Пептид или его органические или неорганические соли, способ получения, фармацевтическая композиция, способы стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови

Пептид или его органические или неорганические соли, способ получения, фармацевтическая композиция, способы стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови

Реферат

 

Изобретние относится к новым пептидам формулы 1, где А₁, А₂, А₅, С₁, С₂, C₃ представляют собой различные аминокислотные остатки или (низший алкил) замещенные остатки аминокарбоновых кислот, определенные в п.1 формулы изобретения. Раскрыты также их соли, способ получения, фармацевтическая композиция на основе пептидов, а также способ стимулирования высвобождения гормона роста и увеличения его содержания в крови. Соединения фopмулы 1 могут быть использованы в терапевтических целях для лечения заболеваний, где необходимо повышение уровней гормона роста, а также для увеличения надоев молока и повышения массы тела у животных. 5 с. и 14 з.п. ф-лы, 7 табл., 3 ил.

А₁ - А₂ - С₁ - С₂ - C₃ - А₅ (1)

Настоящее изобретение относится к новым полипептидным соединениям, которые при введение их животным, а предпочтительно человеку, стимулируют высвобождение гормона роста. В другом своем варианте, настоящее изобретение относится к способам стимулирования высвобождения гормона роста и повышения его уровней у животных путем введения этим животным указанных полипептидных соединений, высвобождающих гормон роста.

Повышение уровней гормона роста (ГР) у животных, например у млекопитающих (включая человека), после введения этим животным соединений, высвобождающих гормон роста, может привести к увеличению массы тела и к повышению молочной продуктивности в случае, если введение указанных соединений способствует достаточному увеличению ГР - уровней. Кроме того, известно, что повышение уровней гормона роста у млекопитающих и человека может быть продуцировано путем введения известных агентов, высвобождающих гормон роста, например, таких как натуральные рилизинг-факторы ростового гормона.

Повышение уровней гормона роста у млекопитающих может быть также вызвано путем введения этим млекопитающим пептидов, высвобождающих ГР, некоторые из которых были ранее описаны в литературе, например в патентах США N 4 223 019, 4 223 020, 4 223 021, 4 224 316, 4 226 857, 4 228 155, 4 228 156, 4 228 157, 4 228 158, 4 410 512, 4 410 513.

Для повышения ГР - уровней были также использованы антитела против эндогенного ингибитора высвобождения гормона роста, соматостатина (SR1 - фактор, или SR 1F). В этом случае, ГР - уровни повышают путем удаления эндогенного ингибитора ГР - высвобождения (SR1F) до того, как этот ингибитор достигнет гипофиза, где он подавляет выделение ГР.

В каждом из этих методов, направленных на увеличение уровней гормона роста, используются материалы, синтез и/или выделение которых со степенью чистоты, достаточной для последующего введения целевому животному, являются слишком дорогостоящими процедурами. Поэтому было бы желательно получить короткоцепочечные, низкомолекулярные и относительно простые полипептиды, которые обладали бы способностью стимулировать высвобождение гормона роста, и которые были бы относительно недорогостоящими, то есть они должны быть легко и без особых затрат синтезируемыми, легко химически и/или физически модифицируемыми, легко поддаваться очистке и введению в фармацевтические композиции, а также они должны обладать прекрасными транспортными свойствами.

Хотя специалистам известны некоторые короткоцепочечные полипептиды, которые способны стимулировать высвобождение гормона роста и повышение его уровней в крови (например, такие как полипептид His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂, описанный в патенте США 4 410 512), но по разным причинам, например, для улучшения доставки к тканям, улучшения биологической усвояемости, для повышение времени удержания и т.п. Очень важно, чтобы данные полипептиды обладали бы способностью к конструированию. Однако замена аминокислот в некоторых положениях может весьма неблагоприятно отразиться на способность такого короткоцепочечного пептида к стимулированию высвобождения гормона роста.

Поэтому, было бы желательно получить другие короткоцепочечные полипептиды, которые были бы способны стимулировать высвобождение гормонов роста и повышение их уровня в крови животного, а в частности, человека. Было бы также желательно использовать такие полипептиды в целях стимулирования высвобождения и/или повышения уровней гормона роста в крови человека и животных.

Кроме того, было бы желательно разработать методы стимуляции высвобождения гормона роста и/или повышения его уровня в крови животных, используя при этом указанные полипептиды с короткой цепью.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть определены следующей формулой: A₁-A₂-C₁-C₂-C₃-A₅, где: A₁ представляет собой Cly, DAla, -Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, N-(низший алкил) - аминокарбоновую кислоту, N,N-бис(низший алкил)аминокарбоновую кислоту, азолкарбоновую кислоту, или (низший алкил)аминокарбоновую кислоту, где низшая алкильная группа имеет прямую цепь, содержащую 2-10 атомов углерода. При этом предпочтительно если A₁ является DAla.

A₂ представляет собой DTrp, DNal, D-4-Y-Phe или 5-Y-D-Trp, где Y является OH, Cl, Br, F или H. Предпочтительно если A₂ является DNal. A₅ представляет собой A₃-A₄-A_5', A₃-A_5' или A_5'.

Предпочтительно если A₅ является A_5'. A₃ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro или des Ala. A₄ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro, (линейный низший алкил)аминокарбоновую кислоту, или des Ala. A₅ представляет собой Lys(-R₁,R₂)-Z, Orn (-R₁,R₂)-Z, NH(CH₂)_xN(R₃, R₄). A_5' может быть также Lys-Z, Orn-Z или Arg-Z, если A₁ не является His. R₁ представляет собой линейную низшую группу или атом водорода. R₂ представляет собой линейную алкильную группу водорода. Если R₁ является атомом водорода, то R₂ не является атомом водорода; и аналогично, если R₂ является атомом водорода, то R₁ не является атомом водорода. R₃ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом водорода. Указанная низшая алкильная группа содержит прямую цепь с 2-10 атомами углерода. Z представляет собой NH (линейную низшую алкильную группу), N (линейную низшую алкильную группу)₂, O - (линейную низшую алкильную группу), NH₂ или OH, где линейная низшая алкильная группа является такой, как она была определена выше. "x" представляет собой число от 2 до 15. C₁ является Ala. C₂ является Trp, Phe, или Ch xAla. Предпочтительно, если C₂ является Trp или Phe, а более предпочтительно Trp. C₃ является DPhe, DPal или DCh x Ala. Предпочтительно если C₃ является DPhe.

Указанные полипептиды могут быть также получены в виде органических или неорганических аддитивных солей. Предпочтительным полипептидом является: A₁-A_{2 (2-апр-1999)2}-DPhe-A₅, а более предпочтительными является полипептид: A₁-A₂-Ala-Trp-DPhe-A₅.

Краткое описание рисунков На фиг. 1 представлена серия графиков, иллюстрирующая зависимость уровней гормона роста в сыворотке человека от времени.

Авторами настоящей заявки были получены новые полипептиды с короткой цепью, которые стимулируют высвобождение гормона роста и повышение его уровней в крови животных. Эти полипептиды могут быть определены следующей формулой: A₁-A₂-Ala-Trp-DPhe-A₅, где A₁ представляет собой Gly, -Ala, His, Ser, Met, Pro, Sar, Ava, Aib, имидазолуксусную кислоту, N-(низший алкил)аминокарбоновую кислоту, N,N-бис(низший алкил)аминокарбоновую кислоту, азолкарбоновую кислоту, или (низший алкил) карбоновую кислоту, где низшая алкильная группа имеет прямую цепь с 2-10 атомами углерода. Предпочтительно если низшая алкильная группа является прямой и имеет 2-6 атомов углерода. Указанная низшая алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Предпочтительными заместителями являются O, N, или Si. Предпочтительно если низшая алкильная группа является незамещенной. Предпочтительной азолкарбоновой кислотой является N -4-имидазолуксусная кислота (IMA). A₁ предпочтительно является Gle, DAla или His, более предпочтительно His или DAla, а наиболее предпочтительно DAla.

A₂ представляет собой DTrp, DNal, D-4-Y-Phe- или 5-Y-D-Trp, где Y является OH, Cl, Br, F или H. A₂ предпочтительно является DNal, D-4-Y-Phe или 5-Y-D-Trp, а более предпочтительно DNal. Y предпочтительно является OH или H.

A₅ представляет собой A₃-A₄-A_5', A₃-A_5', A₄-A_5', или A_5'. Предпочтительно если A₅ является A_5'. A₃ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro или desAla. A₄ представляет собой Ala, Gly, DAla, Pro, (линейный низший алкил) аминокарбоновую кислоту, или desAla; а A₅ представляет собой Lys(-R₁,R₂)-Z, Orn(-R₁,R₂)- Z, LArg (g - R₅ - R₆), NH(CH₂)_xN(R₃, R₄). A_5' может быть также Lys-Z, Orn-Z или Arg-Z, в том случае, если A₁ не является His. R₁ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом водорода. Если R₁ является H, то R₂ не является H; и аналогично, если R₂ является H, то R₁ не является H. R₃ представляет собой линейную низшую алкильную группу или атом H. R₄ представляет собой линейную алкильную группу или атом водорода. R₅ и R₆ являются линейными низшими алкильными группами. Указанная низшая алкильная группа состоит из прямой цепи, имеющей от 2 до около 10 атомов углерода. Предпочтительно если эта алкильная группа имеет прямую цепь с 2-6 атомами углерода. Причем, указанная низшая алкильная группа может быть замещенной или незамещенной. Предпочтительными заместителями являются O, N, или Si. Предпочтительно если указанная низшая алкильная группа является незамещенной. "g" - гуанидино. Z - NH (линейная низшая алкильная группа), N (линейная низшая алкильная группа)₂, O (линейная низшая алкильная группа), NH₂ или OH, где линейная низшая алкильная группа является такой, как она была определена выше. "x" является числом от 2 до 15, предпочтительно 2 - 6. A₅ является предпочтительно Lys - NH₂. Рассматриваемые полипептиды могут быть также получены в виде органических или неорганических аддитивных солей.

В соответствии со стандартной номенклатурой пептидов, используемые в настоящем описании аббревиатуры аминокислотных остатков имеют следующие значения: Gly - Глицин Tyr - L - Тирозин Ile - L - Изолейцин Glu - L - Глутаминовая кислота Thr - L - Треонин Phe - L - Фенилаланин Ala - L - Аланин Lys - L - Лизин Asp - L - Аспарагиновая кислота Cys - L - Цистеин Arg - L - Аргинин Ava - Аминовалерьяновая кислота Aib - Аминоизомасляная кислота Gln - L - Глутамин Pro - L - Пролин Leu - L - Лейцин Met - L - Метионин Ser - L - Серин Asn - L - Аспарагин His - L - Гистидин Trp - L - Триптофан Val - L - Валин DOPA - 3,4-Дигидроксифенилаланин Met(O) - Метионинсульфоксид Abu - - Аминомасляная кислота iLys - N- Изопропил - L - лизин 4-Abu - 4-аминомасляная кислота Orn - L - Орнитин DNal - -Нафтил-D-Аланин DNal - -Нафтил-D-Аланин Sar - Саркозин LArg - гомоаргинин Chx - циклогексил ChxAla - L-циклогексилаланин DChxAla - D-циклогексилаланин IMA - N-имидазолуксусная кислота Tcc - 1,2,3,4-тетрагидро-7-каролин-3-карбоновая кислота Tic - 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота Tip - 4,5,6,7-тетрагидро-IH-имидазо[e]-6-карбоновая кислота ,ABU - альфа, гамма-аминомасляная кислота DPal - D-3-пиридилаланин Во всех обозначениях аминокислот, где трехбуквенной аббревиатуре предшествует буква "D", эта буква указывает на D-конфигурацию аминокислотного остатка, а глицин относится к аминокислотам, определяемым термином "натуральные L-аминокислоты".

В этих короткоцепочечных полипептидах имеются некоторые положения, которые, по сравнению с другими, являются более толерантными к замене аминокислот, то есть в этих положениях замена аминокислот не оказывает неблагоприятного воздействия на способность полипептида к стимулированию высвобождения гормона роста и/или повышению его уровней в крови животных. К таким положениям относится, например, положение A₅. Другие положения являются менее толерантными к таким изменениям, например, средние аминокислотные остатки Ala, Trp, DPhe, обозначенные C₁, C₂ и C₃ соответственно. Ранее предполагалось, что A₁ и A₂ должны присутствовать в L- и D-форме соответственно и что Trp и DPhe должны быть в L- и D-форме, составляющей LD LD - ряды. Однако авторами настоящей заявки было обнаружено, что LD LD - последовательность может быть DD LD - последовательностью. Таким образом, было неожиданно обнаружено, что полипептид формулы A₁-A₂-C₁-C₂-C₃-A₅, где A₁, A₂, A₅ являются такими, как они были определены выше; C₁ является Ala; C₂ является Trp, Phe, и CDxAla; а C₃ является DPhe, DPal, или DChxAla, обладает способностью стимулировать высвобождение гормона роста и/или повышение его уровней в крови животного.

Предпочтительно если C₂ является Trp или Phe, а более предпочтительно Trp.

C₃ является предпочтительно DPhe. Если C₂ является ChxAla, то C₃ предпочтительно является DPhe. Если C₃ является DPal, то Z предпочтительно является OH.

Повышенная гибкость в выборе основных, нейтральных или кислотных аминокислотных остатков и L - и D-форм, который может быть осуществлен для аминокислот A₁, A₂, A₃, A₄, A₅,C₂ и C₃, дает большие возможности для регулирования физиологических свойств нужного пептида.

Хотя DAla -DNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ и DAla -DNal- Ala-Phe-DPhe-Lys-NH₂ имеют аналогичную активность в отношении ГР - высвобождения, однако замена остатка Trp остатком Phe может способствовать повышению химической стабильности DAla -DNal- Ala-Phe-DPhe-Lys-NH₂, поскольку Trp является более восприимчивым к окислению, чем Phe. Кроме того, замена Trp на Phe будет придавать пептиду большую гидрофобность, и это качество вместе с вышеуказанной химической стабильностью будет определять физико-химические свойства пептида, которые могут оказаться предпочтительными для повышения абсорбции пептида, а также для составления пероральных, трансдермальных и/или назальных препаратов, содержащих указанный пептид. Кроме того, величины ED₅₀ (50%-ная эффективная доза) в гистаминовом анализе (с использованием крысиных клеток) DAla -DNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ и DAla -DNal- Ala-Phe-Dphe-Lys-NH₂ являются одинаковыми, т.е. 30,50,5 и 30,80,3 мкг/мл, указывают на более высокую гистаминовую активность по сравнению с гистаминовой активностью пептида Ala-His -DNal- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂, для которого это значение составляет 11,01,0 мкг/мл. Пептиды с меньшей гистамин-высвобождающей активностью (выше ED₅₀) могут быть клинически более эффективными, поскольку они будут в меньшей степени продуцировать неблагоприятную местную реакцию при их инъецировании, и/или они будут в меньшей степени продуцировать клинически неблагоприятное системное антигенное действие.

Вышеуказанная гибкость в выборе аминокислотных остатков дает также важное преимущество в отношении составления лекарственных средств, содержащих данные пептиды, и доставки этих пептидов к любым участкам организма. Проводимые замены аминокислот могут также способствовать улучшению пероральной абсорбции, метаболизма и экскреции пептидов. Например, по своей способности к высвобождения гормона роста у человека пептид Ala-His -DNal- Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂(GHR P-1) является более эффективным, чем пептид Ala-His-DTrp-Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂. Однако при пероральном введении пептид DAla -DNal- Ala-Trp-Dphe-Lys-NH₂ (GHR P-2) является более эффективным, чем GHRP-1. См. , например, чертеж, который иллюстрирует уровни гормона роста в сыворотке нормального молодого человека в зависимости от времени после введения 300 мкг/кг GHRP-1 40 индивидуумам (график 1-1 (о)), 600 мкг/кг GHR P-1 39 индивидуумам (график 1-2()), и 100 мкг/кг GHR P-2 11 индивидуумам (график 1-3 ()).В этих исследованиях нормальным молодым людям в возрасте 25 лет вводили GHRP сначала в 20 мл H₂O, затем 100 мл H₂O. Пробы крови брали в соответствии со схемой, показанной на диаграмме. Уровни ГР определяли с помощью радиоиммуноанализа.

Предполагается также, что поскольку в этих пептидах ароматические боковые цепи могут быть также элиминированы в некоторых положениях, где они, как считалось ранее, были необходимы и что D - аминокислотный остаток должен быть биологически более защищен, чем остаток в L - форме, то могут быть использованы некоторые пептиды с большей защитой и меньшими массами для того, чтобы посредством последующего конструирования полипептида можно было бы придать этому полипептиду улучшенные свойства, такие как назальная, пероральная и трансдермальная абсорбция, in vivo - стабильность, и т.п.

Группы R₁, R₂, R₃, R₄ и Z могут варьироваться, и тем самым обеспечивать дополнительный контроль физико-химических свойств нужного соединения. Поэтому можно получить пептид с повышенной способностью доставки к конкретному рецептору и в конкретном хозяине.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительными ГР - высвобождающими соединениями являются A₁-A₂-Ala-Trp-DPhe-A_5', или органические или неорганические аддитивные соли любых полипептидов, где A₁, A₂ и A_5' являются такими, как они были определены выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемый ГР - высвобождающий пептид имеет формулу: DAla-A₂-Ala-Trp-DPhe-A_5', или его органические или неорганические аддитивные соли. Предпочтительными пептидами являются члены следующей группы соединений: DAla -DNal- Ala-Trp-DPhr-Lys NH₂ DAla -DNal- Ala-Trp-DPhe -Lys(-iPr)NH₂ DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe -Lys(-iPr) NH₂ DAla-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys NH₂ DAla -DNal- Ala-Trp-DPhe-NH(CH₂)₅NH₂ NH₂(CH₂)₅CO -D- Nal-Ala-Trp-D-Phe-NH(CH₂)₅NH₂, а также их органические или неорганические аддитивные соли.

Эти соединения являются наиболее предпочтительными, поскольку указанные полипептиды с более короткой цепью являются экономически более выгодными для синтеза, и обладают при этом высокой степенью способности стимулировать увеличение уровней гормона роста в крови.

Другими предпочтительными пептидами являются пептиды формулы A₁-A₂-Ala-Phe-DPhe-A₅. Предпочтительными членами этой группы соединений являются соединения, в которых A₁ представляет собой NIMA,ABU, DAla, His, Ala, или ABU; A₂ представляет собой DNal или DPhe, а A₅ представляет собой LysNH₂, LysNH₂, ArgNH₂, NH-Chx-NH₂ (1,4 Chx - диамин) или Lys EA.

Например: NIMa-DNal- Ala-Phe-DPhe-LysNH₂, , ABU-DNal- Ala-Phe-DPhe-LysNH₂, DAla-DPhe-Ala-Phe-DPhe-LysNH₂, Ala-His-DNal- Ala-Phe-DPhe-LysNH₂, NIMA-DNal- Ala-Phe-DPhe-NH-Chx-NH₂, ,ABU-DNal- ALa-Phe-DPhe-NH-Chx-NH₂, DAla -DNal- Ala-Phe-DPhe-Lys EA, DAla -DNal- Ala-Phe-DPhe-Arg NH₂, а также их органические или неорганические соли.

В другом своем варианте настоящее изобретение включает в себя полипептиды формулы: A₁-A₂-C₁-C₂-C₃-A₅, где C₁ является Ala; C₂ является Trp, Phe или ChxAla; C₃ является DPhe или DChxAla, A₁ является предпочтительно DAla. A₂ является предпочтительно DNal. Например: DAla -DNal- Ala-ChxAla-DPhe-Lys NH₂, DAla -DNal- Ala-Phe-DChxAla-Lys NH₂, DAla -DNal- Ala-ChxAla-DChxAla-Lys NH₂, а также их органические или неорганические аддитивные соли.

Описанные выше соединения могут быть легко синтезированы, являются высокоэффективными стимуляторами повышения уровней гормона роста в сыворотке, и обладают достаточно хорошими свойствами, облегчающими их промышленное производство и использование. Кроме того, указанные соединения могут иметь физиохимические свойства, которые являются предпочтительными для эффективной пероральной, назальной и пролонгированной доставки таких полипептидных соединений широкому ряду животных с использованием конкретных химических/механических методов; причем, указанные структурно пластичные полипептиды могут быть наделены вышеописанными физиохимическими свойствами посредством различных замещений в ряде положений полипептида и посредством выбора полярной, нейтральной или неполярной природы C-концевых и центральных положений данного полипептида.

Пептиды настоящего изобретения могут быть использованы в терапевтических целях в том случае, где необходимо повышение уровней гормона роста, например, для лечения таких заболеваний, как гипофизарный инфантилизм, остеопороз, ожоги, острая почечная недостаточность, несращиваемые переломы кости и для более быстрого заживления ран. Кроме того, эти полипептиды могут быть использованы для ускорения выздоровления после хирургической операции, а также при истощении после острого/хронического заболевания. Поскольку указанные полипептиды обладают анаболическим действием на кожу, мускулы и кости и одновременно способствуют уменьшению содержания жира в организме, то они могут быть с успехом использованы для предотвращения процессов старения организма. Эти пептиды могут быть также использованы при лечении пациентов, страдающих раковыми заболеваниями, например, для предупреждения и/или кахексии у этих пациентов. Указанные способы лечения могут быть проведены с использованием терапевтически эффективного количества пептида. Таким количеством является количество, необходимое для стимулирования высвобождения нужного уровня гормона роста, как обсуждалось выше.

Соединения настоящего изобретения могут быть также использованы для увеличения ГР - уровней в крови у животных; для увеличения надоев молока у коров; для повышения массы тела у животных, например, у млекопитающих (таких как человек, овцы, бычки и свиньи), у рыб, домашней птицы, а также у других позвоночных и ракообразных; и для усиления роста шерсти и/или меха у млекопитающих. Количество прироста массы тела зависит от пола и возраста животных, от дозы и природы вводимых ГР - высвобождающих соединений, от способа введения, и т.п. Соединения настоящего изобретения также способствуют увеличению уровней ГР в сыворотке человека; ускорению роста у детей маленького роста; снижению количества жира в организме; улучшению метаболизма белка у детей, и кроме того, улучшению белкового метаболизма кожи, мускул, кости при одновременном снижении содержания жира у пожилых людей, особенно при дефиците в организме гормона роста.

Рассматриваемые пептиды могут быть также использованы для улучшения состава липидов в организме человека путем снижения уровня холестерина и липопротеина низкой плотности в сыворотке, и увеличения количества сывороточного липопротеина высокой плотности.

Новые полипептидные соединения настоящего изобретения могут быть синтезированы стандартными методами твердофазной пептидной химии, или классическими методами, хорошо известными специалистам.

Для синтеза пептидных амидов твердофазный синтез предпочтительно начинать с C-конца пептида. Подходящий исходный материал может быть получен, например, путем связывания нужной защищенной альфа-аминокислоты с хлорометилированным полимером, гидроксиметиловым полимером, бензгидриламиновым (ВНА) полимером или пара-метил-бензгидриламиновым (p-Me-BHA) полимером. Один из таких полимеров, например хлорометиловый полимер, продается под торговой маркой BIOBEADS SX-1 (Bio Rad Laboratories, Richmond, California). Получение гидроксиметилового полимера описано Bodansky и др., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966). BHA-полимер описан Pietta и Marshall, Chem. Comm. 650 (1970), и являются коммерческим продуктом, поставляемым Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, California.

После первоначального связывания альфа-амино-защитная группа может быть удалена с помощью кислотного реагента, например раствора трифтороуксусной кислоты (TFA) или соляной кислоты (HCl), в органических растворителях при комнатной температуре. После удаления -амино-защитной группы, оставшиеся защищенные аминокислоты могут быть поэтапно присоединены в нужном порядке. Каждая защищенная аминокислота может быть подвергнута реакции (например в 3-кратном избытке) с использованием соответствующего активатора карбоксильной группы, такого как дициклогексилкарбодиимид (DCC) или диизопропилкарбодиимид (DIC) в растворе, например, в метиленхлориде (CH₂Cl₂) или диметилформамиде (ДМФ), или в их смеси.

После получения нужной аминокислотной последовательности синтезированный пептид может быть отщеплен от бензгидриламиновой полимерной подложки посредством обработки соответствующим реагентом, таким как фторводород (HF), который не только отщепляет пептид от полимера, но и также отщепляет наиболее часто используемые боковые защитные группы. В случае использования хлорометилового или гидроксиметилового полимера обработка фторводородом приводит к образованию свободной кислоты пептида. Однако, из этих пептидных полимеров могут быть легко получены сложные эфиры и алкиламиды этих пептидов посредством гидролиза соответствующим алкиламином, диалкиламином или диаминоалканом, либо посредством переэтерификации с использованием спирта с высоким pH.

Процедура твердофазного синтеза хорошо известна специалистам и описана Stewart и Young, Solid Phase Peptide Syntesis: 2-ое изд. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL 1984).

Некоторые из хорошо известных методов синтеза в растворе, которые могут быть использованы для синтеза частей пептида настоящего изобретения, описаны Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2-ое изд., John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976.

Очевидно, что наиболее предпочтительным синтезом пептидов является синтез в жидкой фазе, который предусматривает реакцию конденсации по крайней мере двух пептидных фрагментов.

Этот метод включает в себя конденсацию пептидного фрагмента X-A₁-Y с пептидным фрагментом U-V-W, где все аминокислотные боковые цепи, за исключением A₁, являются нейтральными или защищенными, а X представляет собой Prot, где Prot является N-концевой защитной группой; Y представляет собой A₂-Q, Ala-A₂-Q, A₂-Ala-Q, Ala-A₂-Ala-Q, A₂-Ala-Trp-Q, Ala-A₂-Ala-Trp-Q, Ala-Q или -Q, где Y является Q; U является J-A₂-Ala-Trp, или J-Ala-A₂-Ala-Trp. Если Y является Ala-Q, то U является J-A₂-Ala-Trp. Если Y является A₂-Q или Ala-A₂-Q, то U является J-Ala-Trp. Если Y является A₂-Ala-Trp-Q или Ala-A₂-Ala-Trp-Q, то U является J. V представляет собой A₅ или Z. Если V является A₅, то W является Z. Если V является Z, то W отсутствует. A₁, A₂, A₅ и Z являются такими, как они определены выше.

Q представляет собой карбоксиконец пептидного фрагмента и является /OR³ или -M, где M представляет собой часть, которая может быть заменена азотсодержащим нуклеофилом, а R³ представляет собой алкильную группу, содержащую от 1 до около 10 атомов углерода; арильную группу, имеющую от 6 до около 12 атомов углерода; или арилалкильную группу, имеющую от 7 до около 12 атомов углерода.

J представляет собой аминоконец указанного фрагмента; а H представляет собой защитную группу, которая не затрудняет реакцию присоединения, например бензильную группу.

Затем защитные группы удаляют. Альтернативно, полученный таким образом защищенный пептид может быть использован в последующих реакциях конденсации для получения более крупного пептида.

Этот предпочтительный метод синтеза более подробно описан в заявке на патент США рег. N 559 121, поданной 24 июля 1990 г. под названием "Способ синтеза пептидов", и опубликованной как WO 9201709 ("Pro cess for Synthesizi ng Peptides", John C. Hubbs и S.W. Parker).

В соответствии с другим вариантом своего осуществления настоящее изобретение относится к способу стимулирования высвобождения гормона роста и/или повышения его уровней в крови животного. Этот способ стимуляции высвобождения ГР и/или повышения его уровней в крови может быть использован для терапевтического лечения вышеуказанных заболеваний. Этот способ заключается во введении животному эффективной дозы по крайней мере одного из описанных выше полипептидов. В одном из вариантов осуществления этого способа используются животные за исключением человека.

Соединения настоящего изобретения могут быть введены перорально, парентерально (внутримышечно (I.m.), внутрибрюшинно (i.p.), внутривенно (i.v.), или подкожно (s.c.)), через нос, вагинально, ректально, подъязычно, а также путем внутрилегочной ингаляции в виде лекарственных форм, подходящих для каждого способа введения. При этом предпочтительным путем введения являются парентеральные инъекции.

Твердые лекарственные формы для перорального введения обычно изготавливаются в виде капсул, таблеток, драже, порошков и гранул. Для приготовления таких твердых лекарственных форм активное соединение смешивают по крайней мере с одним инертным носителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Помимо инертных наполнителей указанные лекарственные формы могут содержать замасливающие агенты, такие как стеарат магния. В случае использования капсул, таблеток и драже эти лекарственные препараты могут также содержать буферные агенты. Таблетки и драже могут быть изготовлены с энтеросолюбильным покрытием.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения обычно изготавливаются в виде эмульсий, растворов, суспензий, сиропов и элексиров, содержащих инертные разбавители, которые обычно используются в этих целях, например, такие как вода. Помимо указанных инертных разбавителей, такие композиции могут также содержать адъюванты, например, смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подслащивающие, вкусовые и ароматизирующие вещества.

Препараты настоящего изобретения, предназначенные для парентерального введения, могут быть изготовлены в виде стерильных водных или безводных растворов, суспензий или эмульсий. Примерами безводных растворителей или разбавителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Указанные лекарственные формы могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Они могут быть стерилизованы, например, путем фильтрации через бактериальные фильтры путем введения в композиции стерилизующих агентов, путем облучения этих композиций или путем их нагревания. Указанные препараты могут быть также приготовлены в водной среде или в другой стерильной инъецируемой среде непосредственно перед их использованием.

Новые соединения настоящего изобретения могут быть также введены в комбинации с фактором высвобождения гормона роста (т.е. природным рилизинг-фактором ростового гормона, его аналогом и функциональным эквивалентом), а также в комбинации с другими соединениями, способствующими высвобождению гормона роста, такими как ГР - высвобождающие пептиды (см., патент США N 880 778, который вводится в описание посредством ссылки), например, ингибиторы ацетилхолинэстеразы, - адренергические блокирующие агенты, ²- адренергические блокирующие агенты и т.п. Такие комбинации с ГР - высвобождающими пептидами настоящего изобретения являются особенно предпочтительными, поскольку они стимулируют гораздо большее высвобождение гормона, чем это ожидается при суммировании отдельных ответов для каждого компонента комбинации, то есть, другими словами, эта комбинация продуцирует синергический ответ. Более подробное описание введения комбинации ГР - высвобождающих пептидов приводится в вышеуказанном патенте. Такими синергическими соединениями являются предпочтительно соединения, которые действуют как агонисты фактора ГР - высвобождения в реакции связывания с рецептором, или ингибиторы действия сомастатина. Этот синергизм может быть бинарным, то есть синергическими соединениями являются пептиды настоящего изобретения и одно из указанных других соединений, либо более чем одно из указанных соединений.

Комбинации, способствующие эффективному высвобождению гормона роста и повышение его уровней в крови животного, включая человека, содержат эффективное количество полипептидов, выбранных из полипептидов настоящего изобретения, и по крайней мере одного полипептида, принадлежащего к полипептидам Группы 1 или к полипептидам Группы 2 (т.е. соединениям, стимулирующим высвобождение гормона роста); причем полипептиды Группы 1 выбирают из природных факторов высвобождения ГР и их функциональных эквивалентов, где указанные полипептиды действуют как агонисты фактора ГР - высвобождения в реакции связывания с рецептором млекопитающих и других позвоночных и ракообразных; а полипептиды группы 2 выбирают из любых полипептидов, имеющих следующую структуру: Tyr-DArg-Phe-NH₂; Tyr-DAla-Phe-NH₂; Tyr-DArg (NO₂)-Phe-NH₂; Tyr-DMet (O)-Phe-NH₂; Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂; Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂; Tyr-DThr-Phe-Gly-NH₂; Phe-DArg-Phe-Gly-NH₂; Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂; Tyr-DAla-Gly-Phe-NH₂; Tyr-DArg-Gly-Trp-NH₂; Tyr-DArg(NO₂)-Phe-Gly-NH₂; Tyr-DMet (O)-Phe-Gly-NH₂ (NMe)Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂; Tyr-DArg-Phe-Gly-ol; Tyr-DArg-Gly-(NMe)Phe-NH₂; Tyr-DArg-Phe-Sar-оI Tyr-DAla-Phe-Sar-ol Tyr-DAla-Phe-Gly-Tyr-NH₂; Tyr-DAla-(NMe)Phe-Gly-Met(O)-ol; Tyr-DArg-(NMe)Phe-Gly-Net(O)-ol; Gly-Tyr-DArg-Phe-Gly-NH₂; Tyr-DThr-Gly-Phe-Thz-NH₂; Gly-Tyr-DAla-Phe-Gly-NH₂; Туr-DAla-Phe-Gly-ol; Туr-DAla-Gly-(NMe)Phe-Gly-ol; Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂; Tyr-DAla-Phe-Sar-NH₂; Tyr-DAla-Gly-(NMe)Phe-NH₂; Sar-Tyr-DArg-Phe-Sar-NH₂; Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (циклический дисульфид); Tyr-DCys-Phe-Gly-DCys-NH₂ (свободный дитиол); Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (циклический дисульфид); Tyr-DCys-Gly-Phe-DCys-NH₂ (свободный дитиол); Tyr-DAla-Phe-Gly-Туr-Pro-Ser-NH₂; Tуr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Pro-Ser-NH₂; Туr-DAla-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂; Tyr-DAla-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂; Tyr-DAla-Phe-Sar-Phe-Hyp-Ser-NH₂; Туr-DArg-Phe-Gly-Tyr-Hyp-Ser-NH₂; Туr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Pro-Ser-NH₂; Tyr-DArg-Phe-Sar-Tyr-Hyp-Ser-NH₂; Туr-DArg-Phe-Gly-Туr-Pro-Ser-NH₂; и органические или неорганические аддитивные соли указанных полипептидов Группы 2; при этом вышеуказанную комбинацию вводят в таком отношении ингредиентов, что их совместное действие вызывает синергическое высвобождение гормона роста и увеличени