Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми

Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми

Реферат

 

Способ предназначен для создания трансгенных растений, устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми, и может быть использован при трансформации тотипотентных протопластов вектором, содержащим структурный ген, кодирующий полипептид кристаллического белка -эндотоксина Bacillus thuringiensis. Перед трансформацией выделяют ткань из незрелых зародышей, культивируют ее до образования особого типа каллуса. Каллус обрабатывают ферментным препаратом для получения тотипотентных протопластов, после трансформации которых из них генерируют фертильные растения. Регенерация растений из клеток протопластов позволяет применить соматическую гибридизацию для получения улучшенных разновидностей Zea mays L. 30 з.п. ф-лы, 4 ил., 6 табл.

Настоящее изобретение относится к способу получения зерновых растений (Zea mays), резистентных к повреждениям, вызываемым насекомыми, которые регенерируют из протопластов или из клеток, происходящих из протопластов Предпосылки изобретения (Часть А) Регенерация растений Zea mays из протопластов Описание регенерации Zea mays из каллюса датируется в основном серединой 70-х годов (например, Green and Phillips, Crop. Se. 15 (1975) 417-421; Harms et al., Z. Pflanzenzuechtg; 77 (1976) 437-352; европейские патентные заявки EP-0160390, Zowe and Smith (2985), EP-0176162, Cheng (1985), EP-0177738, Close (1985)). Были сделаны попытки получить деление и последующую регенерацию растений из протопластов Zea mays в течение более 12 лет (Potrykus et al., Jn. Cell Genetics in Higher Plants, Dudits et al., (eds), Akademiai Kiado, Budapest (1976) 129-140, и приведенные там ссылки, Harm "Maize and Cereal Protoplasts - Facte and Perspectives" Maize for Biological Research, W. F. Sheridan, ed. (1982); Dale in: Protoplasts (1983); Potrykus et al. (eds) Zecture Proceedings, Experientia Supplementum 46, Potrykys et al., eds Birkhauser, Basel (1983) 31-41 и ссылки там). Однако протопласты Zea mays всегда давали рост только в культурах, которые не были способны регенерировать фертильные растения (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet 156 (1977) 347-350; Potrykus et al., Theor. Appl. Genet., 54 (1979) 209-214; Choury and Zurawski, Yheor. Appl. Genet. 59 (1981) 341-344; Vasil, in: Proc 5th Int. Cong, Plant Tissue and Cell Culture, Fujiwara Tokyo (1982) 101-104; Imbric-Milligan and Hodges, Planta, 168 (1986) 395-401; Vasil and Vasil, Theor. Appl. Genet. , 73 (1987) 793-798). Однако ни в одной из этих ссылок не приводится описания процедуры получения протопластов, способных к регенерации фертильных растений.

Способность продуцировать такие протопласты даст возможность генетических манипуляций с этой важной злаковой культурой, с помощью, например, трансформации или слияния протопластов или при использовании протопластов в качестве исходного материала для селекции ценных новых фенотипов.

Хотя был проявлен большой интерес к генетической трансформации Zea mays не имеется описания успешного метода, ин витро, который может привести к регенерированному трансформированному растению, хотя имелись описания трансформации протопласта Zea mays, которая привела к получению нерегенерируемого каллюса (Fromm et al., Nature, 319 (1986) 791-793). Один метод получения трансгенных растений Zea mays может быть найден путем стабильной трансформации протопластов, способных к регенерации целых фертильных растений. Однако не описано способа получения протопластов Zea mays, способных подвергаться дифференциации с возникновением целых фертильных растений.

Эта и другие цели были достигнуты в соответствии с настоящим изобретением при раскрытии способа получения протопластов Zea mays, которые могут делиться с образованием каллюсных колоний. Протопласты могут быть трансформированы, а каллюсы способны к регенерации фертильных растений Zea mays. Способ получения протопластов Zea mays, способных к делению и образованию каллюса, который затем индуцируют для регенерации в целые фертильные растения, требует специального типа каллюса. Такие каллюсы и способы их получения и идентификации описаны здесь далее.

Для начальной клеточной суспензии используют специальный тип каллюса, при субкультивировании, приводят к суспензиям, которые могут быть использованы для изоляции протопластов. Эти протопласты способны к делению и образованию каллюса, который может быть индуцирован на регенерацию растений. Клеточное деление или образование каллюса может быть промотировано некоторыми агентами, такими как O-низший алканоилсалициловая кислота (O-ацетилсалициловая кислота и ее гомологи), регуляторы роста растений или ДМСО, или сочетания этих агентов.

Регенерация растений из клеток, происходящих из протопластов Zea mays в культуре является существенной для применения соматической гибридизации, для получения улучшенных разновидностей Zea mays через сомаклональную вариабельность и для использования генетической инженерии при получении новых растений Zea mays сортов растений, культивированных или инбредных, с новыми фенотипическими признаками.

(Часть B) Инсектицидные растения кукурузы Zea mays Bacillus thuringiensis (здесь далее ) является штаммом бактерий, который продуцирует кристаллический белок, также упоминаемый как дельта-эндотоксин. Технически, этот кристаллический белок является протоксином, который превращается в токсин при проглатывании личинками чешуекрылых жесткокрылых и двукрылых насекомых.

Кристаллический белок является потенциально важным инсектицидом, не обладающим известными вредными воздействиями на людей, других теплокровных, птиц, рыб или насекомых, других чем личинки чешуекрылых, жесткокрылых и двукрылых насекомых. Активность токсина является крайней высокой, так что требуются только нанограммовые количества для успешного уничтожения личинок насекомых. Другие преимущества использования кристаллического белка в качестве инсектицида включает его широкий спектр действия против личинок чешуекрылых, жесткокрылых и двукрылых насекомых, и для таких личинок возникают затруднения развития устойчивости к кристаллическому белку, даже когда кристаллический белок используют в широких масштабах. Указанные личинки являются основной проблемой в сельском и лесном хозяйствах и особенно при выращивании кукурузы.

Кристаллический белок является эффективным в качестве инсектицида, когда его наносят на растения, зараженные личинками чешуекрылых, жесткокрылых или двукрылых насекомых.

До сих пор кристаллический белок (протоксин) выделяют из Bacillus и наносят на растения с помощью стандартных методов, таких как опудривание дустом или распыление. Препараты, содержащие , кристаллический белок, коммерчески используют в качестве биологических инсектицидов. Например, Бастоспейн, выпускаемый Биохем Продактс Лтд., Дипель, выпускаемый Эббот Лабораториз, и Турцид, выпускаемый Сандоз АГ. Тот факт, что продуцирует кристаллический белок только во время споруляции, является значительным недостатком для производства и применения этого биологического инсектицида. Такое ограничение фазы роста, особенно в промышленном процессе, может привести в результате к неудобствам и излишнему времени, требующемуся для производства.

Кроме того, затраты, связанные с указанным производством делает трудным для такого биологического инсектицида эффективную конкуренцию с другими коммерчески доступными продуктами на химической основе, такими как, например, пиретроидные производные.

Другим недостатком в отношении применения токсина является, например, тот факт, что белок обычно остается на поверхности обработанных растений, где он является эффективным только против поверхностью питающихся личинок и где он инактивируется при продолжительном воздействии ультрафиолетового излучения. Такая инактивация может быть по крайней мере одной из причин общей потери персистентности кристаллического белка в окружающей среде. Следовательно, необходимо частое и дорогостоящее нанесение кристаллического белка.

Эти и другие недостатки могут быть устранены за счет введения и экспрессии гена, кодирующего кристаллический белок или белок, обладающий по существу токсичностью по отношению к насекомым кристаллического белка, в растениях.

Настоящее изобретение описывает, как эти недостатки могут быть устранены путем введения и экспрессии гена, кодирующего кристаллический белок или белок, обладающий по существу токсичностью по отношению к насекомым кристаллического белка, в протопластах кукурузы, и регенерации фертильных трансгенных растений кукурузы из трансформированных протопластов и выращивания этих устойчивых к насекомым растений кукурузы.

Используя преимущества генетической инженерии, ген, ответственный за продуцирование полезного полипептида, может быть трансформирован и в донорскую клетку, в которой ген обычно встречается, в клетку хозяина, в которой ген в природе не встречается; Cohen and Boyer, патенты США 4237224 и 4468464. Действительно, имеются немного ограничений для таких переносов. Гены могут быть перенесены между вирусами, бактериями, растениями и животными. В некоторых случаях перенесенный ген является функциональным или может быть сделан функциональным, в клетке хозяина. Когда клетка хозяин является растительной клеткой, целое растение может быть сделано функциональным, в клетке хозяина. Когда клетка хозяин является растительной клеткой, целое растение может быть иногда регенерировано из клетки.

Гены обычно содержат области последовательностей ДНК, включающие промотор и область транскрипции. Область транскрипции обычно содержит 5'-нетранслируемую область, кодирующую последовательность и 3'-нетранслируемую область.

Промотор содержит ДНК последовательность, необходимую для инициирования транскрипции, во время которой транскрибирующая область превращается в мРНК. В эукариотных клетках, полагают, что промотор включает область, распознаваемую РНК полимеразой, и область, которая помещает РНК полимеразу на ДНК для инициирования транскрипции. Эта последняя область упоминается как ТАТА-бокс, который обычно встречается примерно на 30 нуклеотидов выше от сайта инициирования транскрипции.

Область после промотора представляет собой последовательность, которая транскрибирована в мРНК, но не транслируется в полипептид. Эта последовательность состоит из так называемой 5'-нетранслируемой области и, как полагают, содержит последовательности, которые являются ответственными за инициирование транскрипции, такие как сайт связывания рибосом.

Кодирующая область представляет собой последовательность, которая находится сразу ниже 5'-нетранслируемой области в ДНК или соответствующей РНК. Она является кодирующей областью, которая транслируется в полипептиды в соответствии с генетическим кодом. Например, имеет ген с кодирующей последовательностью, которая транслируется в аминокислотную последовательность инсектицидного протоксина кристаллического белка.

Кодирующая область находится ниже последовательности, которая транскрибируется в мРНК, но не транслируется в полипептид. Эта последовательность называется 3'-нетранслируемой областью и как полагают, содержит сигнал, который приводит к окончанию транскрипции, и в эукариотной мРНК, сигнал, который вызывает полиаденилирование нити транскрибированной. Полагают, что полиаденилирование мРНК обладает функциями процессинга и транспортирующей функцией.

Природные гены могут быть перенесены целиком из донорской крови в клетку хозяина. Однако часто является предпочтительным конструировать ген, содержащий желаемую кодирующую последовательность с промотором и, в некоторых случаях, 5'- и 3'-нетранслируемые области, которые не существуют в природе в том же самом гене как кодирующая область. Такие конструкции известны как химерические гены.

Уже описаны методы генетической инженерии для усовершенствованных путей получения кристаллического белка. Например, Schnepf et al., патенты США 4448885 и 4467036, описали плазмиды для продуцирования кристаллического белка в бактериальных штаммах, других чем . Эти методы позволяют продуцировать кристаллический белок, но не устраняют недостатков применения кристаллического белка в качестве коммерческого инсектицида.

Были сделаны предложения клонировать гены токсина непосредственно в растения, чтобы позволить растениям защищать самих себя:, (Klausner A., Biotechnology, 2 (1984) 409 - 413). Adang et al. Европейская заявка на патент EP-0142924 (Агригенетикс) и De Greve H.M.J. et al. EP-0193269 (Плант Генетик Системс Н.В.) заявили способ клонирования генов токсина из Bt в табак. Ни в одной из этих публикаций не приводится примеров трансформации однодольных растений.

Существует необходимость разработки новых способов получения кристаллического белка в клетках растений кукурузы и новых способов контроля личинок насекомых, которые питаются на растениях кукурузы, содержащих кристаллический белок или подобный полипептид, обладающий по существу токсичностью по отношению к насекомым (инсектицидной активностью) кристаллического белка. Под "контролем" как здесь упоминается, понимают или умерщвление личинок или по крайней мере снижение их питания. Кроме того, существует необходимость создания способа защиты растений кукурузы против повреждений, вызываемых паразитами или патогенами, заключающегося в продуцировании количества пестицидного или антипатогенного белка в клетке растения и растении соответственно, это количество является достаточно эффективным для уничтожения или контроля паразита или патогена. Кроме того, существует необходимость в предпочтительном создании способа защиты растений кукурузы против повреждений насекомыми, заключающегося в продуцировании инсектицидно эффективного количества кристаллического белка или белка, обладающего по существу токсичностью против насекомых кристаллического белка, в клетках растений. Далее, существует необходимость в создании способа защиты растений кукурузы от повреждений химическими агентами, такими как, например, гербициды, чтобы такие химикаты могли быть безопасно нанесены на растения кукурузы.

Из уровня техники ко времени создания настоящего изобретения нельзя было предсказать, что зерновые растения (Zea mays), в частности, фертильные растения, могут быть регенерированы из протопластов, из клеток, происходящих из протопластов или каллуса, происходящего из протопластов. Еще менее можно было предположить, что протопласты Zea mays, содержащие стабильную включенную экзогенную ДНК можно регенерировать трансгенные растения, в частности в фертильные трансгенные растения Zea mays.

Объекты настоящего изобретения детально описаны ниже.

Способ получения растений Zea mays L., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми, включающий выделение ткани из незрелых зародышей, культивирование указанной ткани в среде для инициирования каллуса и/или в среде для поддержания пролиферации каллуса, до образования особого типа каллуса, характеризующегося нелипким, гранулярным и рыхлыми структурами и содержащего плотные цитоплазматически, делящиеся клетки, отбор вышеуказанного типа каллуса и последующую обработку его ферментным препаратом для удаления клеточных стенок, сбор, очистку и трансформацию полученных тотипотентных протопластов вектором, содержащим структурный ген, кодирующий полипептид кристаллического белка - эндотоксина Bacillus thuringiensis токсичного по отношению к насекомым, и фланкированного контролирующими транскрипцию последовательностями, содержащими промотор и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые функциональны в зерновых, дальнейший посев трансформированных тотипотентных протопластов на питательную среду для деления и образования клеток, субкультивирование их на среде для регенерации и последующее получение фертильных растений Zea mays L., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми.

Изобретение далее направлено на способ по п. 1, отличающийся тем, что после отбора особого типа каллуса, осуществляют перенос его в жидкую питательную среду для формирования суспензии клеток или клеточных агрегатов, субкультивирование полученной суспензии в течение времени и с частотой, достаточной для поддержания клеток и клеточных агрегатов в жизнеспособном состоянии с последующим отбором и сохранением культур, содержащих агрегаты делящихся клеток с плотной цитоплазмой, которые характеризуются более гладкой поверхностью, чем другие клеточные агрегаты.

На фиг. 1 показан каллюс, который пригоден для использования в начальных эмбриогенных суспензиях Zea mays (увеличение примерно 7X). (Стадия a).

На фиг. 2 показаны плотные цитоплазматические, делящиеся клетки, которые удерживаются в культурах стадий b - d (увеличение примерно 20X).

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность гена эндотоксина Bacillus thuringiensis var. Kurstaki: HD1 На фиг. 4 представлена последовательность полипептида кристаллического белка - эндотоксина B. thuringiensis, кодируемая структурным геном.

Предпочтительная нуклеотидная последовательность, которая колирует кристаллический белок, является такой последовательностью, что показана нуклеотидами 156-3623 в последовательности, или более короткой последовательностью, которая кодирует инсектицидный фрагмент такого кристаллического белка; Geiser et al., Gene, 48 (1986) 109-118.

Определения Zea mays /кукуруза: В настоящем описании или в формуле изобретения эти термины относятся к любому растению или части растения (протопластам, клеткам, тканям, органам, органеллам, эмбрионам, каллюсам, побегам и т.п.), принадлежащего к виду Zea mays. Термины, как использованы здесь, включают сорт, рассу, разновидность, инбредные линии и гибриды Zea mays. Настоящее изобретение включает, но не ограничивается подобными инбредными линиями кукурузы, например Funr 5N984, Funk 5N986, Funk 2717, Funk 211Д, Funk 2N217A, B73, A632, CM105, B37, B84, B14, Vc17, R 186, MS 71, A188, F A91, A641 и W 117. Предпочтительными являются все элитные генотипы (сорта, разновидности, инбредные линии, гибриды и т.д.), включая элитные инбредные линии Funk 5 N 984, Funk 5N 986, Funk 2717, Funk 211Д и Funk 2N217A, более предпочтительная элитная линия инбредная Funk 2717.

BMS: "Черная мексиканская сладкая кукуруза", старый мелкопочаточный сорт кукурузы с темно-голубой окраской околоплодника зерна, придающей зерну "черный" оттенок.

Клетка растения Структурная и физиологическая единица растений, состоящая из протопласта и клеточной стенки.

Термин "клетка растения" относится к любой клетке, которая или является частью или отделена от растения.

Некоторые примеры клеток, охватываемых настоящим изобретением, включают дифференцированные клетки, которые являются частью живого растения; дифференцированные клетки в культуре; недифференцированные клетки в культуре; клетки недифференцированной ткани, такой как каллюс или опухоли, семена, зародыши (эмбрионы); побеги и пыльца.

Ткань растения Группа растительных клеток, организованная в структурную и функциональную единицу. Любая ткань растения в растении или в культуре. Этот термин включает, но не ограничивается целым растением, клетками растений, органами растений, семенами растений, протопластами, культурой клеток и любой группой растительных клеток, организованных в структурные и/или функциональные единицы. Использование этого термина в сочетании с или в отсутствии какого-либо специфического типа растительной ткани, как перечислено выше, или другими словами, охватываемыми настоящим определением, не предназначены для исключения любого другого типа растительной ткани.

Орган растения Отдельная и видимо структурированная и дифференциированная часть растений, такая как корень, ствол, лист, бутон цветка или зародыш. Орган растения может состоять из различных типов клеток растения или тканей растения.

Пропласт Изолированная клетка растения без клеточной стенки.

Трансгенное растение. Растение, имеющее стабильно введенную экзогенную ДНК в своем генетическом материале. Термин включает экзогенную ДНК, которая может быть введена в протопласты в различной форме, включая, например, голую ДНК в кольцевой, линейной или суперспирализованной форме, ДНК, содержащуюся в нуклеосомах, или ядрах или в их частях, ДНК, комплексно связанную или ассоциированную с другими молекулами, ДНК, заключенную в липосомах, сферопластах, клетках или пропластах. На данном уровне техники известны различные способы введения экзогенной ДНК в пропласты и они могут быть использованы для получения трансгенных растений настоящего изобретения.

Культура Пролиферирующая масса клеток в недифференциированном или частично дифференциированном состоянии. Термин "клеточная культура" включает каллюсные культуры, состоящий из массы клеток, растущих на отвержденной культуральной среде, и суспензионные клеточные культуры, растущие в дисперсном состоянии в перемешиваемой жидкой культуральной среде.

Эмбрион (зародыш) Наиболее ранняя стадия развития растения, или происходящая из зиготы (затем называемой половым зародышем), или из эмбриогенной соматической клетки (затем называемой соматическим эмбрионом), со стадиями распознаваемой морфологии, структуры и клеточной организации, включающих клеточную до глобулярной стадии, до стадии семядоли. (Развитие зародыша кукурузы описано, например, у Randolph, L.F., J.Agril. Research, 53 (1936) 881-916; развитие злакового зародыша в общем описано, например, у Brown, W.V., Phytomorphology, 10 (1960) 215-223).

Побег Многоклеточная структура, состоящая из ростка и корня в форме маленького растения.

Химерическая последовательность или химерический ген.

Последовательность ДНК, содержащая по крайней мере две гетерологических части, например, части, происходящую от или имеющую по существу последовательность, гомологичную ранее существующим последовательностям ДНК, которые не ассоциированы на ранее прошедших стадиях. Ранее существовавшие последовательности ДНК могут быть природного или синтетического происхождения.

Кодирующая последовательность ДНК.

Последовательность ДНК, которая при транскрипции и трансляции приводит в результате к образованию клеточного полипептида.

Ген Дискретная хромосомная область, состоящая из регуляторных последовательностей ДНК, ответственных за контроль экспрессии, а именно, трансляцию и транскрипцию, и из колирующей последовательности, которая транскрибируется и транслируется, давая определенный полипептид.

Происходящий из: в контексте этого описания гены, части генов или другие последовательности ДНК, "происходящие из" других источников ДНК, охватывают гены, части генов или другие последовательности ДНК, идентичные или по существу гомологичные материалу источника ДНК.

Фенотипический признак Наблюдаемое свойство, являющееся результатом экспрессии одного или более генов.

Ранее существующая последовательность ДНК.

Последовательность ДНК, которая существует до ее применения, полностью или частично, в продукте или способе согласно настоящему изобретению. Хотя такое предсуществование обычно отражает природное происхождение. Ранее существующие последовательности могут быть природного или синтетического происхождения.

Существенная гомология последовательности Существенная функциональная и/или структурная эквивалентность между последовательностями нуклеотидов или аминокислот. Функциональные и/или структурные различия между последовательностями, имеющими существенную гомологию последовательностей, будут минимальными.

Дикамба 3,6-Дихлор-2-метоксибензойная кислота; MES 2-(N- морфолино) этансульфоновая кислота; 2,4-Д: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Пиклорам: 4-амино-3,6,6-трихлорпиколиновая кислота.

Трис-HCl: альфа, альфа, альфа-трис-(оксиметил)метиламин гидрохлорид; EDTA: 1-этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота; PEG : полиэтиленгликоль.

Агароза: Приготовление и очистка агарозы описаны, например, Guiseley and Renn, ("The Agarose Monograph"; Marine Colloids Division FMC Corp. (1975)). Агароза является одним из компонентов агара. Коммерчески доступный агар обычно состоит из смеси нейтральной агарозы и ионного агаропектина с большим количеством боковых групп. Коммерческую агарозу обычно получают из агара традиционными способами. Обычно некоторое количество боковых цепей остается интактной и определяет физикохимические свойства агарозы, такие как гелеобразование и температура плавления. Низкоплавкая агароза, особенно Sea Plague^R агароза является предпочтительным отверждающим агентом в описанном здесь ниже процессе.

SH среда: Среда Шенка Р.Ю., с сотр.Can. H. Bot., 50(1972) 199-204; без регуляторов роста (SH среда может быть жидкой или отвержденной 0,8% (мас. /объем)агара или 0,5% (мас./объем) GelRite^R) Среду обычно стерилизуют с помощью методик, известных на данном уровне техники, например, путем нагревания или стерилизацией автоклавированием при 121^oC и 15 фунт/дюйм² (1,2 кг/см²) давления в течение примерно 15-20 мин.

MS-среда: Murashige T.and Shoog F., Physiol Plant., 15 (1962) 473 B5-среда: Gambord, O.et al., Exp. Cell Res., 50(1968) 151 N6 среда: Chu et al. Scientia sinica,18 (1975)659.

Состав приведен в табл. 1.

КМ-среда: KaO K. N.et.al., Planta, 126 (1975) 105 - 110. Эта среда может быть жидкой или отвержденной агаром, агарозой или Gel Rite^R и также может быть приготовлена и использована без аскорбиновой кислоты, витамина D и витамина A. Компоненты среды за исключением отверждающего агента обычно стерилизуют фильтрацией через фильтр 0,2 мкм.

Состав использованной среды приведен в табл. 1.

(Макроэлементы и микроэлементы среды соответствуют приведенным в литературе).

Примечания к табл. 1: a: макроэлементы обычно готовят в виде 10х концентрированного раствора для хранения, а макроэлементы в виде 1000х концентрированных растворов для хранения.

b: лимонную, фумаровую и малеиновую кислоты (каждая в конечной концентрации 40 мг/л) и пируват натрия (конечная концентрация 20 мг/л) готовят в виде 100х концентрированных растворов для хранения, устанавливают pH 6,5 с помощью NH₄OH и прибавляют к этой среде.

c: Аденин (0,1 мг/л конечная концентрация) и гуанин, тимин, урацил, гипоксантин и цитозин (конечная концентрация каждого 0,03 мг/л) готовят в виде 1000х концентрированных растворов для хранения, устанавливают pH 6,5, как описано выше, и прибавляют к этой среде.

d: Следующие аминокислоты прибавляют к этой среде, используя 10х растворы для хранения (pH 6,5 с помощью NH₄OH), чтобы получить заданные конечные концентрации: глютамин (5,6 мг/л), аланин, глютаминовую кислоту (каждая 0,6 мг/л), цистеин (0,2 мг/л), аспаргин, аспаргиновую кислоту, цистин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин и валин (каждый 0,1 мг/л).

e: Раствор для хранения витамина обычно готовят 100х концентрированным.

Целлюлоза RS: Целлюлоза RS Якулт Хонша Ко., Лтд., 1.1.19 Хигаши-Шинбаши, Минато-ку, Токио 105, Япония Пектолиаза Y-23: Сейшин фармацетикал Ко, Лтд. 4-13 Коамихо, Нихонбаши, Токио, Япония.

фильтр: Нальге Кол., Отделение Сирбон Корп. Рочестер, Нью-Йорк, 14602, США.

Bgl I[ Рестрикционный фермент Bgl I]; Нью Инглэнд Биолабс, 32 Тозер Роад, Беверли, МА, 01915, США, или любой другой коммерческий поставщик.

Bam HI Рестрикционный фермент Bam HI; Нью Ингленд Биолабс, 32 Тозер Роад, Беверли, МА, 01915, США, или любой другой коммерческий поставщик.

Гидромицин B: цитотоксин, гидромицин B, очищенный; кат. N 400050 Калбиохем Беринг Диагностика, Ла Йолла, СА 92037, США, Группа N 702296.

Голь : ГельРайтГеллан Гум, Скотт Лабораториз Инк., Gel Rite Фискерсвилл, РИ 02823.

Prime Rit randon primer Rit of IBI Random primer Rit: Интернейшнл Биотехнолоджиз Инк., НО Бокс 1565, Нью Хевен, СТ 07606, США (Каталожный N 77800; группа N F 630-01).

контейнер. Маленький этерильный контейнер (примерно 7 х 7 х 10 см) изготовлен из полупрозрачного пластика с полупрозрачной крышкой: используют для выращивания побегов, культур побегов и т. д. Поставщик: Магента Корп., 3800 Н.Милуокси Авеню, Чикаго, ИЛ, 60641, США. Может быть заменен любым подобным стерильным полупрозрачным контейнером (например, стеклянным или пластиковым).

Перевод микроЭнштейнов в люксы мкЕ - люкс 0,1 - 200 - 8 - 16700 0,1 - 100 - 8 - 8350 30 - 90 - 2500 - 7500 10 - 40 - 830 - 3330 \\\ 30 - 80 - 2500 - 6670 Депонирование плазмид в микроорганизмах или в клетках растений В соответствии с настоящим изобретением следующие перечисленные плазмиды (в микроорганизмах) и клетки растений были депонированы в соответствии с требованиями Будапештского договора: (1) Zea mays суспензионная клеточная культура 6-2717 CG Funk 2717 депонирована в Коллекции культур американского типа (АТСС), Рокквилл, США, и имеет АТСС номер хранения 40326 (дата депонирования: 20 мая 1987).

(2) Плазмида pCIB712 (в E. coli штамм MC1061) депонирована в АТСС и имеет АТСС номер хранения 67407 (дата депонирования: 18 мая 1987 г.).

(3) Плазмида pSCHI (в E. coli штамм K12) депонирована в немецкой коллекции микроорганизмов (DMS) в Геттингене, ФРГ, и имеет DMS номер хранения 4129 (дата депонирования: 29 мая 1987 г.).

(4) Плазмида pCIB10 (35 SBt (в E. coli штамм MC1061) депонирована в АТСС и имеет АТСС номер хранения 67329 (дата депонирования: 27 февраля 1987 г.).

(5) Плазмида pE16 (8-C4) в E. coli штамм HB101) депонирована в АТСС и имеет АТСС номер хранения 67420 (дата депонирования: 29 мая 1987 г.).

(6) Плазмида pCIB10 (19 SBt (в E. coli штамм HB 101) депонирована в АТСС и имеет АТСС номер хранения 67330 (дата депонирования: 27 мая 1987 г.).

Детальное описание настоящего изобретения (Часть A) регенерация растений кукурузы Zea mays из протопластов Каллюсы, использованные в настоящем изобретении, могут происходить из любой ткани растений Zea mays. Предпочтительно эта ткань является незрелой тканью, такой как незрелая метелка, незрелый зародыш, базальная часть молодого листа и в принципе любая другая ткань Zea mays, способная образовать каллюс. Особенно полезной тканью является щиток незрелого зародыша Zea mays.

В принципе все генотипы Zea mays (сорта, разновидности, инбредные линии, гибриды и т.п.) являются полезными в настоящем изобретении. Наиболее ценными являются коммерчески интересные генотипы.

Предпочтительными являются все элитные генотипы, особенно все инбредные линии, наиболее предпочтительны элитные инбредные линии. Подходящими инбредными линиями являются, например, Funk 2717, Funk 211D, Funk 2N 217A, B 73, A632, CM105, B37, B84, B14, Mo 17, R 168, MS71, A188, FA91, A641, и W117. Дополнительными примерами полезных генотипов Zea mays являются Funk 5 N 984 и Funk 5N986. Особенно предпочтительными являются элитные инбредные линии Funk 2717, Funk 211D, Funk 5N984 или Funk 2N217A, а наиболее предпочтительным является элитный генотип Funk 2717.

В приведенном ниже описании будет раскрыт способ получения эмбриогенных суспензий Funk 2717, из которых могут быть изолированы протопласты, которые способны регенерироваться в фертильные растения. Должно быть понятно, что могут быть использованы и другие генотипы кукурузы в описанном способе с применением в большинстве случаев рутинных методик, известных специалистам в данной области.

Стадия (a). Образование каллюса.

Выращивают растения Zea mays генотипа Funk 2717 до цветения и образования пыльцы. Незрелые зародыши удаляют из початков и помешают на среду для инициирования. Зародыши обычно имеют длину между 1 и 4 мм, предпочтительно между 1,5 и 3 мм, а более предпочтительно между 2 и 2,5 мм. Среда для инициирования может быть жидкой или отвержденной. Может быть использована любая среда для инициирования, способная индуцировать каллюс. Некоторые подходящие примеры включают, но не ограничиваются теми средами, которые основаны на MS-среде (Murashige T. and SRoog F., Physiol. Plant. 15 (1962) 473), среде N 6 (Chu et al., Scientia Sinica 18, (1975) 659), B5-среде (Gamborg o et al., Exp. Cell. Res. 50 (1968) 151), SH-среде или КМ-среде с соответствующими концентрациями сахаров и регуляторов роста растений. Другие подходящие сочетания описаны в Plant Culture Media "George E.E. et al/ /eds/, Exegetics Ltd, Edington, Westbury, Wiltshire, England /1987/.

Каллюс удаляют из культивированных незрелых зародышей и помещают на поддерживающую среду. Может быть использована любая поддерживающая среда, способная обеспечить пролиферацию каллюса. Некоторые подходящие примеры включают, но не ограничиваются средами, основанным на MS-cреде, N 6 среде, B5-среде или КМ-среде, с соответствующими концентрациями сахаров и регуляторов роста растений. Материал субкультивируют на свежей поддерживающей среде через соответствующий интервал времени, например, каждые 1-120 дней, предпочтительно 3-21 дня, более предпочтительно 5-14 дней. Инициирование и поддерживание может быть осуществлено на свету или в темноте, предпочтительно в темноте. Температура может быть между 0 и 50^oC, предпочтительно между 20 и 32^oC, более предпочтительно между 25 и 28^oC.

Субкультивирование продолжают в тех же самых условиях до тех пор, пока каллюс не будет представлять собой каллюс специального типа. Специальный тип каллюса, пригодного для использования при инициировании суспензий в соответствии с настоящим изобретением, является относительно нелипким, гранулярным и рыхлым. На фиг. 1 представлен каллюс, который пригоден для использования при инициировании эмбриогенных суспензий в соответствии с настоящим изобретением. Пригодный каллюс субкультивируют с соответствующими интервалами времени, например, каждые 1-120 дней, предпочтительно 3-21 дня, более предпочтительно 5-14 дней. Указанный специальный тип каллюса, который способен регенерировать фертильные растения Zea mays и протопласты которого могут быть регенерированы в фертильные растения, может быть изолирован и представляет собой один из предпочтительных вариантов настоящего изобретения.

Стадия (b) - (d) суспензионного культивирования Специальный тип каллюса со стадии (a) помещают на жидкую среду для формирования суспензии клеток и клеточных агрегатов. Некоторые подходящие примеры жидких сред включают, но не ограничиваются средами на основе M-среды, N 6 среды, B5-среды и KM-среды с соответствующими концентрациями сахаров и регуляторов роста растений. Предпочтительной средой является N6 среда.

Культуры субкультивируют с частотой, достаточной для поддержания клеток и клеточных агрегатов в жизнеспособном и пролиферирующем состоянии, например, каждые 1-120 дней, предпочтительно 3-21 дня, более предпочтительно 5-10 дней. Культуры, которые содержат агрегаты из плотных цитоплазматических, делящихся клеток, сохраняют. Культуры с высоким содержанием расширенных клеток, отбрасывают. Количество клеток, которые являются плотно цитоплазматическими, может увеличиваться со временем.

Желательным типом суспензионной культуры является культура, содержащая предпочтительно по крайней мере 50%, а более предпочтительно по крайней мере 70% клеток в агрегатах плотных, цитоплазматических делящихся клеток. Желаемый тип суспензионной культуры получают после подходящего периода времени, обычно после примерно 7 дней, предпочтительно после примерно 30 дней. Температура и световые условия являются такими же, как и в стадии (a). Суспензионная культура депонирована в АТСС, Рокквилл, Мэриленд, США, под номером хранения 40326 (дата депонирования: 20 мая 19687 г.).

Следовательно, в настоящем изобретении описан способ получения суспензионных культур клеток Zea mays и клеточных агрегатов, из которых могут быть изолированы протопласты, причем протопласты способны регенерировать фертильные растения, состоящие из стадий: (a) получение каллюса, который является относительно нелипким, гранулярным и рыхлым, на индукционной и поддерживающей средах.

(b) переноса каллюса на жидкую среду для образования суспензии клеток или клеточных агрегатов.

(c) субкультивирования суспензии (i) в течение периода времени (предпочтительно в течение примерно 7 дней), достаточного для получения протопластов в жизнеспособной, деляющейся стадии, способных к регенерации в фертильные растения, и (ii) с частотой, достаточной для поддержания любых клеток и клеточных агрегатов в жизнеспособном состоянии, и (d) отбора и сохранения тех культур из продукта стадии (c), которые содержат агрегаты из плотных, цитоплазматических, делящихся клеток.

Стадия (e1) - получение протопластов Изоляцию протопластов проводят путем инкубации каллюсов или суспензионной культуры клеток или клеточных агрегатов (полученных в соответствии со стадиями (a) - (d) выше) с фе