Рекомбинантное антитело, полинуклеотид (варианты), способ получения тяжелых и/или легких цепей рекомбинантного антитела (варианты)

Рекомбинантное антитело, полинуклеотид (варианты), способ получения тяжелых и/или легких цепей рекомбинантного антитела (варианты)

Реферат

 

Изобретение предназначено для получения реномбинантной ДНК и моноклональных антител, применяемых при изготовлении новых терапевтических средств. Реномбинантное антитело специфически взаимодействует с белком р 55 Тас рецептора Интерлейкина-2 человека (ИЛ-2). Указанное антитело ингибирует связывание ИЛ-2 с рецептором ИЛ-2 на Т-клетках человека и имеет сродство к рецептору ИЛ-2 более 10⁸M^-1. Оно состоит из легких и тяжелых цепей и содержит участки, определяющие комплементарность (CDR_s). Предложены полинуклеотиды, включающие последовательность, кодирующую каркасные участки и участки, определяющие комплементарность связывания с антигеном (CDR_s). Также предложены способы получения тяжелых и/или легких цепей рекомбинантного антитела. Изобретение позволяет получать новые терапевтические средства с использованием неиммуногенных антител. 5 c. и 6 з.п.ф-лы, 10 ил., 1 табл.

Данное изобретение относится, в основном, к комбинации технологий получения рекомбинантной ДНК и моноклонального антитела для получения новых терапевтических средств, в частности, для производства неиммуногенных антител и их использования.

Обоснование изобретения Для млекопитающих иммунный ответ передается двумя типами клеток, специфически взаимодействующих с чужим материалом, т.е. антигенами. Один из типов этих клеток - B-клеток ответственны за производство антител. Второй класс клеток, T-клетки, включает большое разнообразие клеточных подклассов контролирующих in vivo функцию как B-клеток и широкий диапазон других кроветворных клеток, включая T-клетки.

Одним из способов осуществления этого контроля является производство лимфокина известного как интерлейкин-2-/IL-2/, первоначально названного фактором роста T-клеток. Основной функцией IL-2, по-видимому, является стимулирование и поддержка T-клеток. Некоторые иммунологи считают, что IL-2 может быть в центре полного иммунного ответа (см. Farrar, J., et. all. Immunol. Rev., 63:129-166 (1982) (в ссылках).

Для проявления своего биологического действия 1 - 2 взаимодействует со специфическими мембранными рецепторами, обладающими высоким сродством. /Green, IV. , et. all. Progress: n Hematology XIV., E.Brown, Ed. Gune and Statton, New York (1986), at pgs 283 tf/. У человека рецептором IL-2 является сложный многоцепной гликопротеин с одной цепью, известной как Тас-пептид, размером около 55 kD /Leonard:W, et. all., J. Biol. Chem., 260:1872 (1985)) включено в ссылку. Был выделен ген, кодирующий этот протеин и указывающий на пептид, состоящий из 272 аминокислот, включая и сигнальный пептид из 21 аминокислоты /Leonard: W, et. all. , Nature 311: 626 (1989)/. 219 NH₂-терминальные аминокислоты p55 Tac протеина очевидно включают клеточные домены /Leonard W., et. all., Science, 230, 633-639 (1985)/.

В основном, объяснение структуры и функций рецепторов человеческого IL-2 связано с развитием специфически реактивных моноклональных антител. В особенности, одно моноклональное антитело мыши, известное как анти-Тас /Uchiyama, et al., H. Immunol. 126; 1393 (1981)/ показало, что IL-2 рецепторы могут быть обнаружены на T-клетках, также на клетках семейства моноцитов-макрофагов, на клетках Купфера в печени, клетках Лангерхана кожи, и, конечно, активированных T-клетках. Важно, что T-клетки в состоянии покоя, B-клетки или циркулирующие макрофаги, обычно не показывают IL-2-рецептор. /Hennmann, et. al., J Exp. Med., 162; 1111 (1985)/.

Анти-Тас моноклональное антитело также использовали для определения функции лимфоцитов, которая включает взаимодействие с IL-2, и показали, что оно замедляет различные функции T-клеток, включая выработку цитотоксичных и супрессорных T-лимфоцитов в культуре клеток. Также, основываясь на исследованиях с анти-Тас и другими антителами, сейчас связывают ряд заболеваний с неправильным выражением IL-2 рецептора T-клетками, в особенности T-клеточную лейкемию у взрослых.

Недавно показали, что IL-2 является идеальным объектом для новых терапевтических подходов к заболеваниям с участием T-клеток. Было предложено, что антитела, специфические к IL-2 рецептору, такие как анти-Тас моноклокальное антитело, можно использовать как само по себе, так и как иммуноконъюгат /напр. с Рицином A, изотопами и т.п./ для эффективного удаления клеток, несущих IL-2 рецептор. Данные агенты могут, например, теоретически исключить лейкемические клетки, несущие рецептор IL-2, некоторые B-клетки, или активированные T-клетки, участвующие в протекании болезни, но позволяют удерживать зрелые нормальные T-клетки и их предшественников для обеспечения возможности формирования нормального T-клеточного иммунного ответа при необходимости. В общем, большинство других специфических агентов для T-клеток могут существенно разрушать все периферические T-клетки, которые ограничивают терапевтическую эффективность агентов. В общем, использование соответствующих моноклональных антител, специфических для IL-2-рецептора, может иметь терапевтический эффект при автоиммунных заболеваниях, трансплантации органов и любых нежелательных реакциях активированных T-клеток. Действительно, были проведены клинические испытания с использованием, например, анти-Тас антител /см. в основном, Waedman, T., et al., Cancen. Res., 45, 625 (1985) and Waedman, T., Science, 232; 727-732 (1986), обе ссылки включены/.

К сожалению, использование анти-Тас и других нечеловеческих моноклональных антител имеет некоторые недостатки, особенно при повторяющихся терапевтических режимах, как объяснены ниже. Например, моноклональные антитела мыши недостаточно хорошо фиксируют комплемент человека и не обладают другими важными характеристиками функций иммуноглобулина при использовании для человека.

Возможно даже более важно то, что анти-Тас и другие нечеловеческие моноклональные антитела содержат существенные отрезки аминокислотных последовательностей, которые обладают иммуногенностью при введении человеку. Многочисленные исследования показали, что после введения чужого антитела человеку, иммунная реакция, вызываемая у пациента антителом, может быть достаточно сильной, существенно уменьшающей терапевтический эффект применения антител при первоначальном введении. Более того, поскольку увеличивающееся число различных мышиных или других антигенных /к человеку/ моноклональных антител можно ожидать для лечения различных заболеваний в дальнейшем, после первого и второго курса лечения любыми нечеловеческими антителами, последующее лечение даже и другими методами может быть неэффективным или даже опасным само по себе.

В то время, как производство так называемых "химерных антител" (т.е. изменяемых участков мыши, присоединенных к постоянным участкам человека) оказалось успешным, осталась существенной проблема иммуногенности. В общем, производство человеческих иммуноглобулинов, реактивных в IL-2 рецептору человека, было очень сложно при использовании обычных методов производства человеческих моноклональных антител. Аналогично использование технологии рекомбинантной ДНК для получения так называемых "гуманизированных" антител" /см. напр. EPO Publication N 0239400/ приводит к неопределенным результатам, особенно по отношению к непредсказуемой способности к связыванию.

Следовательно, необходимы улучшенные формы человекоподобных иммуноглобулинов, например, такие, которые специфичны для IL-2 рецептора человека, которые существенно неиммуногенны для человека, но которые можно легко и экономично получать методом, пригодным для целей терапии и других потребностей. Данное изобретение удовлетворяет всем этим условиям.

Краткое описание изобретения Данное изобретение предусматривает новые композиции, полезные, например, при лечении расстройств человека, передаваемых T-клетками, композиции, содержащие человекоподобные иммуноглобулины, способные специфически блокировать связывание человеческого IL-2 со своим рецептором и/или способные к связыванию с протеином p55 Tac на человеческих рецепторах IL-2. У иммуноглобулинов может быть две пары комплексов - легкая цепь /тяжелая цепь, обычно, по крайней мере одна пара при этом имеет цепи, включающие участки, определяющие комлементарность для мыши, функционально присоединенные к сегментам, составляющим основу для человека. Например, участки, определяющие комплементарность для мыши, с или без дополнительных изначально существующих аминокислотных остатков, характерных для мыши, можно использовать для получения человекоподобных антител, способных к связыванию с человеческим рецептором IL-2, при уровне сродства более 10⁸ М^-1.

Иммуноглобулины, включающие связывающие участки и другие производные, приведенные здесь, можно легко получать согласно данному изобретению, используя многочисленные методы рекомбинантной ДНК, в основном реализуемые в трансфектных клетках, предварительно сделанных неумирающими, эукариотических клетках, таких как клетки миеломы или гибридомы. Полинуклеотиды, включающие первую последовательность, кодирующую основные участки человеческого иммуноглобулина, и вторую последовательность, кодирующую участки, определяющие желаемую комплементарность иммуноглобулина, можно получить синтетически или соответственно, комбинируя сегменты кДНК и ДНК генома.

Человекоподобные иммуноглобулины можно использовать сами по себе в достаточно чистой форме или в комплексе с цитотоксичным агентом, таким как радионуклид, рибосомальный ингибирующий протеин, или цитотоксичным агентом, активным на поверхности клетки. Все эти соединения будут особенно полезны при лечении расстройств, передаваемых T-клетками. Человекоподобные иммуноглобулины или их комплексы можно приготовить в фармацевтически удобной дозировке, которую можно изменять в зависимости от способа применения.

Данное изобретение также предусматривает новые способы конструирования цепей человекоподобного иммуноглобулина, имеющие один или более участков, отвечающих за комплементарность /CDR'S/ от донорского иммуноглобулина, и основной участок от человеческого иммуноглобулина, предпочтительные способы включают первоначально включение основы или аминокислотных последовательностей изменяемого участка донорского иммуноглобулина в соответствующие последовательности набора цепей человеческого иммуноглобулина и выбор одной наиболее гомологичной последовательности из набора, подобной человеческому иммуноглобулину. Человеческий иммуноглобулин или акцептирующую иммуноглобулиновую последовательность обычно выбирают из набора по крайней мере от 10 до 20 последовательностей цепей иммуноглобулина, и она обычно имеет наибольшую гомологичность к иммуноглобулиновой последовательности донора по сравнению с любой последовательностью в наборе. Основная последовательность человеческого иммуноглобулина обычно гомологична на 65-70% или больше к основным последовательностям донорского иммуноглобулина. Иммуноглобулин донора может быть как с легкой цепью, так и с тяжелой /или с обеими/ и набор человека будет содержать тот же тип цепи. Гуманизированные легкую и тяжелую цепи можно использовать для образования полного гуманизированного иммуноглобулина или антитела, имеющего две пары цепей типа легкая/тяжелая, с (или без) частичными или полными постоянными участками человека или с другими протеинами.

В другом варианте данного изобретения, как в соединении с вышеприведенным способом или отдельно, можно заместить дополнительные аминокислоты в акцепторной цепи иммуноглобулина на аминокислоты, образующие CDR иммуноглобулиновой цепи донора. Более специфично дальнейшее выборочное замещение аминокислоты из основы человека из акцептирующего иммуноглобулина соответствующей аминокислотой из донорского иммуноглобулина, оно может быть выполнено в таком положении на иммуноглобулинах, где: /a/ аминокислота на основном "человеческом" участке акцептирующего иммуноглобулина редко встречается в этом положении и соответствующая аминокислота в донорском иммуноглобулине обычна для этого положения в последовательностях человеческого иммуноглобулина или /b/ аминокислота сразу соседствует с одним из CDR'S или /c/ предсказано, что аминокислота находится в пределах от CDR в трехмерной модели иммуноглобулина и способна взаимодействовать с антигеном или с CDR'S гуманизированного иммуноглобулина.

Гуманизированная цепь иммуноглобулина обычно включает по крайней мере около 3 аминокислот от донорского иммуноглобулина, кроме CDR'S, обычно, по крайней мере одна из которых сразу прилегает как к CDR в донорском иммуноглобулине. Можно конструировать как легкие? так и тяжелые цепи, используя любой или все критерии выбора положения.

При присоединении к интактному антителу гуманизированные легкие и тяжелые цепи по данному изобретению будут существенно неимунногенны у человека и сохранят, в основном, то же сродство к антигену, как и донорский иммуноглобулин /к такому как протеин или другое соединение, содержащее эпитоп/. Эти уровни сродства могут изменяться от примерно 10⁸ M^-1 или выше и могут примерно в четыре раза превышать сродство к антигену донорского иммуноглобулина.

Краткое описание рисунков Фиг. 1. Сравнение последовательностей тяжелой цепи анти-Тас /верхние линии/ и тяжелой цепи Eu /нижние линии/. Использован однобуквенный код для аминокислот. Первая аминокислота на каждой линии пронумерована слева. Одинаковые аминокислоты в двух последовательностях соединены линиями. Три CDR'S подчеркнуты. Другие положения аминокислот, для которых больше использовали анти-Тас аминокислоту, чем Еu аминокислоту, отмечены.

Фиг. 2. Сравнение последовательностей легкой цепи анти-Тас /верхние линии/ и легкой цепи Eu /нижние линии/. Использован однобуквенный код для аминокислот. Первая аминокислота на каждой линии отмечена слева. Идентичные аминокислоты в двух последовательностях соединены линиями. Три CDR'S подчеркнуты. Другие положения аминокислот, для которых больше использовали анти-Тас аминокислоту, чем Eu аминокислоту в гуманизированной тяжелой цепи анти-Тас, отмечены ^*.

Фиг. 3 Нуклеотидная последовательность в гене для гуманизированного изменяемого участка тяжелой цепи анти-Тас гена. Транслируемая аминокислотная последовательность для части гена, кодирующего протеин, показана ниже нуклеодитной последовательности. Нуклеотиды ТCTAGA в начале и конце гена являются XbaI участками. Основная последовательность тяжелой цепи начинается с аминокислоты # 20 Q.

Фиг. 4 Нуклеотидная последовательность в гене для гуманизированного изменяемого участка легкой цепи анти-Тас гена. Транслируемая аминокислотная последовательность для части гена, кодирующего протеин, показана под нуклеодитной последовательностью. Нуклеотиды TCTAGA в начале и конце гена являются XbaI участками. Основная последовательность легкой цепи начинается с аминокислоты # 21D.

Фиг. 5 A. Последовательности из 4 олигонуклеотидов, используемых для синтеза гуманизированного анти-Тас тяжелоцепного гена, напечатаны от 5' до 3'. B. Относительное положение олигонуклеотидов. Стрелки указывают на положение 3' для каждого нуклеотида.

Фиг. 6 A. Последовательности из четырех олигонуклеотидов, используемых для синтеза гуманизированного анти-Тас легкоцепного гена, напечатаны от 5' до 3'. /B/. Относительные положения олигонуклеотидов. Стрелки указывают в направлении 3' для каждого олигонуклеотида. Показано положение участка Hind III при перекрывании JFD 2 и JFD 3.

Фиг. 7 Схематическая диаграмма плазмиды pHu GTACI, используемой для экспрессии гуманизированной анти-Тас тяжелой цепи. Показаны походящие области разрыва, кодирующие участки тяжелой цепи показаны прямоугольниками. Направление считывания с иммуноглобулинового (I_q) промотора стрелкой. E = ген ускоритель тяжелых цепей. Hyg = ген сопротивления гидромициновый.

Фиг. 8 Схематическая диаграмма плазмиды pHuLTAC, используемой для выражения анти-Тас легкой цепи. Показаны подходящие области разрыва, кодирующие участки легкой цепи показаны прямоугольниками. Направление считывания с Iq промотора показано стрелкой.

Фиг. 9 Флуороцитометрия клеток HUT-102 и Jurkut, покрытых анти-Тас антителом или гуманизированным анти-Тас антителом, вместе с соответственно сопряженными с флуоресцином Ig антителом козла анти-мыши или козла анти-человеческим Ig антителом, как отмечено. Прерывистая кривая на каждом графике показывает результат, полученный при исключении первого антитела, а сплошная кривая - результаты включения первого и второго /коньюгированного/ антител, как описано.

Фиг. 10 /A/ Флуороцитометрия клеток HUT-102 окрашенных о-40 нг анти-Тас, как показано, затем бионизированным анти-Тас и затем фикоэритрин-конъюгированным авидином.

/B/ Флуороцитометрия клеток HUT-102, окрашенных указанным антителом, затем бионизированным анти-Тас и затем фикоэритрин-конъюгированным авидином.

Подробное описание изобретения В соответствии с одним из способов по данному изобретению предложены человеко-подобные иммуноглобулины, специфически реагирующие с желаемыми эпитопами, такими как на IL-2 рецепторе на T-клетках человека. Эти иммуноглобулины, имеющие связывающее сродство, по крайней мере около 10⁸ M^-1, предпочтительно 10⁹ M^-1 до 10¹⁰ M^-1 или выше, способные, следовательно, к блокированию связывания IL-2 с рецепторами IL-2 человека. Человекоподобные иммуноглобулины будут иметь человекоподобную основу и могут иметь участки, определяющие комплементарность /CDR'S/ от иммуноглобулинов, обычно, мыши, специфически реагирующих с эпитопом на p55 Тас протеина. Иммуноглобулины по данному изобретению можно экономично получить в больших количествах и они находят применение, например, при лечение заболеваний, передаваемых T-клетками человека, многими способами.

Известно, что структурная единица базового антитела содержит тетрамер. Каждый тетрамер составлен из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом в каждой паре есть одна "легкая" /около 25 к/" и одна "тяжелая"/около 50-70 к/ цепь.

NH₂-терминал каждой цепи начинает изменяемый участок из 100 до 110 или больше аминокислот, первично ответственных за распознавание антигена. COOH терминал каждой цепи определяет постоянный участок, первоначально отвечающий за функцию эффектора.

Легкие цепи классифицируют как каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируют /и подразделяют/ как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Внутри легких и тяжелых цепей изменяемые и постоянные участки присоединены "J" участком, состоящим из 12 или более аминокислот, с тяжелой цепью также включающий "J" участок из 1 или больше аминокислот /см. в осн. Fundamental Immenology, Poul, W, Ed. Chapten 7, pgs. 131-166 Raven, Press, N.Y., (1984)/ включено в ссылки.

Изменяемый участок каждой пары легкой и тяжелой цепи образует связывающий антитело участок. Все цепи имеют одну и ту же общую структуру относительно устойчивых основных участков, соединенных тремя суперизменяющимися участками, также называемыми CDR'S /см. "Seguences of Proteins of Immunological Interest, "Kabat, E., et al., US. Department of Health and Human Services, (1983); and Cholthia and Lesk, J. Mol. Biol., 196; 901-917 (1987) включены/.

CDR'S от двух цепей каждой пары упорядочены основными участками, обуславливая связывание со специфическим эпитопом.

Употребляемый здесь термин "иммуноглобулин" относится к протеину, состоящему из одного или более полипептидов, кодируемых иммуноглобулиновыми генами. Изученные иммуноглобулиновые гены включают каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю гены постоянных участков наряду с огромным количеством генов изменяемых участков. Иммуноглобулины могут существовать в разнообразных формах помимо антител, включая, например, Fv, Fab, F(ab)₂, а также в единичных цепях /см. например, Huston, et al., Proc. Nat., Acad. Sci, 85, 58795883 (1988), and Bird et al, Science, 242; 423-426 (1988) вкл. в ссылки), (см. в осн. Hood et al, "Immunilogy", Benjamin, W.J., 2 nd. ed (1984), and Hunkapillen and Hood, Nature, 323: 15-16 (1988), включены в ссылки).

Химерные антитела - это антитела, чьи легко и тяжело цепные гены были сконцентрированы, обычно путем генной инженерии, из участков иммуноглобулинового гена, принадлежащих к разным образцам, например, изменяемые /V/ участки генов из моноклонального антитела мыши можно присоединить к постоянным сегментам человека /C/, таким как ₁ и ₃. Типичное терапевтическое химерное антитело таким образом является гибридным протеином, состоящим из V или антиген-связывающего домена из человеческого антитела. /напр. A.T.C.C. доп. номер CRL 9688 выделяют анти-Тас химерное антитело/, хотя можно использовать и другие млекопитающие.

Используемый здесь термин "frame work" (основной) участок относится к тем частям вариабельных участков легких и тяжелых цепей иммуноглобулина, которые относительно консервативны /т.е. не такие как CDR'S среди различных иммуноглобулинов в единичных видах, как определил Кабат и др. (см. любую ст. ). Как указано здесь, основной (frame work) участок иммуноглобулина, подобного человеческому, это основной участок, который в каждой существующей цепи включает по крайней мере около 70 или больше аминокислотных остатков, типично от 75 до 85 или больше остатков, идентичных аналогичным в иммуноглобулине человека.

Используемый здесь термин "подобный человеческому" относится к иммуноглобулину, включающему основной участок иммуноглобулина, подобного человеческому и присутствующий в котором любой постоянный (constant) участок, по существу, гомологичен постоянному участку иммуноглобулина человека, т.е. по крайней мере идентичен на 85-90%, предпочтительно на 95%. Так все части человекоподобного иммуноглобулина, за исключением возможно CDR'S, существенно гомоголичны соответственным частям одной или более последовательностей природного иммуноглобулина человека. Например, человекоподобный иммуноглобулин не может включать химерное антитело на основе изменяемого участка мыши /постоянного участка человека/.

В соответствии с другим основным аспектом данного изобретения также включены критерии, по которым ограниченное число аминокислот в основе человекоподобной или гуманизированной иммуноглобулиновой цепи выбирают такими же как аминокислоты в тех же положениях в донорском Ig, а не в акцепторном Ig, для увеличения аффинности антитела, содержащего гуманизированную иммуноглобулиновую цепь.

Данный аспект изобретения частично основан на том, что существуют две причины потери аффинности в ранее известных способах получения гуманизированных антител/ используя в качестве примеров антитела мыши в качестве источника CDR'S/: /1/ При соединении CDR'S мыши с человеческой основой аминокислоты, в основе близкие к CDR'S, становятся человеческими, а не мышиными. Не выдвигая специальной терапии, мы просто считаем, что эти измененные аминокислоты могут слегка искажать CDR'S, т.к. они создают различные электростатические и гидрофобные силы по сравнению донорским антителом мыши и искаженные CDR'S могут не обеспечить такие же эффективные контакты с антигеном, как CDR'S в донорском антителе.

/2/ Наряду с этим, аминокислоты в первоначальном антителе мыши, которые расположены близко к CDR'S, но не являются его частью /т.е. они все еще части основы/, могут контактировать с антигеном, что вносит вклад в аффинность. При гуманизации антитела эти аминокислоты теряются, т.к. все аминокислоты основы делаются человеческими.

Для того, чтобы избежать этого и получить гуманизированные антитела с высокой аффинностью к избранному антигену, в данном изобретении используют следующие 4 критерия для конструирования гуманизированных иммуноглобулинов. Эти критерии можно по одному или при необходимости в сочетании для достижения желаемой аффиности или других характеристик.

Критерий I. Используйте в качестве акцептора основу от особенного иммуноглобулина человека, который обладает необычной гомологичностью к донорскому иммуноглобулину, предназначенному для гуманизирования, или используйте совместную основу от многих человеческих антител. Например, сравнение последовательности тяжело /или легко/ цепного изменяемого участка мыши с тяжело /или легко/ цепными изменяемыми участками человека в банке данных /например, the National Biomedical Rescareh Foundation Protein Indentification Resource/ показывает, что степень гомологичности к различным участкам человека изменяется широко, типично от около 40% до около 60-70%. При выборе в качестве акцептора иммуноглобулина одного из человеческих тяжелых /относительно легких/ цепных изменяемых участков, наиболее гомологичных тяжело /относительно легко/ цепным изменяемым участкам донорского иммуноглобулина, необходимо сменить небольшое число аминокислот при переходе от донорского иммуноглобулина к гуманизированному. Не создавая специальной теории, можно считать, что существует меньший шанс изменения конформации CDR'S при смене аминокислот около них. Более того, точная общая форма гуманизированного антитела, включающая гуманизированную иммуноглобулиновую цепь, может более точно повторить форму донорского антитела, также уменьшая возможность искажения CDR'S.

Обычно выбирают одну из 3-5 наиболее гомологичных тяжелоцепных последовательностей изменяемого региона из набора по крайней мере от 10 до 20 известных тяжелых цепей человека в качестве акцептора для создания тяжелоцепной основы, и аналогично поступают с легкой цепью. Предпочтительно используют один из 1-3 наиболее гомологичных изменяемых участков. Выбранная акцепторная иммуноглобулиновая цепь должна обладать предпочтительно по крайней мере 65% гомологичности в основном участке по отношению к донорскому иммуноглобулину.

Независимо от способа выбора иммуноглобулина можно достичь высокого сродства, избирая небольшое количество аминокислот в основе гуманизированной иммуноглобулиновой цепи, таких же как аминокислоты в тех же положениях в доноре, а не в акцепторе. Следующие критерии определяют, какие аминокислоты можно выбрать таким образом. Предпочтительно можно выбрать большинство или все донорские аминокислоты, находящиеся в данном положении, удовлетворяющем один из данных критериев.

Критерий II. Если аминокислота в основе человеческого акцептора необычна/ т.е. "редкая", то есть встречается в данном положении не чаще, чем в 10% человеческих тяжелоцепных /относительно легких/ последовательностей V участка, находящихся в банке данных /и, если донорская аминокислота в данном положении типична для последовательностей человека/, т.е. "обычна", что в данном случае означает, что она встречается по крайней мере в 25% последовательностей в банке данных/, то скорее следует выбрать донорскую аминокислоту, а не акцепторную. Данный критерий позволяет быть уверенным, что атипичная аминокислота в человеческой основе не разрушит структуру антитела. Более того, замещая необычную аминокислоту на аминокислоту донорского антитела, которая типична для человеческих антител, можно сделать гуманизированное антитело менее иммуногенным.

Критерий III. В положении, непосредственно прилежащим к 3 CDR'S в гуманизированной цепи иммуноглобулина, лучше выбрать донорскую аминокислоту, а не акцепторскую. Эти аминокислоты особенно вероятно взаимодействуют с аминокислотами на CDR'S и выбранные с акцептора искажают донорские CDR'S и уменьшают аффинность. Более того, прилегающие аминокислоты могут непосредственно взаимодействовать с антигеном /Amitet all., Science, 233, 747-753 (1986)/, и выбрать эти аминокислоты от донора может быть желательно для поддержания всех контактов антитела, которые обеспечивают аффинность в исходном антителе.

Критерий IV. Трехмерная модель, типичная для исходного донорского антитела, показывает, что некоторые аминокислоты, находящиеся вне CDR'S тем не менее близки к ним и имеют большую вероятность взаимодействия с аминокислотами в CDR'S через водородную связь, силы Ван/дер-Ваальса, гидрофобное взаимодействие и т.п. В таких положениях лучше выбрать донорскую аминокислоту, а не акцепторную аминокислоту иммуноглобулина. Аминокислоты в соответствии с данным критерием должны иметь атом боковой цепи в пределах от некоторого участка на CDR'S и должны содержать атомы, способные взаимодействовать с атомами CDR способами, указанными выше. Компьютерные программы для создания моделей протеинов, таких как антитела, в основном доступны и хорошо известны специалистам /см.Loen et al. Int.J.Quant.Chem.,Quant.Biol.Symp. 15: 55-56 (1988), Bruccoleni et.al., Nature, 335, 564-568 (1988); Ehothia et.al. , Science, 233: 755-758 (1986) (в кл. в ссылки). Это не является частью изобретения. В самом деле, поскольку у всех антител похожая структура, можно использовать известные структуры антител, которые доступны из банка данных протеинов Brookhaven при необходимости в качестве грубых моделей других антител. Можно использовать коммерчески доступные компьютерные программы для представления данных моделей на мониторе для вычисления расстояния между атомами и для оценки подобия различных аминокислотных взаимодействий /см. Fernin et.al., J.Mol.Graphics.b: 13-27, (1988)/.

Гуманизированные или подобные человеческим антитела имеют по крайней мере три потенциальных преимущества над мышинными или в некоторых случаях химерными антителами при лечении человека: 1. Поскольку в части эффектора оно человеческое, оно может лучше взаимодействовать с другими частями человеческой иммунной системы, например, разрушать клетки мишени более эффективным путем комплементарно-зависимой цитотоксичности /CDC/ или антитело зависимой клеточной цитотоксичности /ADCC/.

2. Иммунная система человека не сможет считать основу или постоянный участок гуманизированного антитела чужеродным, и следовательно, реакция антитела на такое введенное антитело будет слабее, чем по отношению к полностью чужеродному антителу мыши или частично чужеродному химерному антителу.

3. Известно, что у введенных антител мыши в человеческом организме период полураспада намного меньше, чем у нормальных антител /D.Shaw et.al.J.Immunol; 138: 4534-4538(1987)/. Введенные гуманизированные антитела будут, вероятно, иметь время полураспада более близким к настоящим антителам человека, что позволяет перейти к меньшим и менее часто даваемым дозам.

Данное изобретение имеет целью усовершенствованные гуманизированные иммуноглобулины /например, способные к связыванию IL-2 рецептора человека/ по отношению к описанным в EPA N 0239400. Эта заявка, существо которой не перекрывается настоящей заявкой, описывает для некоторых иммуноглобулинов замещение участков CDR'S в легко или тяжелоцепных изменяемых доменах акцептора антитела на аналогичные участки CDR'S/ обычно доступных для растворителя /от антитела другой специфичности. В данной заявке также обслуживается для некоторых иммуноглобулинов возможность только передающих остатков, которые доступны /для растворителя/ с участка связывания антигена, и данные остатки могут очевидно включать некоторые участки основы /в особенности, те остатки, про которые известно, что они участвуют в связывании антигена как описано у Amit et. al. Science 233:747-753 (1986), или возможно остатки, необходимые для межцепного взаимодействия, но для выбора которых в данной заявке дано неудовлетворительное объяснение/. Так, например, предпочтительный вариант осуществления данного изобретения заключается в замещении всех аминокислот CDR, S и основы непосредственно соседствующих /или предпочтительно каждой/ с CDR'S в общем, любой остаток основы, который также способен к контакту с CDR'S, т. е. поддерживает их конформацию /и обычно специфичность связывания их антигена/, специально включен в предпочтительный вариант осуществления данного изобретения, как описано подробно.

Один из аспектов данного изобретения связан с сегментами рекобинантной ДНК, кодирующей тяжело и/или легкоцепные CDR'S/ обычно с другими аминокислотными остатками, как описано выше, иммуноглобулина, способного к связыванию с желаемым эпитопом, таким как на IL-2 рецепторе человека /т.е. с анти-Тас моноклональным антителом/. Сегменты ДНК, кодирующие эти участки, обычно присоединяют к сегментам ДНК, кодирующим соответственные человекоподобные основные участки. Например, предпочтительные последовательности ДНК, которые содержат в коде для полипептидных цепей суперизменяемые участки тяжелых и легких цепей анти-Тас /с человекоподобными основными участками/, показаны на фиг. 3 и 4 соответственно. Из-за дегенерации кодонов и неточных замещений аминокислот другие последовательности ДНК можно легко заместить на эти последовательности, как описано ниже.

Сегменты ДНК обычно далее включают последовательность ДНК, осуществляющую контроль за кодированием, присоединенную к кодирующим последовательностям человекоподобного антитела, включая естественно существующие /ассоциированные/ или гетерологичные участки промотора. Предпочтительно, чтобы последовательностями, осуществляющими контроль за экспрессией, были эукариотические промоторные системы с векторами, способными к трансформации или трансфекции эукариотических клеток хозяина, но можно также использовать контрольные последовательности для прокариотических хозяев. Как только вектор включен в соответствующего хозяина, хозяина поддерживают в условиях, удобных для экспрессии нуклеотидных последовательностей на высоком уровне, и, как предусмотрено, следует сбор и очистка легких цепей, тяжелых цепей, димеров легких/тяжелых цепей или интактных антител, связывающих фрагментов или других форм иммуноглобулинов.

Последовательности ДНК человеческого постоянного региона можно выделить в соответствии с хорошо известными процедурами из многообразия клеток человека, но предварительно сделанных неумирающими B-клеток /см. Kabat, на выбор, и WP87/02671/. Например, гены и последовательности каппа иммуноглобулина постоянного участка и J участка описаны у Heiter et al., Cell. 22:197-207 /1980/, нуклеотидные последовательности гена человеческого иммуноглобулина C I описаны у Ellison et.al., Nucl. Acid.Res., 10: 4071/1982/ обе работы включены в ссылки. CDR'S для получения иммуноглобулинов по данному изобретению могут быть подобным же образом получены из моноклональных антител, способных к связыванию с нужным антигеном /т.е. IL-2-рецептором человека/, и произведены в любом подходящем млекопитающем, включая мышей, крыс, кроликов или других позвоночных, с помощью которых можно получать антитело хорошо известными способами. Подходящий источник клеток для последовательностей ДНК и клеток хозяина для экспрессии и секреции иммуноглобулина можно подобрать из ряда источников таких как American Type Culture Collection /"Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth Edition (1985) Rockvill, Maryland, USA), включены в прилагаемые ссылки.

Кроме человекоподобных иммуноглобулинов, специально описанных здесь, другие "существенно гомологичные" измененные иммуноглобулины могут быть легко сконструированы и произведены с использованием методов рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам. Например, для иммуноглобулинов 1 - 2 рецептора основные /каркасные/ участки могут отличаться от последовательностей на фиг. 3 и 4 на уровне первичной структуры несколькими замещенными аминокислотами, терминальными и промежуточными добавками и исключениями и тому подобным. Более того, ряд различных основных человеческих участков можно использовать отдельно или в комбинации в качестве основы для человекоподобных иммуноглобулинов данного изоберетения. В общем, модификации генов можно легко осуществить, используя большой набор известных способов, таких как направленный мутагенез /см. Gillman., Gene. 8-81-97 /1979/, Roberts, S., et. al., Nature, 328:731-734(1987) обе включены/.

С другой стороны, полипептидные фрагменты, включающие только часть первичной структуры антитела, можно получать и они будут обладать одной или более функциями иммуноглобулина /например, способностью к комплементарной фиксации/. Также, поскольку, как и многие гены, гены, связанные с иммуноглобулином содержат отдельные функциональные участки, каждый из которых имеет одну или больше определенную биологическую активность, гены можно слить с функциональными участками из других генов /например, ферментов, см. U. SS. N 132; 387, filed Dec 15, 1987, вкл. в ссылки/ с образованием слитных протеинов /например, иммунотоксинов/ с новыми свойствами.

Последовательности нуклеиновых кислот по данному изобретению, способные к полной экспрессии желаемых антител подобных человеческим, можно сформировать из разнообразия различных полинуклеотидов /генома, или к ДНА, РНК, синтетических олигонуклеотидов и т.п./ и компонентов /например, V, J. D- и C участков/ и с использованием разнообразных методов. Присоединение соответствующих последовате