к антителам в целом, и, таким образом, охватывает активные фрагменты антител, и другие молекулы, имитирующие связывающую способность антител, при условии, что они обладают соответствующей специфичностью, авидитетом и родством в отношении рассматриваемой клетки-мишени. Сюда входят полученные методами генной инженерии (рекомбинантными методами) антитела, производные антител, и другие структуры со входной связывающей способностью. В одном варианте осуществления изобретения антитело является специфическим для антигенной детерминанты на опухолевых клетках, например, детерминанты, связанной с раком толстой кишки (эпитоп, структура). Понятно также, что антитело может быть специфическим для антигенной детерминанты на клетках, ответственных за аутоиммунную реакцию, клетках, зараженных вирусом, бактериях, паразитных, грибках или других нежелательных клетках. В зависимости от эффективности конъюгата, антитело может быть направлено против антигена, интернализующего антитело после связывания, хотя и есть точка зрения, что такие специфичности антитела не являются предпочтительными.

Изученными в связи с настоящим изобретением моноклональными антителами являются антитело C215 против антигена семейства GA733 (см., например, EP-A-376746 и процитированные в этом источнике ссылки, и Ларссон и др., Int. J. Canc. 42(1988) 877-82), антитело C242 (Ларссон и др., Int.J.Canc.42(1988) 877-82) и антитело Thy-1.2 (монАТ С), Опитц и др., Immunobiol. 160 (1982) 438). Понятно, что могут быть использованы моноклональные AT, обладающие специфичностью в отношении других поверхностных структур клеток-мишеней. Приготовление моноклональных антител против эпитопов, уникальных для выбранных клеток-мишеней, хорошо известно в данной области техники. Смотри, например, вышеупомянутые публикации. Такие выражения, как "моноклональные антитела против C242-эпитопа или C215-эпитопа", охватывает антитела, реагирующие с перекрестно реагирующими эпитопами.

Из трех испытанных моноклональных антител C215-конъюгаты, по всей видимости, представляют наименьший интерес, поскольку они реагируют с эпитопом на опухолевом антигене, который слишком часто экспрессируется на нормальных клетках. C242-конъюгаты представляют более перспективными, исходя из данных о специфичности, хотя наши результаты показывают, что они могут потребовать более высоких доз. МонАТ С против Thy-1.2, возможно, не будет представлять большой ценности для борьбы с раковыми клетками человека, поскольку антиген Тhy-1.2 специфичен для опухолевых клеток не человека, а других млекопитающих.

Линия клеток гибридомы, вырабатывающих моноклональное антитело C242, была помещена на хранение в Европейскую Коллекцию культур животных клеток, Портон Даун, Сэлисбери, Уилтс, Великобритания, 26 января 1990 г. под номером ECACC 90012601.

Структура, связывающая суперантиген с антителом.

В предпочтительном конъюгате согласно настоящему изобретению суперантиген ковалентно связан с антителом через ковалентную связку (-B-). Важно, чтобы конъюгат не разрушался при его применении против клеток, подлежащих уничтожению, например, при введении животному; поэтому связка должна быть метаболически устойчива в течение достаточно длительного промежутка времени, чтобы мог быть достигнут эффект. Кроме того, требуется, чтобы сама по себе связка не вызывала иммунологических реакций. В целом связка должна быть инертной в том смысле, что конъюгат должен сохранять высокую специфичность в связывании с клетками-мишенями (противоопухолевую, противовирусную и т.п.) и высокую способность активировать цитотоксические T-клетки.

В научной и в патентной литературе было предложено несколько функциональных групп, выполняющих роль связок в иммуноконъюгатах. Соответственно, связка -B- в предложенных новых конъюгатах может содержать структуры, выбранные из группы, состоящей из: (i) амидов и гидразидов (амиды -CONR₁ или -NR₁CO-, где каждая из свободных валентностей связана с насыщенным атомом углерода, а R₁ может представлять собой атом водорода или алкильный заместитель, такой как низшая алкильная группа (C_1-6) или альфа-N-заместитель природной альфа-аминокислоты, предпочтительно гидрофильной аминокислоты; и гидразиды -CONHNH- или -NHNHOC-, где каждая из свободных валентностей связана с насыщенным атомом углерода); (ii) простых тиоэфиров и дисульфидов (-Sr-, где каждая из свободных валентностей непосредственно связана с насыщенным атомом углерода, S представляет собой атом серы, и r представляет собой целое число, равно 1 или 2); (iii) неразветвленных, разветвленных или циклических углеводородных цепей, которые являются насыщенными и могут быть замещены одной или несколькими гидроксильными или аминогруппами; (iv) простых эфиров (-O-, где каждая свободная валентность непосредственно связана с насыщенным атомом углерода); и (v) первичных аминов или дизамещенных гидразинов (-NH- или -NH-NH-, соответственно, где каждая из свободных валентностей непосредственно связана с насыщенным атомом углерода).

Длина мостика находится в пределах, обычно предполагаемых в данной области техники, т.е. менее 180 атомов, например, менее 100 атомов, но должна быть больше, чем 3 - 6, предпочтительно больше, чем 16 атомов.

Предпочтительная связка является гидрофильной и не должна содержать каких-либо ароматических циклов. Предпочтительными гидрофильными структурами, которые могут образовывать часть связки -B-, являются (i) полипептидные цепи природных гидрофильных альфа-аминокислот (например, аспарагиновой кислоты и ее амида, глютаминовой кислоты и ее амида, лизина, аргинина, глицина, треонина, серина, и, возможно, также гистидина); (ii) оксаалкиленовые цепи, такие как (-O(CH₂)_n)_n, где n представляет собой целое число от 2 до 5, предпочтительно 2 или 3, и n' может представлять собой целое число от 1 до 20; и (iii) -S-(простые тиоэфиры), -O-(простые эфиры) и незамещенные амиды (-CONH-), каждые из которых связаны с короткими незамещенными углеводородными цепями (C_1-4), предпочтительно содержащими 1 или 2 атома углерода.

Гидрофильные аминокислоты могут присутствовать в гидрофильных структурах типа (F-(Pro)_n)_n)_mF, где F представляет собой аминокислотную последовательность, предпочтительно из 4 - 8 остатков, в которой каждая аминокислота индивидуально выбирается из серина, глицина и треонина, m представляет собой целое число от 1 до 4, и n представляет собой целое число от 4 до 8 (Цетус Корп., WO-A-85/03508).

Связка -B- может быть прикреплена или к конкретным местам в антительной или суперантительной частях конъюгата, или к случайным местам. Потенциальными местами являются аминный конец, карбоксильный конец и лизиновый остаток (омега-аминогруппа). Если антитело или супер-антиген несут тиольную группу или дисульфидную группу (цистин или цистеин, соответственно), то эти группы также могут быть использованы для ковалентного связывания, если только они не играют существенной роли для работы активных частей конъюгата. Углеводные структуры, если они присутствуют, могут быть окислены до альдегидных групп, которые, в свою очередь, могут быть использованы для связывания с другой частью конъюгата (Цетус Корп., EP-A-240200).

Конъюгат согласно настоящему изобретению не должен содержать значительных количеств сложноэфирных связей и лабильных амидных связей, в особенности образуемых тирозиновым и гистидиновым остатками, соответственно. Если при синтезе произошло образование таких связей, они должны быть удалены с помощью гидроксиламина (Эндо и др., Cancer Res, 48 (1988) 3330-3335).

Число присутствующих в конъюгате суперантигенных фрагментов, приходящихся на один активный фрагмент АТ, обычно составляет 1 - 5, предпочтительно 1 или 2.

В одном из предпочтительных вариантов конъюгат должен быть по существу однородным в отношении пропорции суперангиген/антитело, и/или использованных мест связывания в суперантигене и антителе, соответственно, и/или связки -B-, и т.п. Другими словами, все отдельные молекулы конъюгата, составляющие конъюгат как вещество, должны быть одинаковыми в отношении этих переменных характеристик.

Вещество должно быть по существу свободно от несвязанных антител или суперантигенов.

Точное отношение суперантиген/антитело, структура связки, и т.п., для оптимального конъюгата зависят от выбранного моноклонального антитела (включая класс, подкласс, продуцирующий клон, специфичность) и выбранного суперантигена. Приведенные в настоящем описании экспериментальные модели позволяют осуществлять отбор по оптимальным параметрам также и для других суперантигенов и антител.

Согласно варианту осуществления изобретения, наиболее широко исследованному до даты подачи заявки, связка -B- включает в себя структуру формулы I -SrRCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n O(CH₂)_mCOY-.

Свободные валентности в формуле I связаны с активными частями, соответственно. Это имеет место или непосредственно, или через следующие двухвалентные инертные структуры, содержащиеся в связке -B-.

n представляет собой целое число больше 0, например, 1 - 20, предпочтительно 2 или больше 2, и во многих случаях меньше 10. m = 1 или 2.

S представляет собой атом серы и связан непосредственно с насыщенным атомом углерода каждой из своих валентностей (-Sr - представляет собой тиоэфир или дисульфид). r = 1 или 2.

Y представляет собой -NH-, -NHNH- или -NHN=CH-, которые своими левыми концами связаны с группой CO, изображенной в правой концевой части формулы I, а своими правыми концами - с насыщенным атомом углерода или с карбонильной группой (только если Y представляет собой -NHNH-).

R предпочтительно представляет собой алкиленовую группу (содержащую от 1 до 4 атомов углерода, часто 1 или 2 атома углерода), которая может быть замещена одной или несколькими (1 - 3, в предпочтительном случае менее чем 2) гидроксильными (OH) группами.

Приготовление конъюгата антитело-суперантиген.

Конъюгаты антител согласно настоящему изобретению могут быть получены путем обогащения и выделения их из культуральной среды вырабатывающих их клеток, или из других сред, в которых они были синтезированы.

Синтез новых конъюгатов может быть осуществлен методами, известными в данной области техники для синтеза конъюгатов, например, методами генной инженерии (рекомбинантными методами) или из соответствующего антитела и соответствующего антигена с помощью классических реакций сочетания по подходящим функциональным группам. В белках присутствуют и обычно используются следующие функциональные группы: (i) Углеводные структуры. Эта структура может быть окислена до альдегидных групп, которые, в свою очередь, реагируют с соединением, содержащим группу H₂NNH- с образованием группы -C=NH-NH.

(ii) Тиольная группа (HS-). Тиольная группа может вступать в реакцию с соединением, содержащим группу, способную взаимодействовать с тиольной группой, с образованием простой тиоэфирной группы или дисульфидной группы. Свободные тиольные группы присутствуют в белках в цистиновых остатках, и могут быть введены белки с помощью тиолирования или расщепления дисульфидов в природных цистеиновых остатках.

(iii) Свободные аминогруппы (H₂N-) в аминокислотных остатках. Аминогруппы могут реагировать с соединением, содержащим электрофильную группу, такую как активированная карбоксильная группа, с образованием амидной группы. Предпочтительно свободная аминогруппа представляет собой концевую аминогруппу или омега-аминогруппу лизинового остатка.

(iv) Свободные карбоксильные группы в аминокислотных остатках. Карбоксильная группа может быть превращена в активированную карбоксильную группу, и затем введена в реакцию с соединением, содержащим аминогруппу, с образованием амидной группы. Однако должны быть приняты меры предосторожности для минимального образования амидов с аминогруппами, которые присутствуют наряду с карбоксильными группами в том же белке. Предпочтительно свободная карбоксильная группа представляет собой концевую карбоксильную группу или карбоксильную группу в двухосновной альфа-аминокислоте.

Соединения, содержащие группу H₂NNH-, группу, способную реагировать с тиольной группой, активированную карбоксильную группу или аминогруппу, могут являться бифункциональным реагентом сочетания, или антителом, или суперантигеном. Группы связываются непосредственно с насыщенным атомом углерода, за исключением группы H₂NNH-, которая, в качестве альтернативы, может также быть связана с карбонильным атомом углерода. Группы могут быть введены в антитело или в суперантиген с помощью обычной дериватизации.

Рекомбинантные методы являются эффективным средством получения конъюгатов, в которых части специфично соединены друг с другом связью от концевой карбоксильной группе в одной части к концевой аминогруппе в другой части. Может также быть введена связующая структура, совместимая с применяемым методом.

Используемые реагенты выбирают таким образом, чтобы получить определенную выше связку -B-. Обычные бифункциональные реагенты имеют формулу Z-B'-Z', где Z и Z' представляют собой функциональные группы, взаимно совместимые друг с другом и позволяющие осуществить ковалентное сочетание по функциональной группе, имеющейся в белке. См. выше B представляет собой инертный мостик, который может содержать те же структуры, что и приведенные выше для связки -B-. Конкретно Z и Z' могут быть одинаковыми или разными, и выбираются из тиольной группы, группы, способной реагировать с тиольной группой, активированной карбоксильной группы, -CONHNH₂, и т.п. Определение этих групп см. ниже под заголовком "Новые реагенты".

Использованный нами способ получения конъюгатов, применявшихся в экспериментальной части, включает в себя: (i) реакцию антитела или суперантигена с органическим реагентом, содержащим группу, способную реагировать с тиольной группой, и группу, способную реагировать с аминогруппой, с получением антитела или суперантигена, несущего группу, способную реагировать с тиольной группой, и (ii) реакцию оставшейся части суперантигена и антитела с органическим реагентом, содержащим тиольную группу или защищенную тиольную группу, и группу, способную реагировать с аминогруппой, с получением суперантигена или антитела, несущего тиольную группу или защищенную тиольную группу, после чего (iii) полученные на стадиях (i) и (ii) продукты взаимодействуют друг с другом с образованием конъюгата, в котором суперантиген связан с антителом дисульфидной или простой тиоэфирной связью.

Условия сочетания для каждой группы применительно к химии белка известны. Сочетание может протекать постадийно или в одну стадию путем создания промежуточных функциональных групп, которые могут быть присоединены к исходному материалу инертными спейсерами. В общем случае условия, в которых осуществляются синтез и очистка/выделение конъюгата, всегда являются не вызывающими денатурацию используемых белков. Обычно это означает водные среды, значения pH в интервале 3 - 10 и температуры от 0 до 50^oC. Конкретные условия зависят от того, какие группы вступают в реакцию, и какой конъюгат подлежит выделению. Более подробно см. в разделе "Новые реагенты".

Новые реагенты (разработанные в связи с данным изобретением) Для химического синтеза конъюгатов, содержащих связку -B-, нами был разработан новый гетеробифункциональный реагент, отвечающий общей формуле II: Z₁RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mZ'₁, где m и n имеют те же значения, что и для формулы I Z₁ представляет собой электрофильную группу, способную реагировать с HS-группой, тиольную группу (-SH) или защищенную тиольную группу (например, AcS-), при условии, что тиольная группа и гидроксильная группа не должны быть связаны с одним и тем же атомом углерода в R.

Примерами электрофильных групп, способных реагировать с HS-группой, являются следующие электрофильные группы: (i) галоген, связанный с насыщенным атомом углерода, предпочтительно в форме альфа-галоген-алкилкарбонила (например Z₁CH₂CO-); (ii) активированная тиольная группа, предпочтительно так называемый реакционноспособный дисульфид (-SSR₁), связанный с насыщенным атомом углерода; (iii) 3,5-диоксо-1-аза-циклопент-3-ен-1-ил.

Определение реакционноспособного дисульфида см. , например, в EP-A-128885, включенной в настоящее описание посредством ссылки.

Z'₁ представляет собой активированную карбоксильную группу, т. е. электрофильную группу. Примерами являются галиондангидриды карбоновых кислот (-COCl, -COBr и -CОl), смешанные ангидриды карбоновых кислот (-COOOCR₁), реакционноспособные сложные эфиры, такие как N-сукцинимидилоксикарбонил, -C(= NH)-OR₂, 4-нитрофенилкарбоксилат (-CO-OC₆H₄NO₂), и т. п. R₁ и R₂ могут представлять собой низшую алкильную группу (C₁ - C₆); кроме того, R₂ может также представлять собой бензильную группу.

Одно из преимуществ новых реагентов состоит в том, что они позволяют получить однородное вещество конъюгата в отношении значения целого числа n в структуре (OCH₂CH₂)_n, т. е. n является одинаковым для каждой отдельной молекулы данного вещества конъюгата.

Функциональные группы, вступающие в реакцию с Z'₁ и Z₁, могут присутствовать в природных молекулах антител или суперантигенов, или могут быть введены в них. Затем концевые группы Z'₁ и Z₁ могут селективно реагировать с соответствующим антителом или суперантигеном согласно способам, известным для групп этого типа.

Известные методики включают удлинение цепи, которое начинают или с нового реагента, или с соединений, которые надлежит конъюгировать.

Удлинение цепи с использованием нового реагента может, например, привести к получению конъюгата, в котором -B- представляет собой: (1) OR'-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCOY-; связывается с NH, (2) -COR'-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCONHNH-R''-NH; обычно связано с sp²-гибридизованным атомом углерода, образовавшимся из окисленной углеводной структуры в антителе или суперантигене (когда они являются гликопротеинами), (3) (CH₂)_mO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂HCOR'-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n-O(CH₂)_mCOY-; связано с NH, (4)-CO(CH₂)_mO(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂NHCOR'-Sr-RCONHCH₂CH₂(OCH₂CH₂)_n-O(CH₂)_mCONHNH-R''NH; связано так же, как и выше в (2), R, R' и R'' представляют собой алкиленовые группы, выбираемые так же, как и R в формуле (I). r имеет то же значение, что и выше.

Реагент (формула II) можно получить, исходя из соединений, отвечающих формуле III NH₂CH₂CH₂(OCH₂CH₂)_nO(CH₂)_mCOOOH, где m = 1 или 2; n = 1-20 целое число, например 2 - 20 или 3 - 9.

Синтез некоторых соединений формулы III, где m=1 и 2 и n - 1 - 10, был описан ранее (Джульен и др., Tetrahedron Letters 29 (1988) 3803-06; Хоугтон и Сауби, Synth. Commun. 19 (18) (1989) 3199-3209; и EP-A-410280 (опубл. 20.01.91) и Слама и Рэндо, Carbohydrate Research 88 (1981) 213-221 и Biochemistry 19 (1980) 4595-4600).

Новые реагенты, отвечающие формуле II, можно получить реакцией соединения формулы III с бифункциональным реагентом формулы Z-B'-Z', где Z=Z₁, B'= R'', имеющий те же значения, что и определенные выше для R и R', и Z' представляет собой активированную карбоксильную группу согласно вышеприведенному определению. После реакции фракцию -COOH превращают в активированную карбоксильную группу, например, Z'₁ = активированный сложный эфир, такой как N-сукцинимидилоксикарбонил, 4-нитрофенилоксикарбонил, 2,4-динитрофенилоксикарбонил, и т.п.

Новые соединения формулы (III) и их новые производные, по сути дела, представляют собой простые полиэфиры, отвечающие общей формуле IV XCH₂CH₂(OCH₂CH₂-)_nOCH₂Y, где n = 2-20, целое число, предпочтительно 3 - 20 или 3 - 9; X представляет собой группу H₂N-, включая ее протонированную форму (⁺H₃N-), или замещенную группу H₂N-, которая может быть превращена в H₂N- предпочтительно путем гидролиза или восстановления.

Примерами являются незамещенная аминогруппа (H₂N-), нитрогруппа, амидная (карбамидная) группа, такая как низшая ациламидная группа (формиламидная, ацетиламидная ...... генксаноиламидная), включая ациламидные группы с электроноакцепторными заместителями у альфа-атома углерода в ацильной части, в особенности CF₃CONH-, CH₃COCH₂CONH-, и т.п.; фталимидоильная группа, которая может содержать заместители в кольце; карбаматная группа (в особенности R'₁OCONH- и (R'₁-OCO)(R'₂-OCO)N-, такие как N-(трет-бутилоксикарбонил)амино (Бок), N-(бензилоксикарбонил)амино и ди(N-бензилоксикарбонил))-амино (Z и диZ, соответственно), которые могут содержать заместители в кольце; алкиламиногруппа, в которой атом углерода, связанный с атомом азота, находится в альфа-положении к ароматической системе, такая как N-монобензиламино, N,N-дибензиламино, N-тритиламино (трифенилметиламино), и т.п., включая аналогичные группы, в которых метильный атом углерода (включая бензильный атом углерода) заменен на атом кремния (Si), такие как N,N-ди(трет-бутилсилил)амино; и 4-оксо-1,3,5-триазин-1-ил, включая содержащие низшие алкильные заместители в положениях 3 и/или 5.

Выше и в дальнейшем R₁ и R₂ представляют собой низшую алкильную группу, в особенности вторичную и третичную алкильную группу, и метильную группу, замещенную 1 - 3 фенильными группами, которые, в свою очередь, могут быть замещенными. Низшая алкильная и низшая ацильная группы имеют 1 - 6 атомов углерода.

Y представляет собой карбоксильную группу (-COOH, включая -COO^-), или группу, которую можно превратить в карбоксильную, предпочтительно с помощью гидролиза или окисления. Наиболее важными группами являются сложно-эфирные группы, в которых карбонильный атом углерода или соответствующий атом в орто-эфирах связан с метиленовой группой в правом конце соединения формулы (I). Примерами являются алкилэфирные группы (-COOR'₁); орто-эфирные группы (-C(OR'₃)₃), и реакционноспособные сложноэфирные группы согласно вышеприведенному определению. R'₃ имеет те же значения, которые определены выше для R'₁.

Другими группами являются -CHO, -CN, -CONH₂, -CONR₁R₂, где R₁ и R₂ имеют те же значения, что и выше.

Соединение формулы IV можно синтезировать из известных исходных материалов с помощью комбинации известных способов. Подходящими путями синтеза являются: А. Формирование цепи.

Б. Трансформация концевых функциональных групп.

В. Трансформация симметричного простого полиэфира в несимметричный простой эфир.

Г. Расщепление бисимметричной цепи на два одинаковых фрагмента.

Удобные исходные вещества, содержащие повторяющееся звено -OCH₂CH₂-, являются коммерчески доступными. Примерами служат олиго-этиленгликоли, содержащие от 2 до 6 повторяющихся звеньев. Другими подходящими соединениями с одинаковыми концевыми группами являются соответствующие дикарбоновые кислоты и диамины.

Удобными исходными материалами, имеющими разные концевые группы, являются омега-гидроксимонокарбоновые кислоты, в которых концевые группы разделены чистым полиэтиленоксидным мостиком. Такие соединения, содержащие до 5 повторяющихся звеньев, были описаны ранее (Накадзуи, Кавамура и Окахара, Synthesis (1981), стр. 42).

Фармацевтические композиции и их приготовление Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают в себя составы, которые известны как таковые в данной области техники, но содержат наши новые конъюгаты. Композиции могут быть представлены в форме лиофилизованных частиц, стерильного или асептически приготовленного раствора, таблеток, ампул и т. п. В них могут входить носители, такие как вода (предпочтительно забуференная до физиологических значений pH, например, ФСБ), или другой инертный твердый или жидкий материал. В общих чертах, композиции готовят, смешивая, растворяя, связывая или каким-либо иным способом комбинируя конъюгат с одним или несколькими водонерастворимыми или водорастворимыми, водными или неводными носителями, и, если требуется, с подходящими добавками и адъювантами. Необходимо, чтобы носители и условия не оказывали отрицательного воздействия на активность конъюгата. Вода как таковая входит в число носителей.

Употребление и способы использования.

Обычно конъюгаты являются твердыми и употребляются в виде заранее приготовленных дозировок, каждая из которых содержит эффективное количество конъюгата, которое, на основании представленных результатов, составляет от 10 мкг до 50 мг. Точная доза меняется от случая к случаю и зависит от веса и возраста пациента, способа употребления, типа заболевания, антитела, суперантигена, связки (-B-), и т.п.

Способ употребления соответствует общеизвестным в данной области, т.е. эффективное для лизирования клеток-мишеней, количество или терапевтически эффективное количество конъюгата согласно настоящему изобретению проводят в контакт с клетками-мишенями. Для вышеуказанных случаев это чаще всего означает парэнтеральное введение, такое как инъекция или вливание (подкожно, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно), в организм млекопитающего, например, человека, Конъюгат может вводиться объекту лечения локально или системно.

Под "эффективным для лизирования клеток-мишеней количеством" понимается такое количество, которое эффективно активирует и направляет ЦТК на разрушение клеток-мишеней.

Ниже изобретение иллюстрируется с помощью ряда вариантов осуществления, которые никоим образом не ограничивают данное изобретение. В разделе I экспериментальной части представлен химический синтез конъюгатов, а в разделе II - действие приготовленных в примере 4 конъюгатов в активации T-клеток для лизирования клеток-мишеней.

Экспериментальная часть. Раздел I.

Приготовление омега-амино-ПЭГ-карбоновой кислоты.

Изопропил-8-гидрокси-3,6-диокса-октаноат (1).

К диэтиленгликолю (500 мл) в атмосфере азота порциями добавляют натрий (23 г, 1,0 моль) в виде стружек. После того, как натрий полностью прореагирует, смесь охлаждают до комнатной температуры и при перемешивании добавляют бромуксусную кислоту (76 г, 0,5 моль). Через 18 часов реакции при 100^oC избыток диэтилегликоля отгоняют при около 4 мм. рт. ст. После этого добавляют изопропиловый спирт (400 мл) и порциями - ацетилхлорид (51 г, 0,65 моль). После перемешивания при 65^oC в течение 18 часов смесь охлаждают до комнатной температуры и нейтрализуют ацетатом натрия (3,5 г, 0,15 моль). Смесь фильтруют, фильтрат упаривают почти досуха, и растворяют остаток в воде (200 мл). Водную фазу экстрагируют 1,1,1-трихлорэтаном (3 раза по 50 мл). Соединенные органические фазы промывают водой (20 мл). Продукт экстрагируют из соединенных водных фаз дихлорметаном (50 мл), после выпаривания которого получают масло (55 г).

Изопропил-11-гидрокси-3,6,9-триокса-ундеканоат (2) К триэтиленгликолю (700 мл) в атмосфере азота порциями добавляют натрий (23 г, 1,0 моль) в виде с