Способ селекции генетически трансформированных растительных клеток из популяции клеток

Способ селекции генетически трансформированных растительных клеток из популяции клеток

Реферат

 

Способ селекции может быть использован для выращивания растений. При трансформации растительных клеток вместе со структурной последовательностью вводят последовательность, кодирующую селективный ген. Последовательности выбирают такие которые одновременно индуцировали бы или усиливали положительное воздействие соединения, вводимого в ростовую среду. Это позволяет выделить трансформированные клетки без повреждения нетрансформированных клеток популяции и без совместного введения гена, обеспечивающего устойчивость к антибиотикам или гербицидам, а также увеличить число побегов у трансгенного растения. 15 з.п.ф-пы, 27 табл.

Изобретение относится к способу выделения генетически трансформированных клеток, в которые введена заданная последовательность нуклеотидов, заключающемуся в том, что трансформированные клетки получают избирательные преимущества без разрушения нетрансформированных клеток, а также к новым соединениям, которые используются в указанном способе.

Предпосылки изобретения.

Хорошо известно, что в тех случаях, когда необходимо ввести путем трансформации новый генетический материал в популяцию клеток, успешно трансформируется, т. е. получает новый генетический материал, лишь небольшое количество клеток. Затем генетически трансформированные клетки необходимо идентифицировать с тем, чтобы эти клетки можно было бы отделить от нетрансформированных клеток популяции. Идентификация и отделение трансформированных клеток традиционно осуществляется с помощью метода, получившего название метода "негативной селекции", иными словами, способа отбора, при использовании которого трансформированные клетки способны развиваться и расти, в то время как рост нетрансформированных клеток подавляется или же они даже убиваются веществами, действию которых способны противостоять трансформированные клетки.

Например, в том случае, если популяция растительных клеток подвергается генетической трансформации, отделение трансформированных клеток обычно осуществляется с использованием селективного гена, с помощью которого кодируется устойчивость к действию антибиотиков и гербицидов. Селективный ген, который сам по себе обычно не выполняет никаких полезных функций в генетически трансформированном растении и даже может оказаться нежелательным для данного растения, присоединяется или вводится вместе с геном, который необходимо внедрить в данное растение, так что оба этих гена вносятся в популяцию клеток или, вернее, в некоторые клетки популяции, поскольку практически невозможно трансформировать все или даже большинство клеток. Клетки далее выращивают на среде, которая содержит антибиотик или гербицид, к действию которого генетически трансформированные клетки устойчивы благодаря присутствию селективного гена, что и позволяет идентифицировать трансформированные клетки, поскольку у нетрансформированных клеток, которые не содержат данный ген, обеспечивающий их устойчивость к действию антибиотиков или гербицидов, рост подавляется, либо же они убиваются.

Указанный метод негативной селекция имеет, однако, определенные недостатки, Прежде всего, нетрансформированные клетки могут отмереть вследствие присутствия, в частности, антибиотиков в питательной среде. В результате этого, если популяция клеток представляет собой однородную связанную ткань, появляется вполне определенный риск того, что умрут не только нетрансформированные клетки, но и трансформированные клетки, поскольку отмирание нетрансформированных клеток может привести к прекращению подачи питательных веществ к трансформированным клеткам, или же вследствие того, что поврежденные или отмирающие клетки выделяют токсичные соединения.

Следующим значительным недостатком метода негативной селекции является то, что присутствие постороннего гена, обеспечивающего, например, устойчивость по отношению к антибиотикам, может оказаться нежелательным. Так, например, в правительственных кругах высказываются определенные сомнения относительно того, является ли безопасным введение в растения и микроорганизмы генов, кодирующих устойчивость по отношению к действию антибиотиков. Такие опасения приобретают особое значение в случае используемых в пищу растений или же микроорганизмов, которые не предназначены для использования в изолированной среде (например, микроорганизмы, применяемые в сельском хозяйстве), а также микроорганизмов, которые рассчитаны на использование в изолированной среде, но могут оказаться за ее пределами, Хотя эти опасения, вероятно, являются беспочвенными, они могут привести к появлению правительственных ограничений на использование генов, обеспечивающих устойчивость к действию антибиотиков, например, в растениях, а потому желательно разработать новые метода выделения генетически трансформированных клеток, которые не зависели бы от подобных генов.

Еще одним недостатком метода негативной селекции является то, что растительные клетки или клетки, обработанные токсичными веществами, становятся более восприимчивыми к бактериальной инфекции. Такая проблема возникает, в частности, при использовании Agrobacterium в качестве трансформирующего вектора, поскольку бактерия иногда перерастает обработанные ткани или клетки несмотря на то, что для предотвращения роста бактерий используются антибиотики.

Далее, отделение клеток или тканей с использованием метода негативной селекции требует очень точного времени экспрессии введенного гена по отношению к процессу селекции. Если трансгенные клетки обрабатываются токсичным соединением до экспрессии обезвреживающего гена или до того, как образуется достаточно генных продуктов, чтобы подавить действие токсичного соединения, трансгенные клетки будут убиты вместе с нетрансгенными клетками. Если же селекцию проводят слишком поздно, то отдалению трансгенных клеток или тканей могут воспрепятствовать, например, отростки, образуемые нетрансгенными клетками или тканями.

Указанные выше недостатки устраняются в способе по настоящему изобретению (названном методом "позитивной селекции"), в котором впервые становится возможным идентифицировать и выделить генетически трансформированные клетки без повреждения или уничтожения нетрансформированных клеток популяции и без совместного введения гена, обеспечивающего устойчивость по отношению к антибиотикам или гербицидам. Помимо того, что устраняется необходимость введения генов, обеспечивающих устойчивость к действию антибиотиков и гербицидов, было также показано, что метод позитивной селекции по настоящему изобретению часто гораздо более эффективен, чем традиционный метод негативной селекции. Как указано ниже в примерах, количество трансгенных побегов, выделенных из дисков листьев табака с использованием метода позитивной селекции, например, в 30 раз превышает количество побегов, выделенных с использованием традиционной системы негативной селекции на основе кетамина, а сочетание методов позитивной и негативной селекции позволяет достичь частоты селекции трансгенных отростков, которая в 10 раз превышает значение, которое может быть достигнуто с использованием только метода негативной селекции (см. пример 11). Более того, использование метода позитивной селекции предоставляет то преимущество, что один и тот же ген может использоваться в качестве регистрирующего гена и селективного гена, что приводит к упрощению векторных конструкций, получению более стабильных структур и 100%-ной корреляции между экспрессией регистрирующего и селективного генов. В методе позитивной селекции устраняются также указанные выше проблемы, связанные с точным проведением операций во времени, поскольку совпадения, образующиеся при селекции, будут всегда получаться благодаря экспрессии гена. Таким образом, выбранные соединения будут накапливаться в процессе экспрессии селективного гена, при этом селективный эффект проявляется тогда, когда получено достаточное количество заданного соединения.

Краткое описание изобретения.

Одной из целей настоящего изобретения является способ выделения из популяции клеток генетически трансформированных клеток, в которые введена требуемая последовательность нуклеотидов, в котором в трансформированных клетках заданная последовательность нуклеотидов или последовательность совместно вводимых нуклеотидов привносит или усиливает положительное воздействие соединения или питательного вещества, которым снабжается популяция клеток, что позволяет идентифицировать или отделить трансформированные клетки от нетрансформированных клеток.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения указанный способ осуществляют путем выращивания популяции клеток на среде, содержащей по крайней мере одно неактивное соединение или питательное вещество, которое прямо или косвенно активирует клетки, содержащие введенную совместно последовательность нуклеотидов или требуемую последовательность нуклеотидов, при этом указанное соединение или питательное вещество является неактивным в нетрансформированных клетках или по крайней мере является менее активным в нетрансформированных клетках, чем в трансформированных клетках, так что трансформированные клетки получают избирательные преимущества, благодаря которым их можно выделить из популяции клеток.

В другом варианте реализации настоящего изобретения способ осуществляют путем выращивания популяции клеток на среде, содержащей по крайней мере одно неактивное соединение или питательное вещество, которое становится доступным для трансформированных клеток благодаря экспрессии или транскрипции введенных совместно последовательностей нуклеотидов или заданных последовательностей нуклеотидов, при этом соединение или питательное вещество недоступно или менее доступно для нетрансформированных клеток, чем для трансформированных клеток, так что трансформированные клетки получают избирательные преимущества, благодаря которым их можно выделить из популяции клеток.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия вносимой совместно последовательности нуклеотидов приводит к усилению активности фермента, который содержится эндогенно в популяции клеток, так что активность фермента в трансформированных клетках выше, чем активность фермента в нетрансформированных клетках.

Наконец, в еще одном варианте осуществления настоящего изобретения экспрессия или транскрипция вносимой совместно последовательности нуклеотидов или требуемой последовательности нуклеотидов приводит к блокированию метаболизма соединения, поступающего в популяцию клеток, или блокированию синтеза соединения в трансформированных клетках, что позволяет идентифицировать трансформированные клетки и отделить их от нетрансформированных клеток.

Следующей целью настоящего изобретения являются новые соединения, которые могут использоваться в указанном выше способе.

Эта цель связана с соединением общей формулы (1) где R² является H, CH₃, S-CH₃, SO₂-CH₃, SCH₂-фенил, SH, OH, Cl или группой -S-R¹⁰, -NH-R₁₀ или -O-R¹⁰, где R¹⁰ является -D-глюкопирануронозильной группой (структура которой становится понятной из рабочих примеров) или ее солью или сложноэфирным или амидным производным по карбоксильной группе; R⁶ является бензильной группой, которая может содержать в бензольном кольце такие заместители, как оксигруппа, (C1-C6) алкоксигруппа, атом галогена, (C1-C4) алкильная группа, аминогруппа, трифторметильная группа или группы -O-R¹⁰, -S-R¹⁰ или -NH-R¹⁰, где значение R¹⁰ указано ранее; (C1-C8)алкильной группой или (C2-C8)алкенильной группой, которая может быть замещена от 1 до 3 гидроксильными группами, глюкозилоксигруппой или (C1-C6)алкоксигруппой, фенильной группой и/или группами -O-R¹⁰, -S-R¹⁰ или -NH-R¹⁰, где зачение R¹⁰ указано ранее; этерифицированной (C1-C6)алкильной группой или (C2-C6)алкенильной группой; фурфурильной группой; или циклогексилуреидогруппой, фенилуреидогруппой или толилуреидогруппой; а также (i) R⁷ и Y обозначают половинки связи, которые вместе образуют целую связь, (ii) одна из групп R³ или R⁹ является атомом водорода или группой R¹⁰, значение которой указано ранее, а другая группа обозначает половинку связи, которая вместе с половинкой связи X образует целую связь, или же радикал R⁹ является рибозильной группой, 5'-фосфорибозильной группой, глюкозильной группой или группой -CH₂CH(NH₂)COOH, а радикал R³ обозначает половинку связи, которая вместе с половинкой связи X образует целую связь, и (iii) R⁸ является H, CH₃, S-CH₃, SO₂-CH₃, SCH₂-фенил, SH, OH, Cl или группой -S-R¹⁰, -NH-R¹⁰ или -O-R¹⁰, где значение R¹⁰ указано выше, или (iv) R⁷ является рибозильной группой, 5'-фосфорибозильной группой, глюкозильной группой, R⁸ является атомом водорода, R⁹ и Y являются половинками связи, которые вместе образуют целую связь, а R³ является половинкой связи, которая вместе с половинкой связи X образует целую связь; при условии, что один из радикалов R², R³, R⁶, R⁸ и R⁹ является или содержит - D- глюкопирануронозильную группу, или ее соль, или сложноэфирное или амидное производное по карбоксильной группе.

Следующей целью настоящего изобретения являются дополнительные соединения, которые могут быть использованы в указанном методе. Так, настоящее изобретение относится также к соединению общей формулы (II) где R¹ является группой цис-CH=CH-COOH, ее солью или сложноэфирным производным по карбоксильной группе, или амидным производным группы цис- и/или транс-CH=CH-COOH, а значение R¹⁰ указано выше.

Далее, изобретение относится к генетически трансформированным клеткам, которые выделяются в соответствии с указанным способом, в частности растительным клеткам, а также растениям, потомству и семенам, полученным из таких генетически трансформированных растительных клеток.

Подробное описание изобретения.

Термин "клетки" в контексте настоящего изобретения относится к любому типу клеток, из которых можно идентифицировать и выделить индивидуальные генетически трансформированные клетки, используя способ по настоящему изобретению, включающие растительные клетки, животные клетки и микроорганизмы, такие как бактерии, грибки, дрожжи и т.д. Более того, термин "клетки" охватывает в данном случае также протопласты, т. е. протоплазму клетки, заключенную в мембрану, но не имеющую клеточной стенки. Хотя подразумевается, что общие принципы настоящего изобретения могут быть применены для любых типов клеток, предлагаемый способ особенно полезен для выделения генетически трансформированных растительных клеток.

Термин "популяция клеток" относится к любой группе клеток, которую подвергают генетической трансформации и в которой необходимо идентифицировать те клетки, которые были генетически трансформированы, и отделить генетически трансформированные клетки от нетрансформированных клеток. Популяция может быть, в частности, тканью, органом или их частью, популяцией индивидуальных клеток на подложке, такой как культура клеток микроорганизма, в частности популяция клеток в растворе или суспензии, или организмом в целом например, целым растением.

Термин "селекция" относится к процессу идентификации и/или отделения генетически трансформированных клеток от нетрансформированных клеток с использованием способа, приведенного в данном описании.

Термин "требуемая последовательность нуклиотидов" может относиться к любой последовательности нуклеотидов, которую необходимо внедрить в данную клетку для получения генетически трансформированных клеток. Внедрение последовательности нуклеотидов в растения, микроорганизмы или животных широко распространено и не существует ограничений в последовательностях нуклеотидов, присутствие которых может быть установлено с использованием описываемого метода позитивной селекции. Используя указанный способ, можно установить присутствие заданной последовательности нуклеотидов в генетически трансформированных клетках, избегая указанных выше недостатков, которые присущи традиционным системам негативной селекции.

Тот факт, что последовательность нуклеотидов "вносится совместно" с требуемой последовательностью нуклеотидов означает, что обе последовательности нуклеотидов связаны друг с другом или вносятся вместе таким образом, что присутствие в клетке вносимой совместно последовательности нуклеотидов указывает на то, что заданная последовательность нуклеотидов также внесена в клетку, т. е. если показано, что одна последовательность нуклеотидов внедрена, то вероятность того, что внедрена и вторая последовательность, значительно возрастает.

Обе последовательности нуклеотидов являются обычно, но не обязательно, частью той же самой генетической конструкции и вносятся, например, одним и там же вектором.

Описываемые здесь методы могут также использоваться в том случае, когда вносимая совместно последовательность нуклеотидов и требуемая последовательность нуклеотидов внедряются независимо друг от друга. Это может быть, например, осуществлено при использовании той же самой бактерии для введения обоих генов и включения в клетку сравнительно большого количества копий заданной последовательности нуклеотидов, при этом достаточно велика вероятность того, что клетки, которые отражают присутствие вносимой совместно последовательности нуклеотидов, будут также содержать и отражать заданную последовательность нуклеотидов. Вероятность независимого введения двух или большего количества генов, что приводит к совместной экспрессии генов в одной клетке, обычно считается незначительной, поэтому ожидается, что увеличение частоты селекции, которое достигается в методе позитивной селекции, будет особенно полезно в таких системах.

Поскольку необходимо, чтобы введенные последовательности нуклеотидов проявлялись в трансформированных клетках, то генетическая конструкция, включающая две последовательности нуклеотидов, должна содержать, хотя это и необязательно, регулирующие последовательности, которые способствуют экспрессии нуклеотидных последовательностей; ими, в частности, могут быть промоторы и прерыватели транскрипции. Таким образом, совместно вводимые последовательности нуклеотидов, как правило, должны быть связаны с промотором, который может быть образующим и регулирующим промотором, а требуемая последовательность нуклеотидов также будет связана с образующим и регулирующим промотором.

Как указывалось ранее, данный способ особенно удобен для выделения генетически трансформированных растительных клеток, при этом он позволяет идентифицировать и отделить такие клетки без использования кодирования селективным геном для введения устойчивости к действию антибиотиков или гербицидов. Аналогично традиционным методам негативной селекции предлагаемый метод позитивной селекции может применяться в условиях in vitro. Однако метод позитивной селекции можно применять и в условиях in vivo. Использование метода позитивной селекции в условиях in vivo особенно удобно, например, в случае проведения генетических преобразований по отношению ко всему растению в целом или к отдельным его частям, при котором растение или его части будут состоять как из трансформированных, так и нетрансформированных клеток, поскольку селекция трансформированных клеток достигается без прямого разрушения соседствующих нетрансформированных клеток. Трансформированные клетки получают, таким образом, избирательное "преимущество" по сравнению с нетрансформированными клетками (например, способность давать отростки), однако нетрансформированные клетки не испытывают каких-либо неудобств в том смысле, что они не разрушаются и не убиваются, как это обычно происходит при использовании антибиотиков и гербицидов в методе негативной селекции.

"Неактивным соединением или питательным веществом" может быть любое соединение и питательное вещество в неактивной форме или в форме предшественника, т. е. такое вещество, которое в отсутствие экспрессии совместно вводимой последовательности нуклеотидов существует в биологически практически неактивной форме по отношению к данным клеткам, но которое при экспрессии или транскрипции совместно вводимой последовательности нуклеотидов гидролизуегся или активируется каким-либо иным способом или же участвует в процессах метаболизма, что и обеспечивает получение генетически трансформированными клетками, содержащими требуемую последовательность нуклеотидов, избирательных преимуществ; это и позволяет идентифицировать и отделить такие клетки. Неактивным соединением или питательным веществом может быть, в частности, неактивный регулятор роста, например, дезактивированный цитокинин, ауксин или гибберилин, какой-либо витамин, например, дезактивированный тамин, углевод (например, манноза в том случае, если совместно вводимая последовательность нуклеотидов кодирует манноза-6-фосфатизомеразу, или галактоза или галактозусодержащее соединение в том случае, если совместно вводимая последовательность нуклеотидов кодирует UDP -галактоза-4-эпимеразу), азотсодержащее соединение (в частности, один в том случае, если совместно вводимая последовательность нуклеотидов кодирует метаболизм опина или транспортный фермент), крахмал, белок или какое-либо другое питательное вещество в неактивной форме или соединение, которое играет важную роль в процессе дифференциации и дедифференциации клеток или тканей. Обработку клеток или тканей соединениями, которые привносят зависимость от дополнительно вводимого важного соединения, можно проводить одновременно с введением соответствующих неактивных соединений. Такой путь может быть использован, в частности, в том случае, когда ингибируется синтез стеринов или сапонинов и вносятся неактивные стерины или сапонины. Неактивным соединением, далее, может быть, например, минеральное вещество, которое образует хелатное соединение и, таким образом, становится доступным для генетически трансформированных клеток.

В отличие от традиционного метода негативной селекции, в котором нетрансформированные клетки повреждаются или убиваются под действием присутствующих в субстрате антибиотиков, гербицидов или токсинов, неактивные соединения или питательные вещества, используемые в методе позитивной селекции по настоящему изобретению, не оказывают прямого вредного воздействия на нетрансформированные клетки. Вместо этого трансформированные клетки приобретают физиологические преимущества, которые позволяют идентифицировать и выделить их, в то время как в присутствии неактивного соединения и питательного вещества, используемого в селективных целях, на нетрансформированные клетки не оказывается никакого влияния или же оказывается меньшее воздействие.

Традиционный метод "негативной селекции" характеризуется, таким образом, использованием селективного гена, который снижает негативное воздействие добавленного соединения на трансформированные клетки. Наоборот, термин "позитивная селекция" используется в контексте настоящего изобретения по отношению к селективному гену, который обеспечивает усиление положительного воздействия добавленного соединения на трансформированные клетки.

Соединение, используемое для целей селекции, может также оказывать как положительное, так и отрицательное воздействие. Например, манноза является токсичной для большинства клеток растений, однако в клетках, которые содержат манноза-6-фосфатизомеразу, негативный эффект устраняется, более того, клетка становится способной использовать маннозу в качестве источника углеводов. В этом случав одно соединение и один ген являются компонентами селективной системы, совмещающей как позитивные, так и негативные свойства, однако такие системы, обладающие положительным и отрицательным действием, могут быть созданы с использованием двух или более генов, которые вместе отвечают за подавление отрицательных эффектов соединения и проявление положительного воздействия соединения в трансформированных клетках.

Неактивным соединением или питательным веществом, используемым в методе позитивной селекции, необязательно должно быть соединение или вещество, которое активируется непосредственно пептидом, который кодируется совместно вводимой последовательностью нуклеотидов. Это вещество или соединение может активироваться косвенно, например в том случае, если совместно вводимая последовательность нуклеотидов оказывает косвенное воздействие на неактивное соединение или питательное вещество в генетически трансформированных клетках, а не в нетрансформированных клетках. Так, совместно вводимая последовательность нуклеотидов может быть такой, которая при экспрессии в трансформированных клетках косвенно увеличивает, например, активность фермента, который является эндогенным для данной популяции клеток, что приводит к большей активности фермента и активированию неактивного соединения или питательного вещества в данных генетически трансформированных клетках.

Совместно вводимая последовательность нуклеотидов может, в частности, кодировать пермиазу или другой транспортный фактор, который позволяет рассматриваемому соединению или питательному веществу проходить сквозь мембрану клетки и проникать в трансформированные клетки или пересекать другую мембрану (органеллу), так что "активация" неактивного соединения или питательного вещества в этом случае включает избирательный захват соединения или питательного вещества трансформированными клетками, в то время как захват соединения или питательного вещества нетрансформированными клетками оказывается невозможным или же наблюдается в меньшей степени. Вместо облегчения захвата соединения клеткой совместно вводимая последовательность нуклеотидов может, наоборот, направить свой продукт в отделение, в котором располагается неактивное соединение, например, вне клеточной мембраны или внутри вакуоли или эндоплазматического ретикулума.

Отбор в соответствии с таким подходом достигается тем, что соединение становится доступным для трансформированных клеток, в то время как соединение остается недоступным или менее доступным для нетрансформированных клеток. Рассматриваемое соединение или питательное вещество, которое в таком случае может и не быть "неактивным" в полном значении этого слова (т.е. соединение или питательное вещество может бать таким, активность которого проявляется при попадании в трансформированную клетку без какого-либо дополнительного превращения, в частности, гидролиза внутри клетки), а может быть того же типа, что и рассмотренные выше, единственное отличие состоит в том, что соединение или питательное вещество в таком случае переносится в трансформированную клетку вместо того (или в добавление к тому), чтобы активироваться внутри трансформированных клеток.

Примерами соединений, которые способны оказывать физиологическое воздействие при проникновении через стенку клетки, но которые с трудом захватываются клеткой или отделением клетки, являются сильно гидрофильные или гидрофобные соединения, в частности, соединения, несущие заряд, большие молекулы, такие как полимеры, в частности протеины, пептида, олиго- или полисахариды, в том числе гормоны, фосфорилированные метаболиты, такие как фосфорилированные углеводы, фосфорилированные витамины, фосфорилированные нуклеозиды, в том числе цитокинины, и соединения, которые связаны с углеводами, содержащими карбоновые кислоты, и аминокислотами, в том числе коньюгаты растительных гормонов.

Предполагается далее, что основной способ по настоящему изобретению может быть модифицирован таким образом, что вместо активирования неактивного соединения или питательного вещества в трансформированных клетках, отбор может быть осуществлен путем блокирования синтеза промежуточных продуктов обмена данного соединения в этих клетках. Например, метаболизм цитокинина, прибавленного в субстрат, может быть заблокирован в трансформированных клетках по механизму десенсибилизации. Так, авторы настоящего изобретения обнаружили, что при ингибировании гликосилирования циатина оптимальная концентрация, стимулирующая рост, понижается в 5-100 раз. Путем ингибирования метаболизма циатина становится, таким образом, возможным получить отростки от дисков табачных листьев при концентрации цеатина, которая неспособна стимулировать рост в нетрансформированных дисках листьев с нормальным метаболизмом цеатина. Было показано, что воздействие индолуксусной кислоты (ИУК) может быть усилено в том случае, если ингибируется обмен этого соединения. Так, при частичном подавлении обмена ИУК было обнаружено, что влияние ИУК на образование наростов усиливается в 5-100 раз. Аналогично, ингибирование метаболизма углеводов или полисахаридов может оказать влияние на использование введенных углеводов и обеспечить дополнительные возможности при подобном варианте позитивной селекции.

"Избирательное преимущество", получаемое трансформированными клетками, может быть любым отличием или преимуществом по отношению к нетрансформированным клеткам, которое позволяет легко идентифицировать и отделить трансформированные клетки от нетрансформированных клеток. Обычно это такое отличие или преимущество, которое позволяет идентифицировать трансформированные клетки простыми визуальными средствами, т.е. без использования отдельного анализа для определения наличия гена-маркера.

В том случае, если полилептид, кодируемый совместно вводимой последовательностью нуклеотидов или заданной последовательностью нуклеотидов, непосредственно активирует неактивное соединение или питательное вещество в трансформированных клетках, нетрансформированные клетки могут в некоторых случаях содержать или производить определенное количество данного полипептида. Например, в том случав, если активирующий полилептид является ферментом, нетрансформированные клетки могут обладать определенным количеством природной ферментативной активности, при этом природный фермент имеет тот же тип, что и введенный активирующий фермент. В таких случаях "неактивное соединение или питательное вещество" необязательно должно быть полностью неактивным в трансформированных клетках, поскольку может оказаться достаточным то, что соединение или питательное вещество просто значительно менее активно в нетрансформированных клетках, чем в трансформированных клетках. Другими словами, качественное отличие между трансформированными клетками и нетрансформированными клетками по отношению к процессу активации первоначально неактивного соединения или питательного вещества может в ряде случаев оказаться достаточным для целей селекции. С этой целью могут быть добавлены ингибиторы или субстраты, которые конкурируют с природным ферментом. Особенно удачными оказываются ингибиторы, которые активируется природным ферментом, что приводит к самокатализируемому производству активного ингибитора до такого уровня, при котором действие природного фермента в значительной степени подавляется.

Активирующий полипептид, кодируемый совместно вводимой последовательностью нуклеотидов, не ограничивается каким-либо конкретным полилептидом и может быть любым полипептидом, который является активным, прямо или косвенно, по отношению к определенному соединению или питательному веществу, которое необходимо активировать в генетически трансформированных клетках. Полипептид, в частности, часто является ферментом.

Ферментом, который оказался пригодным для отбора генетически трансформированных растительных клеток, является бета-глюкуронидаза ("GUS"), при этом отбор осуществляют, используя глюкуронидное соединение, включающее регулятор роста растений, которое расщепляется бета-глюкуронидазой, в частности глюкуронид цитокинина (значение которого будет пояснено в примерах). Удивление вызывает тот факт, что отбор генетически трансформированных растительных клеток может быть проведен с использованием гена GUS, поскольку в связи с настоящим изобретением было обнаружено, что высшие растения обладают собственной GUS- активностью. Это наблюдение противоречит тому, что сообщалось ранее. Так в патенте Великобритании 2197653-A заявляется, что высшие растения не обнаруживают сколько-нибудь заметной активности бета-глюкуронидазы и, таким образом, подразумевается, что, поскольку активность GUS не обнаруживается в высших растениях, контроль за экспрессией конструкции изучаемого гена с использованием гена GUS является очевидным. Однако, что поясняется далее (см. примеры), в действительности это не так, и использование гена GUS для контроля за присутствием нужного гена совсем не является простым и очевидным, поскольку высшие растения на самом деле обладают значительной собственной (фоновой) активностью бета-глюкуронидазы.

Так, с целью отбора генетически трансформированных растительных клеток, популяцию клеток можно вырастить в среде или на среде, содержащей глюкуронид цитокинина, который расщепляется в трансформированных клетках бета-глюкуронидазой, выделяя, таким образом, свободный цитокинин и индуцируя образование отростков и/или наростов в трансформированных клетках.

Для целей настоящего изобретения был разработан ряд новых глюкуронидных соединений цитокинина. Получение этих соединений, а также их использование для позитивной селекции генетически трансформированных клеток подробно описывается далее.

В некоторых случаях желательно модифицировать основной метод, который приводится в данном описании, в частности, путем более эффективного отделения или упрощения методики селекции. В том случае, когда неактивным соединением, используемым в процессе позитивной селекции, является соединение, способное расцепляться под действием бета-глюкуронидазы, основной метод может бать модифицирован путем применения различных средств, с целью получения лучших результатов. Одним из этих средств является использование определенных глюкуронидных соединений стеринов, в частности холестерин-бета-D-глюкуронида или бета-ситостерин-бета-D-глюкуронида в сочетании с соединением, ингибирующим синтез стеринов, таким как тридеморф (4-тридецил-2,6-даметилморфолин). В примерах 5 и 6, приводимых далее, описывается использование таких соединений. Мы полагаем, что путем использования ингибиторов синтеза стеринов вместе с глюкуронидами стеринов, которые, за счет гидролиза бета-глюкуронидазой подавляют воздействие ингибитора синтеза стеринов, можно предотвратить в процессе селекции так называемое "перекрестное питание" (т. е. диффузию активированных соединений из клетки, в которой они были активированы, в другую клетку), поскольку стериновые соединения не могут перемещаться из клетки в клетку после того, как произошло отщепление гидрофильного глюкуронидного фрагмента. Таким образом может быть достигнуто более локализованное воздействие. Соответствующие результаты могут бать получены и с большим количеством других глюкуронидов, которые содержат гидрофобный агликон.

Как уже пояснялось, в отличие от того, о чем ранее сообщалось, было обнаружено, что высшие растения на самом деле обладают собственной GUS-активностью. По этой причине большее введение гена GUS в растение необязательно окажется достаточным для достижения необходимой селекции генетически трансформированных клеток, а потому может оказаться необходимым или желательным уменьшить собственную активность бета-глюкуронидазы в популяции клеток. Поскольку вводимая бета-глюкуронидаза может обладать отличными свойствами от свойств собственной глюкуронидазы, то снижение активности какой-либо эндогенной бета-глюкуронидазы может осуществляться различными способами, например, введением в питательную среду соединения, ингибирующего бета-глюкуронидазу, кото