Антагонисты эндотелиновых рецепторов, фармкомпозиция, способ их получения, способ подавления эндотелиновых рецепторов

Антагонисты эндотелиновых рецепторов, фармкомпозиция, способ их получения, способ подавления эндотелиновых рецепторов

Реферат

 

Описаны новый индан и инден производные, которые являются эндотелиновыми рецепторными антагонистами формулы (I) R₁=-X(CH_2n Ar или -X(CH₂)_n CO₂H (тетразол); R₂ - Ar; P₁ и P₂-X(CH_2n CO₂H или -X(CH_2n тетразол; Z₁, Z₂, Z₃ -H, OH, CH_1-8-алкокси, N(R₆)₂, NHCOR₆, фенил, бензил; R₆ - H или низший алкил.

Описан способ их получения взаимодействием соответствующих сложного эфира и магнийорганического соединения, а также описаны фармкомпозиция и способ подавления эндотелиновых рецепторов. 4 с. и 6 з.п. ф-лы, 1 табл.

Данное изобретение относится к новым индан и инден производным, фармацевтическим композициям, содержащим эти соединения, и их использованию в качестве эндотелиновых рецепторных антагонистов.

Эндотелин (ET) является чрезвычайно высокоактивным сосудосуживающим пептидом синтезируемым и выделенным васкулярным эндотелием. Эндотелин существует в виде трех изоформ, ET-I, ET-2 и ET-3. Было найдено, что из них только ET-1 и ET-3 экспрессируются в системах млекопитающих. /Если указано особо, "эндотелин" будет означать любой или все изомеры (изоформы) эндотелина/. Эндотелин оказывает глубокое воздействие на сердечно-сосудистую систему, и в частности, на коронарное, почечное и мозговое кровообращение. Повышенное или ненормальное выделение эндотелина связано с сокращением гладких мышц, которые вовлекаются в патогенез сердечно-сосудистой, церебрально-сосудистой, респираторной и почечной патафизиологии. Сообщалось о существовании повышенных уровней эндотелина в плазме у пациента со значительной артериальной гипертензией, острым инфарктом миокарда субарахноидальным кровообращением, атеросклерозом, и пациентов с уремией, подвергающихся диализу.

In vivo, эндотелин оказывает явно выраженное воздействие на кровяное давление и минутный сердечный выброс. Внутривенозная инъекция ударной дозы ET (от 0,1 до 3,0 нмоль/кг) вызывает у крыс временную, связанную с дозой депрессорную реакцию (отклик) (спустя от 0,5 до 2 мин) с последующим устойчивым, зависящим от дозы повышением артериального кровяного давления, которое может оставаться увеличенным в течение 2-3 ч после введения дозы. У крыс дозы свыше 3 нмоль/кг часто вызывает летательный исход.

Эндотелин по-видимому оказывает предпочтительное воздействие на почечное сосудистое ложе. Он вызывает заметное продолжительное снижение почечного кровотока, сопровождаемое существенным снижением в GFR, объема мочи, выделения натрия и калия с мочой. Эндотелин вызывает длительный антинатриуретический эффект, несмотря на значительное увеличение атриального натриуретического пептида. Эндотелин также стимулирует renin активность (плазмы). Эти результаты наводят на мысль, что ET вовлекается в регулирование почечной функции и вызовет в целом ряде почечных расстройств, включающих острую почечную недостаточность, циклоспориновую нефротоксичность и хроническую почечную недостаточность.

Исследования показали, что in vivo, церебральная сосудистая сеть является высокочувствительной как к сосудорасширяющему, так и сосудосуживающему воздействию эндотелина. Поэтому ET может быть важным медиатором церебрально-сосудистого спазма частого и часто смертельного последствия субарахноидального кровотечения.

ET также проявляет непосредственное воздействие на центральную нервную систему, такое как тяжелое апноэ и ишемические паталогии, которые наводят на мысль, что ET может принимать участие в развитии церебральных инфарктов и гибели нейронов.

ET может быть также вовлеченным в ишемию миокарда (Nichols et al. Br. J. Pharm. 99: 597-601, 1989, and Clozel, Circ. Res., 65: 1193-1200, 1989), спазмы коронарных сосудов (Fukuda et al., Eur. J. Pharm. 165: 301-304, 1989 and Liischer, Circ., 83:701, 1991) при сердечной недостаточности, пролиферацию васкулярных клеток гладкой мышцы, (Jakagi, Biochem. & Biophys. Res. Commun. , 168: 537-543, 1990, Bobek et al., Am. J. Physiol. 258:408-C 415, 1990) и атеросклерозы (Nakaki et al., Biochem. & Biophys. Res. Commun. 158: 880-881, 1989, and Lerman et al., New Eng. J. of Med. 325: 997-1001, 1991). Было показано существование повышенных уровней эндотелина после коронарной пластической операции с использованием надувного баллона (Kadel et al., No 2491, Circ. 82:627, 1990).

Кроме того, было найдено, что эндотелин является сильнодействующим констриктором выделенной у млекопитающих ткани дыхательных путей, включающей человеческие бронхи. (Ushida et al., Eur. J. of Pharm. 154: 227-228 1988, La Gente, Clin. Exp. Allergy, 20: 343-348, 1990; and Springall et al., Lancet, 337: 697-701, 1991).

Эндотелин связан с возникновением кровоизлияний и некротических нарушений слизистой оболочки желудка (Whittle et al., Br. J. Pharm. 95: 1011-1013, 1988); симптома Raynand'a, Cinniniello et al., Lancet 337: 114-115, 1991); мигрени (Edmeads, Headache, Feb. 1991 p. 127); сепсиса (Weitzberg et al., Circ. Shock. 33: 222-227, 1991; Pittet et al., Ann. Surg. 213: 262-264, 1991, циклоспорин-индуцируемой почечной недостаточности или гипертензии (Eur. J. Pharmacol., 180: 191-192, 1990, Kidney Int., 37: 1487-1491, 1990) и эндотоксинового бактериально-токсического шока и других вызываемых эндотоксином заболеваний (Biochem., Biophys. Res. Commun. 161: 1220-1227, 1989, Acta Phisiol Scand. 137: 317-318, 1989), J.Clin. Invest., 83, 1989, 1762-1767.

Таким образом, эндотелиновые рецепторные антагонисты будут представлять уникальный метод для фармакотерапии гипертензии, почечной недостаточности, заболеваний сосудов головного мозга, ишемии миокарда, ангины, сердечной недостаточности, астмы, атеросклероза, симптома Raynand'a, язв, сепсиса, мигрени, глаукомы, эндотоксинового шока, вызываемого эндотоксином множественного органического нарушения или распространенной внутрисосудистой коагуляции, циклоспорин-индуцируемой почечной недостаточности и в качестве вспомогательного средства при пластической операции на сосудах и предотвращения рестеноза.

Данное изобретение включает индан- и инденпроизводные, представленные формулой (I), и фармацевтические композиции, содержащие эти соединения, и их использование в качестве эндотелин рецепторных антагонистов, которые являются полезными в лечении разнообразных сердечно-сосудистых и почечных заболеваний, включающих, но не ограничивающих ими, следующие: гипертензия, острая и хроническая почечная недостаточность, циклоспорин-индуцируемая нефротоксичность, внезапный приступ, цереброваскулярный вазоспазм, ишемия миокарда, ангина, сердечная недостаточность и атеросклероз.

Кроме того, изобретение представляет способ подавления эндотелиновых рецепторов у животных, включая людей, который включает введение нуждающемуся в этом животному эффективного количества соединений формулы (I).

Соединения данного изобретения представлены структурной формулой (I) где R₁ является -X(CH₂)_nAr или -X(CH₂)_n R₈ или (c) R₂ является водородом, Ar или (c); R₁ - -X(CH₂)_nR₈; R₂ - -X(CH₂)_nR₈ или -XR₉Y; R₃ и R₅ независимо водород, R₁₁, OH, C_1-8-алкокси, S(O)_qR₁₁; N(R₆)₂, Br, F, I, Cl, CF₃, NHCOR₆, -R₁₁CO₂R₇, -XR_9-4 или -X(CH₂)_nR₈, где метиленовые группы -X(CH₂)_nR₈ могут быть незамещенными или замещенными одной или более -(CH₂)_nAr-группами; R₄ - водород, R₁₁, OH, C_1-5-алкокси, S(O)_qR₁₁ N(R₆)₂, -X(R₁₁), Br, F, I, Cl или NHCOR₆, где C₁-C₅-алкокси может быть незамещенной или замещенной с помощью OH, метокси или галогена; R₆ независимо - водород или C_1-4-алкил; R₇ независимо - водород, C₁-C₆-алкил или (CH₂)_nAr; R₈ - водород, R₁₁CO₂R₇, PO₃H₂, P(O)(OH)R₇, CN, -C(O)N(R₆)₂, тетразол или OR₆; R₉ - C₁-C₁₀-алкил, C₂-C₁₀-алкенил или фенил, все они могут быть незамещенными или замещенными одним или более OH N(R₆)₂, COOH, галогеном или XC_1-5-алкилом: R₁₀ представляет R₃ или R₄; R₁₁ - C₁-C₈-алкил, C₂-C₈-алкенил, C₂-C₈-алкинил, все они могут быть незамещенными или замещенными одним или более OH, CH₂OH, N(R₆)₂ или галогеном; X (CH₂)_n, O, NR₆ или S(O)_q; Y - CH₃ или X(CH₂)_nAr; Ar является нафтил, индонил, пиридил, тиенил, оксазолидинил, оксазолил, тиазолил, изотиазолил, пиразолил, триазолил, тетразолил, имидазолил, имидазолидинил, тиазолидинил, изоксазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, морфолинил, пиперидинил, пиперазинил, пирролил или пиримидил; все они могут быть незамещенными или замещенными одной или более R₃- или R₄-группами; A является C = O или [C(R₆)₂]_m; B является -CH₂- или -O-; Z₁ и Z₂ независимо - водород, C₁-C₈-алкил, C_2-8-алкенил, C_2-8-алкинил, OH, C_1-8-алкокси, S(O)_q, C_1-8-алкил, N(R₆)₂, Br, F, I, Cl, NHCOR₆, -X(CH₂)_nR₈, фенил, бензил или C_3-6-циклоалкил, где C_1-8-алкил, C_2-8-алкенил, или C_2-8-алкинил могут быть независимо замещенными COOH, OH, CO(CH₂)_nCH₃, CO(CH₂)_nCH₂N(R₆)₂ или галогеном, или Z₁ и Z₂ вместе могут быть -O-A-O- на прилегающих углеродных атомах; Z₃ является Z₁ или XR₉Y; q = 0, 1 или 2; n = 0 - 6, целое число; m = 1, 2 или 3; пунктирная линия обозначает необязательное наличие двойной связи, или фармацевтически приемлемая их соль, при условии, что R₂ не является водородом, когда X - S(O)_q; когда необязательная двойная связь присутствует, есть только один R₁₀ и отсутствует R₁; соединение формулы I не является (1RS)-1,3-дифенилиден-2-карбоновая кислота; (цис,цис)-(1RS,3SR)- 1,3-дифенилиндан-2-карбоновая кислота; (1RS)-3-[3-метил-1-фенил- (1H)-инд-2-ен-1-]ил пропионовая кислота; или (1RS)-2[1,3-дифенил-(1H)- инд-2-ен-2-ил]этановая кислота. В изобретение также включаются фармацевтические приемлемые комплексы солей.

Все алкил, алкенил, алкинил и алкокси группы могут быть прямолинейными или разветвленными. Термин "галоген" используется для образования обозначения иодо, фторо, хлоро или бромо. Алкильные группы могут быть замещенными одним или более галогенами до полного галогенирования.

Соединения данного изобретения могут содержать один или более асимметричных атомов углерода и могут существовать в рацемической или оптической активной форме. Все эти соединения и диастереоизомеры рассматриваются как входящие в рамки объема данного изобретения и приложенных пунктов.

Предпочтительными являются такие соединения, в которых R₁ является : X(CH₂)_nAr, (Ar представляет (a) или (b)), дигидробензофуранил, бензодиоксанил, циклогексил, C_1-4-алкил, R₂ представляет (a), (b) C_1-4-алкил, индонил или водород; R₃ и R₅ представляют независимо водород, OH, C_1-5 алкокси, галоген, -OC_1-4-алкил фенил, R₁₁CO₂R₇, C_1-4-алкил, N(R₆)₂, NH(CO)CH₃, -X(CH₂)_n R₈, -XR₉ пиридил, фенил или S(O)_pC_1-5-алкил; R₄ представляет водород, OH, C_1-5-алкокси, галоген, C_1-4-алкил, N(R₆)₂, H(CO)CH₃ или S(O)_pC_1-5-алкил; Z₁, Z₂, и Z₃ независимо представляют XR₉Y, бензил, водород, OH, C_1-5-алкокси, -N(R)₆)₂, S(O)_qC_1-8-алкил, NHCOR₆, X(CH₂)_nR₈ или галоген, или Z₁ и Z₂ вместе могут быть -O-A-O на прилегающих углеродных атомах; R₁ и R₂ независимо представляют водород, CO₂H или тетразол, Ar представляет (a), (b), фенил, или пиридил; X представляет (CH₂)_n или кислород.

Более предпочтительными являются соединения, в которых R₃ представляет водород или -X(CH₂)_nR₈, R₁₁CO₂R₇; R₄ и R₅ независимо представляют водород, OH, C_1-5-алкокси, SC_1-5-алкил, F, Br, C_1-3-алкил или NH₂; Z₁ и Z₃ представляют водород и Z₂ представляет водород, OH, C_1-5 алкокси, галоген, X(CH₂)_nR₈, NH₂, бензил, NH(CO)CH₃, или Z₁ и Z₂ вместе могут быть O-A-O.

Самыми предпочтительными являются соединения, в которых R₁ представляет (b) и R₂ представляет (a) или (b); A является CH₂, B является -O-; отсутствует необязательная двойная связь; R₁ и R₂ находятся в транс по отношению к R₁; Z₂ представляет OH, C_1-5-алкокси, -OCH₂CHCH₂ или водород, Z₁ представляет водород; X(CH₂)_qCOOH или CH=CHCO₂H, R₄ представляет водород, замещенный фенил, или C_1-2-алкокси и R₅, R₁₀ и R₂ - водород.

Особенно предпочтительными являются следующие соединения: (1RS), 2SR, 3SR)-1-(4-метоксифенил)-3-(3,4- метилендиоксифенил)индан-2-карбоновая кислота; (1RS, 2RS, 3SR)-5-гидрокси-3-(4-метоксифенил)-1- (3,4-метилендиоксифенил)индан-2-карбоновая кислота; (1RS, 2RS, 3SR)-5-метокси-3-(4-метоксифенил)-1-(3,4 -метилендиоксифенил)индан-2-карбоновая кислота; (1RS, 2SR, 3SR)-1,3-бис(3,4-метилендиоксифенил)-5-5- гидроксииндан-2-карбоновая кислота; (1RS, 2SR,3RS)-3-(2-карбоксиметокси-4-метоксифенил)-1- (3,4-метилендиоксифенил)-5-(проп-1-илокси)-индан-2-карбоновая кислота (1RS, 2SR, 3SR)-3-(2-карбоксиметокси-4-метоксифенил)-1- (2-метокси-4,5-метилендиоксифенил)-5-(проп-1-илокси)-индан-2-карбоновая кислота; (1RS, 2SR, 3RS)-3-2-(1-карбоксиэт-2-илокси)-4-метоксифенил-1- (3,4-метилендиоксифенил)-5-(проп-1-илокси)-индан-2-карбоновая кислота, соль бис-дициклогексиламина; (1RS, 2SR, 3SR)-3-[2-[(E)-2-карбоксиэтен-1-ил-4-метоксифенил] -1-(3,4-метилендиоксифенил)-5-(проп-1-илокси)индан-2-карбоновая кислота; (1RS, 2SR, 3SR)-3-[2-(2-карбоксиэт-1-ил)-4-метоксифенил] -1- (3,4-метилендиоксифенил)-5-(проп-1-илокси)-индан-2 карбоновая кислота; (1RS,2SR,3RS)-3-[2-(3-карбоксифенил)-4-метоксифенил]-1- (3,4-метилендиоксифенил)-5-(проп-1-илокси)индан-2-карбоновая кислота; Данное изобретение дает соединения формулы (I), приведенные выше которые могут быть приготовлены по способу, включающему (a) воздействие соединения формулы (2) где X является C_1-5-алкилом с замещенным бензальдегидом или альдегидом формулы (3) D - CHO где D является Ar или (c), как определено в формуле I, в подходящем растворителе, таком как бензол, с катализатором, таким как пиперидин ацетат, при нагревании до кипения с обратным холодильником с целью получения соединения формулы (4) Циклизация соединения (4) в присутствии подходящей кислоты Льюиса, такой как тетрахлорид титана или хлорид алюминия, или иначе, когда Z₁ является 3-OR (мета) (где R является C_1-5 алкилом, или бензилом), трифторуксусной кислоты, дает инданон формулы (5) Дегидрирование с 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохиноном в соответствующем растворителе или иначе бромирование с пиридин гидробромид пербромидом в дихлорметане с последующей обработкой 1,5-диазабицикло(4.3.0)-нон-5-еном дает инденоны формулы (6) (b) или же иначе, соединение формулы 6, где Z₁, Z₂ и Z₃ являются водородом и может быть приготовлено обработкой 2 бромобензойной кислоты двумя эквивалентами н-бутиллития в растворителе, таком как тетрагидрофуран, в атмосфере аргона при -78^oC с последующим добавлением хлорангидрида кислоты формулы (7) что дает соединение формулы (8) Обработка соединений типа (8) тионил хлоридом при нагревании до кипения с обратным холодильником дает хлорангидрид кислоты, который может быть выделен путем концентрации при пониженном давлении. Этот хлорангидрид кислоты может быть затем обработан диэтил магний малонатом в растворителе, таком как диэтиловый эфир, для получения соединения формулы (9) Реакция соединения типа (9) при нагревании до кипения с обратным холодильником с 5% водным карбонатом натрия дает соединения формулы (10) c) Обработка инденона формулы (11) где Z₁, Z₂, Z₃ и R₁ такие, как определено для формулы I, или группа, преобразуемая в них магнийорганическим соединением формулы (12) R₂(CH₂)_nMgBr, в котором R₂ такой, как определено для формулы I, или группа, преобразуемая в него, в подходящем растворителе при 0^oC: дает соединения формулы (13) Омыление соединений формулы (13) использованием гидроокиси натрия в водном метаноле с последующим восстановлением с триэтилсиланом и бор трифторид эфератом в подходящем растворителе, таком как дихлорметан, при 0^oC приводит к рацемическим соединениям формулы (14) Коньюгированное присоединение нуклеофилов к эфиру, полученному из формулы (14), с последующим омылением приводит к соединениям формулы (I), имеющим R₁₀, отличный от водорода. Повторное восстановление двойной связи в эфире, полученном из таких кислот с последующим коньюгированным присоединением, других нуклеофильных частиц и последующее омыление дает соединения формулы (I), в которых один из R₁₀ заместителей не является водородом.

Восстановление соединений формулы (13) триэтилсиланом и бор трифторид эфератом в подходящем растворителе, таком как дихлорметан, при 0^oC с последующим гидрированием газообразным водородом под давлением приблизительно 60 psi (4.22 кг/см²) в присутствии подходящего катализатора, такого как 10% палладий на активированном угле, дает соединения формулы (15) Алкилирование или ацилирование эфирного энолята, производного от формулы (15), дает соединения, в которых P₁ и P₂ являются такими, как определено для формулы (I).

Иначе, гидрирование соединений формулы (13) газообразным водородом под давлением приблизительно 60 psi в присутствии подходящего катализатора, такого как 10% палладий на активированном угле, в подходящем растворителе, таком как этил ацетат или метанол, содержащем 1-5% уксусной кислоты, дает соединения формулы (15). Обработка этих соединений основанием, таким как гидроокись натрия в подходящем растворителе, таком как водный этанол дает рацемические соединения формулы (16) где Z₁, Z₂ и Z₃ являются водородом; R₁ = R₂; n = 0.

Обработка соединений формулы (13) триэтилсиланом и бор трифторид эфератом в подходящем растворителе, таком как дихлорметан, при 0^oC с последующим взаимодействием с самарий II иодидом в подходящем растворителе, таком как тетрагидрофуран, и затем омылением дает соединения формулы (17) С соответствующими корректировками и защитой любых химических функциональных групп синтезы оставшихся соединений формулы (I) выполняются по методикам, аналогичным приведенным выше, и методикам, описанным в Экспериментальном разделе.

С целью использования соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для лечения людей и других млекопитающих оно обычно составляется в соответствии со стандартной фармацевтической практикой в виде фармацевтической композиции.

Для лечения указанных заболеваний соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли могут назначаться стандартным способом, например орально, парентерально, подъязычно, через кожу, ректально, посредством ингаляции или транбуккальным методом.

Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли, которые активны, когда вводятся орально, могут быть составлены в виде сиропов, таблеток, капсул и лепешек. Технология приготовления лекарственного средства в виде сиропа обычно должна включать суспензию или раствор соединения или его соли в жидком носителе, например этаноле, арахисовом масле, оливковом масле, глицерине или воде с ароматическими добавками и красителями. Когда композиция составлена в форме таблеток, могут быть использованы любые фармацевтические носители, обычно применяемые в технологии приготовления твердых лекарственных препаратов. Примеры таких носителей включают стеарат магния, terra alba, тальк, желатину, агар, пектин, смолу акации, стеариновую кислоту, крахмал, лактозу, сахарозу. Когда композиция используется в форме капсул, подходящими являются любые общепринятые включения в капсулу, например использование вышеупомянутых носителей в твердой желатиновой оболочке капсулы. Когда композиция составляется в форме капсулы с мягкой желатиновой оболочкой, могут рассматриваться любые фармацевтические носители, обычно используемые для приготовления дисперсий или суспензий, например водные камеди, целлюлозы, силикаты или масла, и заключаются в мягкую желатиновую оболочку капсулы.

Типичные парентеральные композиции состоят из раствора или суспензии соединения или соли в стерильном водном или безводном носителе, необязательно содержащем парентерально приемлемое масло, например полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, лецитин, арахисовое масло или кунжутное масло.

Типичные композиции для ингаляции изготавливаются в форме раствора, суспензии или эмульсии, которые могут вводиться как сухой порошок или в форме аэрозоля, использующего общепринятые пропелленты, такие как дихлордифторметан или трихлортрифторметан.

Типичный состав суппозитория включает соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, которые активны при введении таким путем, со связывающим и/или смазывающим агентом, например полимерными гликолями, желатиной, маслом какао или другим растительным воском или жирами или их синтетическими аналогами.

Типичные трансдермальные составы включают обычные водные или безводные наполнители, например пасту, мазь, лосьон или крем, или применяются в форме медицинского пластыря, бляшки или пленки.

Предпочтительно композиции изготавливаются в унифицированной дозировочной форме, например таблетки, капсулы или измеренной аэрозольной дозе, так что пациент может применять их в разовой дозе.

Каждая дозированная единица для орального введения содержит соответственно от 0,1 до 500,0 мг/кг, и предпочтительно от 1 до 100 мг/кг, и каждая дозированная единица для парентерального введения содержит соответственно от 0,1 до 100,0 мг, соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, рассчитанной на свободную кислоту. Каждая дозированная единица введения через нос содержит соответственно 1 - 400 мг, предпочтительно от 10 до 200 мг на индивида. Составы локального применения содержат соответственно от 0,01 до 1,0% соединения формулы (I).

Суточная дозировка, требующаяся для орального введения, составляет соответственно приблизительно от 0,01 до 40,0 мг/кг, соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли в расчете на свободную кислоту. Суточная дозировка, требуемая для парентерального введения, составляет соответственно приблизительно от 0.001 до 40,0 мг/кг соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли в расчете на свободную кислоту.

Суточная дозировка, требуемая для введения через нос или для ротовой ингаляции, составляет соответственно приблизительно от 10 до 500 мг/индивид. Активный ингредиент может вводиться от 1 до 6 раз в день, что достаточно для проявления желаемой активности.

При введении соединений данного изобретения в соответствии с данным изобретением исключаются нежелательные токсикологические эффекты.

Биологическая активность соединений формулы (I) демонстрируется следующими испытаниями.

1. Тест связывания А) Приготовление мембран.

Крысиный мозжечок или кортикальный слой почек быстро извлекали и немедленно замораживали в жидком азоте или использовали свежими. Ткани, 1 - 2 г для мозжечка или 3 - 5 г для кортикального слоя почек, гомогенизировали в 15 мл буфера, содержащего 20 мМ трис HCl и 5 мМ ЭДТА, pH 7,5 при 4^oC, используя механический гомогенизатор. Гомогенаты отфильтровывали через марлю и центрифугировали при 20000 g (об/мин) 10 мин при 4^oC. Супернатант удалили и центрифугировали при 40000 g 30 мин при 4^oC. Полученный в результате осадок ресуспендировали в небольшом объеме буфера, содержащего 50 мМ Трис, 10 мМ Mg Cl₂, pH 7,5; разделили на аликвоты в маленьких сосудах и заморозили в жидком азоте. Препарат мембран разбавили так, чтобы на каждую пробирку количество белка в анализе связывания составило 1 и 5 мг для мозжечка и кортикального слоя почек.

Свежевыделенные мезентериальная артерия и коллатеральное сосудистое ложе крысы промыли ледяным физиологическим раствором и удалили лимфатические узлы вдоль главного сосуда. Затем ткань гомогенизировали, используя политрон в буфере, содержащем 20 мМ Трис и 5 мМ ЭДТА, pH 7,5 при 4^oC в 15 мл объеме для 6 gm мезентериального ложа артерии. Гомогенат пропустили через марлю и центрифугировали при 2000 g 10 мин при 4^oC. Супернатант удалили и центрифугировали при 40000 g 30 мин при 4^oC. Полученный осадок ресуспендировали как объяснено выше для мозжечка и кортикального слоя почек. В экспериментах по связыванию использовали приблизительно 10 мг мембранного белка для каждой пробирки.

В) Протокол ¹²⁵I ET - I связывания.

Связывание ¹²⁵I ET - I с мембранами крысиного мозжечка (2 - 5 мг белка/пробирку) или кортикального слоя почки (3 - 8 мг белка на пробирку) измерили после 60 минут инкубации при 30^oC в буфере 50 мМ Трис HCl, 10 мМ MgCl₂, 0.05% (BSA) бычьего сывороточного альбумина, pH 7.5 в общем объеме 100 мл. Мембранный белок добавляли в пробирки, содержащие или буфер, или указанные концентрации соединений. [¹²⁵I] ET-I (2200 Ci/ммоль) разбавили в том же буфере, содержащем бычий сывороточный альбумин (БСА) так, чтобы получить конечную концентрацию 0,2 - 0,5 нМ ET-I. Общее и неспецифическое связывание измеряли в отсутствии и в присутствии 100 нМ немеченого ET-I. После инкубации реакции гасили 3 мл охлажденного буфера, содержащего 50 мМ Трис и 10 мМ Mg Cl₂, pH 7,5. Связанную с мембранами радиоактивность отделили от свободного лиганда фильтрацией через фильтровальную бумагу Whatman GF/C и промыванием фильтров 5 раз по 3 мл охлажденного буфера, используя устройство для сбора клеток Brandel'a. Фильтры просчитаны в гамма счетчике с эффективностью 75%. IC_50'S для соединений данного изобретения находится в пределах от 0,1 нм до 50,0 мкм.

11. Активность гладкой мускулатуры сосудов in vitro Аорту крысы очистили от соединительной ткани и прилипшего жира и разрезали на кольцевые сегменты приблизительно от 3 до 4 мм длиной. Сосудистые кольца суспендировали в камерах для инкубации органов (10 мл), содержащих бикарбонатный раствор Кребса следующего состава, ммоль: NaCl-112,0; RCl-4,7; KH₂PO₄-1,2; MgSO₄-1,2; CaCl₂-2,5; N₂HCO₃-25,0 и декстроза-11,0. Инкубационные растворы поддерживали при 37^oC и непрерывно аэрировали смесью 95% O₂ и 5% CO₂. Остаточное напряжение аорты поддерживали при 1 г и дали уравновеситься в течение 2 ч, в течение которых инкубационных раствор заменяли каждые 15 - 20 мин. Изометрические напряжения записывали на динографах Beckman'a R-611 с преобразователем силы Grass'a FTO3. Кумулятивные кривые концентрация-ответ на ET-I или других стимуляторов сокращения построили методом постепенного пошагового прибавления стимулятора. Концентрации ET-I увеличивали только после того, как предыдущая концентрация давала в ответ устойчивое сокращение. На каждом кусочке ткани получали только одну кривую концентрация-ответ на ET-I. Антагонисты рецепторов ET добавлялись к парным образцам ткани за 30 мин до начала определения концентрационных кривых ответа на стимуляторы сокращения.

Индуцируемые ET-I сокращения сосудов выражают как процент ответа на 60 мМ KCl для каждой индивидуальной ткани, который определяют в начале каждого эксперимента. Данные выражают как среднее стандартная ошибка среднего (S. E.M.). Конденсаты диссоциации (Kb) конкурентных антагонистов определили стандартным методом Arunlakshana u Schild'a. Действующий диапазон для соединений данного изобретения находится в пределах от 0,1 нМ до 50,0 мкм.

Следующие примеры являются иллюстративными и не ограничивают соединения данного изобретения.

Пример 1.

(1RS,2RS,3SR)-1-(4-Метоксифенил)-3-фенилиндан-2-карбоновая кислота.

а) Этил(1RS)[1-Гидрокси-1-(4-метоксифенил)]-3-фенилиден-2- карбоксилат.

К сухой магниевой стружке (0.88 г, 36 ммоль) в атмосфере аргона добавили порциями раствор п-броманизола (4.5 мл, 36 ммоль) в 5% ТГФ/Et₂O (37 мл). Полученный раствор п-метоксифенил магний бромида добавили к раствору этил 1-оксо-3-фенил-инден-2-карбоксилата (5.0 г, 18 ммоль) в Et₂O (300 мл) в атмосфере аргона при 0^oC. Полученной смеси дали нагреться до комнатной температуры и перемешивали 10 мин. Смесь распределялась между 3М HCl (100 мл) EtOAc (200 мл). Органический экстракт последовательно промыли водой, водным NaHCO₃, H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили (Na₂SO₄). Растворитель удалили при пониженном давлении для получения желтого масла, которое обработали Et₂O/гексан. Образовавшийся твердый продукт собрали путем фильтрации (3.47 г). Фильтрат сконцентрировали при пониженном давлении и очистили мгновенной хроматографией. Материал, который был изолирован, обработали Et₂O/гексан, и образовавшийся дополнительный твердый продукт (1.76 г, 75% общего выхода) собрали путем фильтрации с целью получения названного в заглавии соединения.

в) этил (RS)-1-(4-Метоксифенил)-3-фенилинден-2-карбоксилат.

К раствору этил (1RS) [1-гидрокси-1-(4-метоксифенил)]-3- фенилинден-2 карбоксилата (4,65 г, 12,0 ммоля) в CH₂Cl₂ (40 мл) при 0^oC в атмосфере аргона добавили триэтилсилан (2.34 мл, 14.6 ммоль), и впоследствии - бор трифторид эферат (8.8 мл, 71 ммоль). Реакционной смеси дали нагреться до комнатной температуры и перемешивали 10 мин, медленно добавив за это время 3М HCl (50 мл). Смесь экстрагировали EtOAc (150 мл). Органический экстракт последовательно промыли водой, водным N₂HCO₃, H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили. Растворитель удалили при пониженном давлении и остаток очистили мгновенной хроматографией на силикагеле, элюируя 10% EtOAc/гексан для получения названного в заглавии соединения (4.2 г, 95%) в виде смеси 1 и 2 изомеров двойной связи.

с) Этил (1RS,2SR,3SR)-1-(4-Метоксифенил)-3-фенилиндан-2- карбоксилат.

К раствору этил (RS)-1-(4-метоксифенил)-3-фенилинден-2- карбоксилата (5.75 г, 15 ммоль) в EtOAc (150 мл) добавили 5% палладий на активированном углероде (600 мг). Полученную суспензию перемешивали в атмосфере H₂ 1 день, затем профильтровывали через слой Целита. Фильтрат сконцентрировали при пониженном давлении, что дало названное в заглавии соединение, которое использовали без дополнительной очистки.

d) (1RS,2RS,3-SR)-1-(4-Метоксифенил)-3-фенилиндан-2- карбоновая кислота.

К раствору этил (1RS, 2SR, 2SR)-1-(4-метоксифенил)-3-фенилиндан -2-карбоксилата, (5,5 г, 14.8 ммоля) в EtOH (70 мл) добавили 5H NaOH (9 мл, 45 ммоль). Полученную смесь перемешивали в атмосфере аргона 1 день, добавили за это время H₂O (70 мл). Смесь сконцентрировали при пониженном давлении. Водный остаток экстрагировали Et₂O и Et₂O - экстракты отбросили. Водную фазу подкислили 6М HCl и экстрагировали несколько раз EtOAc. Объединенные EtOAc экстракты промыли последовательно водой и насыщенным водным NaCl и высушили. Растворитель удалили при пониженном давлении для получения маслянистого остатка, кристаллизовавшегося при стоянии. Твердый продукт перекристаллизовывался из EtOAc/гексан, получив названное в заглавии соединение (4.25 г, 83%); Т.пл. 164 - 166^oC.

Здесь и далее: в спектре ПМР ¹H-ЯМР m - мультиплет, d - дуплет, s - синглет, t - триплет, dd - двойной дуплет, br - уширенный, apparent - кажущийся, sextet - секстет, dt - двойной триплет, В данных элемент. анализа: Calc. - рассчитано, Found - найдено В данных масс-спекрометрия: (exact mass) - точная масса ¹H NMP (CDCl₃): 7.35 - 7.18 (m, 9H); 6,92 - 6.88 (m, 4H), 4,68 (d, 1H, J = 10 H_Z); 4,64 (d, 1H, J = 10 H_Z); 3.81 (S, 3H); 3.34 (t, 1H, J = 10 H_Z).

M: 345 [(M + H)⁺].

Anal. CaIc. C₂₃H₂₀O₃: C, 80.21; H, 5.85.

C, 80,21; H 6,03.

Пример 2. (транс, транс)-1,3, -ди(4-Метоксифенил)-индан-2- карбоновая кислота.

a) Этил-2-Бензоил-3-(4-гидроксифенил)пропеонат.

К раствору 4-гидроксибензальдегида (31,7 г, 0.26 ммоль) и этил бензоилацетата (45.5 мл, 0.26 ммоль) в EtOH (45 мл) в атмосфере аргона добавили пиперидин (2.6 мл, 0.026 ммоль) и уксусную кислоту (3 капли). После перемешивания в течение ночи при комнатной температуре, полученную твердую смесь обрабатывали горячим EtOH (700 мл) и затем дали охладиться. Образовавшиеся кристаллы собрали фильтрацией, получив названное в заглавии соединение (61.0 г, 79%).

b) Этил (2RS,3SR)-3-(4-Гидроксифенил)-1-оксоиндан-2- карбоксилат.

К смеси этил 2-бензоил-3-(4-гидроксифенил)пропеоната (0.50 г, 1.7 ммоль) в CH₂Cl₂ (15 мл) при 0^oC в атмосфере аргона добавили титан тетрахлорид (0,93 мл, 8.3 ммоль). Полученной смеси дали перемешаться в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию медленно прекратили добавлением 3М охлажденной HCl, затем реакционную смесь распределили между EtOAc (50 мл) и 3М HCl. Водную фазу экстрагировали EtOAc, и объединенные органические экстракты промыли последовательно H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили (Na₂SO₄). Растворитель удалили при пониженном давлении, и твердый остаток перекристаллизовали из EtOAc/гексан для получения названного в заглавии соединения (410 мг, 82%).

c) Этил (2RS, 3SR)-3-(4-Бутилдиметилсилоксифенил)-1-оксоиндан -2-карбоксилат.

К раствору этил (2RS,3SR)-3-(4-гидроксифенил)-1-оксоиндан-2- карбоксилата (3.0 г, 10.2 ммоль) в ДМФ (10 мл) в атмосфере аргона добавили имидазол (1.72 г, 25.3 ммоль) и т-бутилдиметилхлоро-силан (1.82 г, 12.1 ммоль). Полученной смеси дали перемешиваться 3 дня при комнатной температуре, затем вылили в разбавленную водную HCl и экстрагировали EtOAc (2х). Объединенные органические экстракты промыли последовательно H₂O, водным NaHCO₃, H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили. Растворитель удалили при пониженном давлении для получения названного в заглавии соединения (5,40 г), которое использовали без дальнейшей очистки.

d) Этил 3-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-1-оксоинден-2 -карбоксилат.

К раствору этил (2RS,3SR)-3-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-1- оксоиндан-2-карбоксилата (130 мг, 0.32 ммоль) в CH₂Cl₂ (3 мл) в атмосфере аргона добавили 2,3-дихлоро-5,6-дициано-1,4- бензохинон (80 мг, 0,35 ммоля). Полученную смесь перемешивали 2,5 часа. Добавили водный NaHSO₃ и EtOAc, и смесь перемешивали 5 мин. Водную фазу отделили и экстрагировали EtOAc, и объединенные органические экстракты промыли последовательно водным NaHCO₃, H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили. Растворитель удалили при пониженном давлении и остаток очистили мгновенной хроматографией на силикагеле с целью получения названного в заглавии соединения (110 мг, 85%).

e) Этил (1RS)-3-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-1-гидрокси-1- (4-метоксифенил)инден-2-карбоксилат.

К сухой магниевой стружке (119 мг, 4.9 ммоль) в атмосфере аргона порциями добавляли раствор п-бромоанизола (0,61 мл, 4.9 ммоль) в 9:1 Et₂O/ТГФ (10 мл). Полученный раствор п-метоксифенил магний бромида добавили к раствору этил 3-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-1-оксоинден-2-карбоксилата (1.00 г, 2.5 ммоль) в Et₂O (60 мл) в атмосфере аргона при 0^oC. Полученной смеси дали нагреться до комнатной температуры и перемешали в течение 5 мин. Смесь распределили между 3М HCl и EtOAc. Органический экстракт промыли последовательно H₂O, водным NaHCO₃, H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили. Растворитель удалили при пониженном давлении с целью получения указанного в заглавии соединения (1.47 г), которое использовали без дальнейшей очистки.

f) Этил (RS)-1-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-3- (4-метоксифенил)инден-2-карбоксилат.

К раствору этил (1RS)-3-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-1-гидрокси -1-(4-метоксифенил)инден-2-карбоксилата (2,5 ммоль, приготовленного выше) в CH₂Cl₂ (10 мл) при 0^oC в атмосфере аргона добавили триэтилсилан (0.48 мл, 3.0 ммоль), и впоследствии бор трифторид эферат (1.8 мл, 14.6 ммоль). Реакционной смеси дали нагреваться до комнатной температуры и перемешивали 10 мин, добавляя медленно за это время 3М HCl. Смесь экстрагировали EtOAc. Органический экстракт промыли последовательно H₂O, водным NaHCO₃, H₂O и насыщенным водным NaCl и высушили. Растворитель удалили при пониженном давлении и остаток очистили мгновенной хроматографией на силикагеле, элюируя 15% Et₂O/гексан с целью получения названного в заглавии соединения в виде смеси 1 и 2 изомеров двойной связи (820 мг, 67% для двух ступеней).

g) Этил (1RS, 2SR,3SR)-1-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-3- (4-метоксифенил)индан-2-карбоксилат.

К раствору этил (RS)-3-(4-т-бутилдиметилсилоксифенил)-1- (4-метоксифенил)инден-2-карбоксилата (смесь 1 и